Этот протокол описывает новый метод для исследования формы химической нейростимуляция wholemount крыса сетчатки в пробирке с нейромедиатора глутамата. Химические нейростимуляция является перспективной альтернативой обычных электронейростимуляция нейронов сетчатки для лечения необратимой слепоте, вызванные фоторецепторных дегенеративных заболеваний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методология для Biomimetic химических Neuromodulation сетчатки крыс с нейромедиатора глутамата в пробирке
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фоторецептор дегенеративные заболевания вызывают непоправимый слепоты через прогрессивные потерю фоторецепторных клеток в сетчатке. Сетчатки протезы являются возникающих лечения фоторецепторных дегенеративных заболеваний, которые стремятся восстановить зрение, искусственно стимулируя сохранившихся нейронов сетчатки в надежде вызывая понятную визуального восприятия больных. Текущий сетчатки протезы продемонстрировали успех в деле восстановления ограниченное видение для пациентов с помощью массива электродов для электрически стимулировать сетчатки, но сталкиваются значительные физические барьеры в восстановлении высокая острота, природные зрение пациентам. Химические нейростимуляция, используя родной нейротрансмиттеров является альтернативой электрические стимуляции биоимитирующие и может обойти основные ограничения, связанные с сетчатки протезов с помощью электронейростимуляция. В частности химические нейростимуляция имеет потенциал, чтобы восстановить более естественным зрение с сопоставимым или более visual acuities для пациентов путем инъекций очень небольших количествах нейротрансмиттеров, же естественными агентами связи, используемых сетчатки химические синапсы, гораздо тоньше разрешением, чем текущий электрические протезы. Однако как сравнительно неизученными стимуляции парадигмы, существует нет протокол для достижения химической стимуляция сетчатки в пробирке. Целью этой работы является предоставить подробные рамки для выполнения химической стимуляция сетчатки для следователей, которые желают изучить потенциал химического neuromodulation сетчатки или аналогичных нервных тканей в пробирке. В этой работе мы описываем экспериментальной установки и методологии для выявления сетчатки ганглия клеток (РЦ) Спайк ответов похож на визуальные легкие ответы в одичал тип и фоторецепторных выродились wholemount сетчатки крыс путем инъекций контролируемых объемов нейромедиатора глутамата в субретинальное пространство с помощью micropipettes стекла и пользовательских многопортовые microfluidic устройство. Эта методология и протокол являются достаточно общими, чтобы быть адаптирована для neuromodulation с помощью других нейротрансмиттеров или даже другие нервные ткани.
Введение
Фоторецептор дегенеративных заболеваний, таких как пигментный ретинит и age-related macular вырождения, являются ведущими наследуемые причины потери зрения и в настоящее время неизлечимых1,2. Хотя эти болезни возникают из целого ряда специфических генетических мутаций, фоторецепторных дегенеративные заболевания как группы характеризуются постепенной потери фоторецепторных клеток в сетчатке глаза, которые в конечном итоге приводит к слепоте. Потерю фоторецепторных клеток триггеров широко реконструкции всей сетчатке, но выжившие сетчатки нейронов, в том числе биполярное клетки и РГК, остаются неповрежденными и относительно функциональных даже на продвинутых стадиях фоторецепторных дегенерации3 ,4,5,6,7.
Механизмы и патологии этих заболеваний были хорошо характеризуется3,4,5,6,7 , но эффективным средством лечения остается труднодостижимой. За последние три десятилетия во всем мире Ученые исследовали различные терапевтические процедуры для восстановления зрения тем, кто пострадал с фоторецепторных дегенеративных заболеваний, включая генной терапии8, стволовых клеток лечение9, сетчатки трансплантация10и11,искусственной стимуляции12 сохранившихся нейронов сетчатки. Из них наиболее клинически доступны сетчатки протезы, которые являются искусственные нейростимуляция устройств, которые традиционно использовали массив Электроды электрически стимулировать биполярных клеток или РГК в конкретных моделей с целью Создание искусственных визуального восприятия в11пациентов. Нынешнее поколение электрических протезы, например Argus II13 и14 устройств альфа-IMS, достигли клинический утверждения и предварительные исследования показали, что они могут улучшить качество жизни пациентов путем восстановления мера видения с помощью epiretinal (передней части сетчатки) и subretinal (задней части сетчатки) имплантированных устройств,1516. Исследовательские группы во всем мире работают на продвижении сетчатки протезы за успехи этих первого поколения устройств17,18,19,20 , но столкнулись с трудности, проектирование электрических протез, способный восстановление высокая острота зрения ниже уровня правовой слепоты для пациентов. Недавние исследования показали, что достижение более высоким пространственным разрешением чем включаемые нынешнего поколения на основе электрических протезов является сложной задачей из-за ограничения впрыска заряд, который требует использования большого электродов безопасно стимулировать нейроны сетчатки ценой пространственное разрешение, т.е. острота11,21. Кроме того, электрической стимуляции еще ограниченный, поскольку он обычно стимулирует все близлежащие клетки и поэтому вызывает неестественно и запутанной восприятия больных, главным образом потому, что это по сути противоестественно стимуляции парадигма21. Тем не менее первые успехи электрической стимуляции продемонстрировали, что искусственные нейростимуляция может быть эффективным средством лечения дегенеративных заболеваний фоторецептор. Это позволяет предположить, что даже более эффективным средством лечения может быть достижимыми, стимулируя сетчатки с нейромедиатором химических веществ, природные агенты коммуникации на химические синапсы. Цель метода, представленных в настоящем документе заключается в изучении терапевтические возможности химического стимуляции, который пытается имитировать природные системы синаптической связи между сетчатки нейронов, как альтернатива электрическим стимуляции биоимитирующие для сетчатки протез.
Перевод концепции терапевтической химической стимуляции к химической протез сетчатки опирается на химически активации целевой сетчатки нейронов с небольшим количеством родной нейротрансмиттеров, например глутамата, выпустили через microfluidic устройство состоит из большой массив microports в ответ на визуальной стимуляции. Таким образом химический протез сетчатки по существу бы biomimetic искусственных фоторецепторных слой, который переводит фотонов, естественно достигает сетчатки химические сигналы. Так как эти химические сигналы используют же нейротрансмиттеров, используемых в обычных сетчатки сигнализации и стимулировать сохранившихся сетчатки нейронов выродились сетчатки через же синаптических пути, используемые пути нормальное зрение, результате visual восприятие, достигнуто путем химического протез сетчатки может быть более естественным и понятным по сравнению с одним вызвали через электрические протеза. Кроме того, поскольку microports, через которые выпускаются нейротрансмиттеров могут быть сделаны очень маленькие и выстроились в высокой плотности, в отличие от электродов, потенциальных химических протезов может быть способны достичь больше фокуса стимуляции и выше пространственных разрешение, чем электрические протеза. Таким образом основываясь на эти потенциальные преимущества, химическая протез сетчатки предлагает весьма перспективной альтернативой электрические протезы.
Химические стимуляция сетчатки, однако, сравнительно мало исследована до недавнего времени. В то время как электрическая стимуляция сетчатки хорошо характеризуется течение десятилетий работы в пробирке22,23, в естественных условиях23,24и клинических исследований13 ,14, исследования по химическим стимуляции были ограничены исключительно несколько в vitro работ25,26,27,28. Iezzi и Финлейсон26 и Инайат и др. 27 продемонстрировал epiretinal химических стимуляция сетчатки в пробирке с помощью одного электрода и массив многоэлектродный (MEA), соответственно, для записи глутамата вызывали ответов нейронов сетчатки. Совсем недавно, Рантри и др. 28 продемонстрировал дифференциального стимуляции и выключения сетчатки путей, с помощью глутамата из стороны субретинальное и МПС для записи нейронных ответов от нескольких сайтов на сетчатке.Хотя эти работы предварительно создали возможности химического стимуляции, необходимы дальнейшие исследования расследовать многие аспекты этого подхода, помимо тех, которые пока рассмотрены25,,2627 , 28и тонкой настройки параметров терапевтического стимуляции в моделях животных и in vitro и in vivo до воплощения этой концепции к химической протез сетчатки как обсуждалось выше. Однако в настоящее время существует установившейся методологии для выполнения химической стимуляция сетчатки в литературе и методы, используемые в предыдущих работах не были описаны в таких деталях как бы важное значение для репликативной исследований. Таким образом основания для этого методы бумага является предоставить четкие рамки для проведения в vitro химических стимуляция сетчатки для этих следователей интересует либо репликация наших предыдущих исследований27, 28 или дальнейшего продвижения этой нарождающейся концепции химических нейростимуляция.
Здесь мы показываем метод для проведения в vitro химических стимуляция сетчатки нейронов в wholemount сетчатки крыс одичал тип и фоторецепторных выродились крысы модель, которая тесно имитирует прогрессирование дегенеративных фоторецепторных заболевания в организме человека. В разработке этого метода стимуляции в vitro моделей лежит оценить терапевтический диапазон различных параметров стимуляции и изучения нейронных ответ характеристики, которые было бы невозможно или сложно наблюдать в в VIVO моделей, особенно в ходе первоначального исследования сосредоточены на оценке целесообразности этого подхода. В этой процедуре мы покажем как одного сайта, так и одновременного многосайтовой химических стимуляцию сетчатки путем предоставления небольших количествах 1 мм глутамата вблизи целевой сетчатки нейронов через коммерчески доступных однопортовый стекла micropipettes и пользовательского micromachined microfluidic многопортовые устройства, соответственно. Хотя одного сайта и многосайтовой стимуляцию достичь основной цели расследования терапевтические возможности химических neuromodulation, каждая служит собственный с уникальным преимуществом. Стимуляции одного сайта, который может быть достигнуто с коммерчески доступных предварительно вытащил стекла micropipettes, может использоваться для вставки химических веществ непосредственно в недрах сетчатки на одном сайте и служит для расследования, если наблюдаемый RGC всплеска ставка ответы, которые похожи на визуально вызвала легких ответов можно централизовано вызвали в месте инъекции. С другой стороны, Мульти сайт стимуляции, который требует специально сфабрикованы microfluidic многопортовые устройства, может использоваться для вставки химических веществ пространственно на нескольких сайтах на поверхности сетчатки и служит расследовать как хорошо глутамата вызывали RCG ответ шаблоны соответствуют закономерности инъекции глутамата в шаблон стимуляции исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с принципами, изложенными в руководстве национального исследовательского совета для ухода и использования лабораторных животных. Животных обработки и эвтаназии протоколы были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Иллинойс в Чикаго.
1. Животные модели
- Одичал тип Long-Эванс крысы
- Закупать 24-32 день старого одичал типа с капюшоном длинный Эванс крыс обоего пола, поднятые с ритмом день/ночь стандартная 12 h.
- Темный адаптировать крыса, поместив его в совершенно темной комнате за 1 ч до начала эксперимента.
- S334ter-3 крысы
- Трансгенные альбинос гомозиготных S334ter-3 крыса линию (обоих полов), выражая две копии гена мутант родопсина, с пигментированной одичал тип Лонг-Эванс крыса производить пигментированной гетерозиготных S334ter-3 крысы, которые exhibit фоторецепторных дегенерация Аналогично в прогрессии для человека пигментный ретинит29,30.
- Вырастить гетерозиготных потомство с стандартным 12 h день/ночь ритм и использовать крыс обоего пола для экспериментов следующих возрастов, соответствующий следующие стадии дегенерации фоторецепторных: ранние стадии дегенерации: 14-20 дней; Средней стадии дегенерации: 21-27 дней; Поздней стадии дегенерации: 28-35 дней; Полностью слепых: > 50 дней старых.
- Темный адаптировать крыса, поместив его в совершенно темной комнате за 1 ч до начала эксперимента.
2. Подготовка Эймс решение средних и перфузии системы
Рисунок 1: схема экспериментальной установки. Схема экспериментальной установки для химической стимуляции с помощью стекла микропипеткой (A) и пользовательские многопортовые microfluidic устройство (B). Сетчатки на pMEA и непрерывно увлажненную с свежий, кислородом решение средних Эймс, сверху и снизу, через отверстия pMEA. Сигналы нейронных ответ подобрал электродов pMEA подаются через усилитель МПС в компьютер приобретение данных. Визуальные и химических стимуляции, выполняются с помощью зеленый светодиод и 8-канальный давление форсунки, соответственно, и оба раздражители вызваны стимул выделенный компьютер, который используется также для пипетки через 3-осные точность позиционирования микроманипулятор. Инвертированным микроскопом используется для наблюдения за сетчаткой во время эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: экспериментальная установка. (A) фотография полной экспериментальной установки показаны относительные позиции всех компонентов. МПС усилитель помещен na górze инвертированным микроскопом, который используется для визуально проверить сетчатки и цифровой изображения интерфейс устройства сетчатки с помощью прилагаемой высокоскоростной камеры во время эксперимента. Верхней и нижней перфузии независимо контролируются с помощью системы соленоида контролируемых перфузии. Инъекции, позиции управления и измерения импеданса, выполняются с помощью давления инжектора, микроманипулятор и патч зажим усилителя (оранжевая коробка; показано более подробно в Б), соответственно. Микропипеткой или устройство вставляется в зажим headstage патч для измерения импеданса и монтируется на козловой (обозначается зеленой коробке; показано более подробно в C) для облегчения позиционирования с помощью микроманипулятор. (B) крупный план измерения и контроля документов, используемых в эксперименте: инжектор давление 8-канальный, система управления микроманипулятор, патч зажим усилителя для измерения импеданса и всасывания судно для ликвидации перфузии. (C) крупный портальные системы впрыска, показаны многопортовое устройство сопряжена с пипеткой держателя, патч зажим headstage и микроманипулятор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Настройка перфузии. (A) фотография верхней части усилителя МПС, расположения Топ перфузии и всасывания, а также зеленый индикатор, используемый для визуального светлых стимуляции. (B) крупным планом палаты pMEA перфузии, иллюстрирующие точное расположение Топ перфузии и всасывания, pMEA и электрод сравнения, используемые для измерения импеданса. (C) Микрофотография нижней перфузии плиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Примечание: См. рис. 1, рис. 2и рис
- Отмерьте 900 мл деионизированной воды при комнатной температуре (~ 21 ° C) и поместите в контейнер 1 Л.
- Perfuse воды с 100% CO2 с помощью механизма восходящей.
- Добавление 8,8 г пудры Эймс средних в 1 л воды.
- Промойте Эймс средних контейнер с несколькими миллилитрами деионизированной воды, чтобы удалить все следы порошкового Эймс среднего и добавить 1 Л контейнер.
- Добавьте 1 Л контейнер 25.3 мл раствора бикарбоната натрия (7,5% w/v31).
- Добавить дополнительные воды довести решение окончательное объемом 1 л.
- Далее, perfusing воду с CO2 примерно 5 минут.
- Остановить CO2 перфузии и начать perfusing решение с медико класса газовой смеси 95% O2 и 5% CO2 для по крайней мере 30 минут или до тех пор, пока pH стабилизируется на 7,4.
Примечание: Для целей настоящего Протокола, Эймс среднего хранится при комнатной температуре (~ 21 ° C) на протяжении всего эксперимента, чтобы предотвратить газовыделение, CO2 или O2 , которая может загородить перфузии линии с пузырьками. - Очистите нижней и верхней трубы перфузии наполнения с 70% этанола и затем промыть обе линии 3 раза деионизированной водой. Заполните в нижней строке деионизированной водой и верхней линии с воздухом.
3. Wholemount сетчатки подготовка
Рисунок 4: подготовка диссекции и wholemount сетчатки. (A) фотография нетронутыми наглазник, взяты из фоторецепторных выродились животных. (B) Микрофотография сетчатки с продольными разрезами чтобы расплющить его. (C) после спрямления сетчатки, он помещается на сетке с стороне фоторецептора, связавшись с сеткой и выравнивается в воздухе (вне перфузии среды) для обеспечения там без складок или завернутыми краями. (D) сеть и сетчатки быстро перенести на pMEA со стороны клеток ганглия, связавшись с электродами и немедленно увлажненную с кислородом среда Эймса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: перфорированные многоэлектродный массив. (A) фотография перфорированные многоэлектродный массив, используемый в протоколе. Сетчатки помещается на массиве электрода (обозначается красным прямоугольником, который показан в B подробно) в зале pMEA разрешить постоянное перфузии с кислородом среда Эймса. (B) Микрофотография массива электрода сам иллюстрирующие расположение перфорации между электродами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Примечание: См. рис. 4 и 5
- С помощью ручной красный светодиодный фонарик тусклый красный освещения, усыпить животных через удушение двуокиси углерода, следуют шейки матки вывих или другой выбранный метод, по словам IACUC протоколы.
- Enucleate оба глаза, с помощью #5 щипцы ювелира и место энуклеированные глаза в Петри диаметром 60 мм с приблизительно 3-4 мл раствора свежие, кислородом Эймс средних.
- Хотя наблюдения глаз через рассечение стереомикроскопом с верхней и нижней осветители с красным фильтром экрана, сделать небольшой надрез в роговицы глаза с помощью скальпеля или острыми ножницами.
- Вырезать из этой небольшой разрез до края роговицы, а затем расширить разрез в продольных секции вокруг всего края роговицы. Снимите сейчас отдельностоящий роговицы наряду с объектива, полупрозрачные жизненных начал водный и стекловидного тела.
- Аккуратно придерживая наглазник с одной парой щипцов, тщательно сделайте два небольших разрезов на противоположных сторонах наглазник. Далее используйте две пары щипцами осторожно вытяните врозь наглазник на каждом из разрезов и отделить сетчатки от склеры. Медленно поднимите всю сетчатку от склеры и наглазники. Вырежьте зрительного нерва, если он все еще подключен.
- Сделать продольные разрезы в сетчатке получить половину или четверть секции с помощью ножниц, а затем аккуратно распространилась односекционный сетчатки на нейлоновая сетка (100 мкм резьбы диаметром 350 мкм открытие) с облицовкой (вогнутая сторона сетчатки) клеток ганглия от сетки.
- Поместите сетку и сетчатки на перфорированной многоэлектродный массив (pMEA) с клетках ганглия pMEA поверхности. Затем осторожно поместите сетку взвешенной ломтик поверх сетки держать сетчатки на месте.
4. МПС и Настройка сбора данных
Рисунок 6: шума уровни pMEA. (A) представитель запись подмножества pMEA электродов экспонируется постоянного шума. Этот шум, как правило объясняется отсутствием надлежащего контакта между pMEA контактные колодки и штифты МПС усилителя в результате нормального износа слоя тонкой перфорированные полиимида над pMEA, особенно на контактные колодки. Другим возможным источником шума является обычно решение просочились pMEA усилитель контактные колодки. Постоянный шум из-за плохой контакт контакт и/или утечка раствора на контакты колодки обычно могут быть исправлены путем смены позиции pMEA внутри усилителя для получения лучшего контакта и очистки и сушки колодки, соответственно. Если шум не могут быть устранены путем очистки или смещение позиции pMEA, pMEA может потребоваться заменить полностью. (B) представитель запись уровень шума от подмножество pMEA электродов от чистой pMEA с хороший контакт между pMEA и усилитель. Как правило, уровень Средний шума находится в пределах ±16 мкВ. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Примечание: Смотри Рисунок 6
- При тусклом освещении красный место pMEA в МЭС усилитель и закройте защелки усилитель.
- Если разметка не присутствует на pMEA кольцо камеры, etch два «X»-формы знаков на расстоянии около 5 мм друг от друга в районе легко видно из выше с бум стенд монтируется микроскопа.
- Позиции Топ перфузии розетка в камере pMEA и включите клапан верхней перфузии для достижения перфузии приблизительно 3 мл в минуту. Позиция верхнего всасывания на уровне желаемой perfusate (~ 5 мм в глубину) и убедитесь, что он работает.
- Откройте программное обеспечение сбора данных на компьютере приобретение данных и нажмите кнопку «play», чтобы начать получать данные. Обеспечить, чтобы все каналы pMEA бесшумное и записи нервные сигналы.
- Глядя на живой цифровое изображение с инвертированным микроскопом поле зрения на монитор, наблюдать за нижнюю поверхность pMEA для доказательства того, что решение течет через днище перфузии.
5. глутамата стимуляции подготовка
Рисунок 7: стеклянные микропипеткой и многопортовых microfluidic устройства. (A) пипетки держатель перед вставкой микропипеткой или устройства. Серебро/серебро хлорид электрода (50 мкм в диаметре) электрически сочетании к адаптеру на конце, чтобы интерфейс с headstage зажим патч. (B) фотография стекло микропипеткой сопряжена с пипеткой держатель расположения давления порт, используемый для инициирования пневматические инъекции. (C) пользовательских многопортовые microfluidic устройство (1 см 1 см 0.134 см) придает пользовательских 3D-печати арматуре и сопряжена с держателем пипеткой через трубу из нержавеющей стали. Устройство, которое было изготовлено в два слоя, имеет восемь microports (диаметр 14 мкм) в нижний слой (340 мкм толщиной) и восемь резервуаров на чипе (диаметром 1,6 мм) для хранения глутамата в верхнем слое (толщиной 1 мм). Самостоятельно каждый из восьми microports в нижнем слое устройства подключен к на чипе водохранилище в верхнем слое через in плоскости микроканальные, и каждый на чипе водохранилище в свою очередь подключен к порту давления инжектора 8-канальный давления через Гибкая трубка разрешить независимое срабатывание microports для узорной мультисайтовой инъекции. (D) крупным планом многопортовые устройства, проведенных пинцет перед подсоединением приборов интерфейс труб, показаны расположения восьми независимо адресуемые на чипе водохранилищ и отверстия трубы. (E) Микрофотография нижней поверхности устройства показаны восемь 14 мкм диаметр microports, расположены в конфигурации 3 x 3 с 200 мкм интервал для выравнивания с электродами pMEA. Восемь вне microports используются для многосайтового инъекции, в то время как Центральный порт использовался исключительно для выравнивания во время изготовления устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Примечание: Смотрите Рисунок 7.
- Подготовка глутамата решение путем смешивания запасов глутамата solutionwith кислородом Эймс средних решение для получения образца 0,5 мл на рабочей концентрации 1 мм глутамата.
- Осторожно вставьте предварительно вытащил 10 мкм диаметр микропипеткой или нержавеющей стальной стержень, подключенного к устройству многопортовые microfluidic в стандартной пипетки держатель, содержащий электрода проволока серебро/серебро хлорида 50 мкм в диаметре.
Примечание: Если импеданс обнаружения не доступен, электрод проволока серебро/серебро хлорид может быть пропущена. - Интерфейса держателя пипетку с патч зажим headstage и подключите порт luer давления пипеткой держателя к каналу 1 давления системы впрыска, если использование стекла микропипеткой или давления порт luer соединения каждого 8 инъекций порты с каналы 1-8 of давления системы впрыска, если с помощью многопортовых устройств.
- Вручную Включите давления впрыска и включите канал 1 (или каналы 1-8, если это применимо). Убедитесь, что система вентилируемых атмосферу и установить давление впрыска до 0,1 psi.
- Включите микроманипулятор и калибровки, нажав кнопку «Калибровка» на контроллере манипулятора. Расположите микроманипулятор, так, что кончик микропипеткой (или нижней части устройства, если это применимо) примерно 30 мм выше усилитель МПС.
- Заполните небольшой Петри глутамата раствором (1 мм глутамата в стандартной среде Эймс) и поместите его под микроманипулятор. Ниже кончика микропипеткой (или устройства) в раствор и заполнить, нажав на кнопку «Заполнить» на системе нагнетания давления (давление всасывания -13 H2O) до тех пор, пока в микропипеткой стекло видна примерно в 20 мм раствора или многопортовые устройства труб.
- При использовании многопортовое устройство, включите канал 1 инжектор давление покинуть и повторите протокол для каналов 2-8. Поднимите микропипеткой отзыв или устройства из раствора, удалить Петри блюдо и положение микроманипулятор выше pMEA камеры.
- С помощью бум стенд монтируется стереомикроскопом, совместите кончик микропипеткой или углы устройства с опознавательных знаков, выгравированные на pMEA кольцо камеры. Хранить манипулятор позиции в программное обеспечение управления, используя кнопки «Магазин ссылки A» и «Store ссылка B» (или просто отметить манипулятор координаты вручную) для сопоставления системы координат манипулятора с pMEA электродами.
- С помощью программного обеспечения управления манипулятором, выберите целевой pMEA электрод с надежной спонтанной активности и нажмите кнопку «Переместить канал» для выравнивания стекла micropipettewith целевой электрода.
6. интерфейс с сетчатки
- Если измерение импеданса доступен, включите патч зажим усилителя и инициировать программного обеспечения для визуализации импеданс, нажав кнопку «Пуск» для визуализации импеданс серебро/серебро хлорид электрода внутри держателя пипеткой. Наблюдая сигналы реального времени импеданс, медленно опустите микропипеткой или устройство до тех пор, пока он связывается поверхности сетчатки, как указано на быстрое увеличение сопротивление сигнал (см. рис. 8). Сохраните или сделать к сведению позицию поверхности сетчатки.
- Если измерение импеданса недоступен, обнаружить контакт с поверхностью сетчатки посредством визуального наблюдения, хотя это будет менее точным. Ниже в пипетку или устройство до тех пор, пока он заметно контакты верхней поверхности решение средних Эймс в зале МПС.
- Затем наблюдая верхней части сетчатки с инвертированным микроскопом, медленно опустите пипетки или устройство до тех пор, пока заметно искажено верхней поверхности сетчатки, который указывает, что контакт был достигнут с поверхности сетчатки. Сохраните или сделать к сведению позицию поверхности сетчатки.
- Для подземных стимуляции, ниже пипеткой еще 40 мкм (для S334ter-3 сетчатки) или 70 мкм (для одичал тип сетчатки).
- Выполнить несколько инъекций короткий срок (10-30 мс), с использованием системы давление впрыска (0,1 psi) для определения если клетки вблизи кончик микропипеткой или microports устройства восприимчивы к стимуляции глутамата, наблюдая нервные сигналы с сбора данных программное обеспечение.
Примечание: Успешное инъекции вызовет ясно видны всплеска ставка взрыв или Спайк ингибирование (см. Рисунок 9). Если ответа не наблюдается, переместите микропипеткой или устройства в другой электрод.
Рисунок 8: измерение импеданса. (A) схема метода измерения импеданса. Используя патч зажим усилителя, импеданс микропипеткой непрерывно контролируется как он медленно опустил к поверхности сетчатки. Когда микропипеткой выше сетчатки, относительно высокой ионной проводимости Эймс среды приводит к низким импедансом чтения. Как микропипеткой делает контакт с поверхности сетчатки, ионной проводимости через провод хлорид серебро/серебро снижается, вызывая быстрое увеличение в измеренное сопротивление. (B) отображение изменений импеданса участок зарегистрировано незадолго до и после контакт кончика пипетки с поверхности сетчатки. Измеренное сопротивление является относительно низким, когда кончик микропипеткой в растворе до контакта (обозначается оранжевой региона на левой стороне). После контакта (указывает красная стрелка и зеленый регион справа), сопротивление быстро увеличивается за счет снижения ионной проводимости при контакте с ткани сетчатки. На практике поверхности сетчатки зарегистрирована как высота соответствующего начала крутой подъем измеренное сопротивление (местоположение красной стрелкой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: электрод нейронной активности во время визуального, спонтанное и глутамата инъекции записей. (A) представитель записей из девяти pMEA электродов, показаны ВЧ-отфильтрованных данных электрода во время визуального светлых стимуляции с зеленый светодиод где каждый прямоугольник показывает нейронной данным уникальный электрода. Каждый электрод записи иллюстрирует данные, собранные в первой секунды после поворота на зеленый светодиод (сроки, показано с оранжевые стрелки в каждом сюжете) с общей шкалой напряжения, показано на левой оси y. Колосья были определены с использованием порогового напряжения-18 мкВ (горизонтальная красная линия в каждом сюжете электрод) и представлены черные следы над данными зеленый электрода. Визуальной стимуляции вызвало всплеск шипы (возбуждение) всех электродов за исключением Топ центр, один, который обладал ингибирующее ответ на свет. (B) подобный сюжет для же электродов, спонтанное нейронной активности без стимуляции визуальный или инъекций. Хотя были меньше очередей, образцы колосья были весьма отличаются от тех, кто записан в ответ на визуальной стимуляции. (C) представитель от то же подмножество электродов записи сразу после инъекции глутамата в центральный электрод (сроки обозначается оранжевые стрелки в каждом участке). Вводят глутамата вызвало всплеск спайков в центральный электрод, который был очень похож на визуально вызвала всплеск очередей. Все другие электроды были затронуты глутамата инъекция, которая демонстрирует хорошо пространственным разрешением техники химического стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
7. инициировать сетчатки записи и программа по стимулированию экономики
- Восточный зеленый светодиод к верхней поверхности сетчатки. Начните запись, используя программное обеспечение получения данных на компьютере, посвященный запись, введя имя файла и нажмите кнопку «запись».
- После начала записи, откройте программу управления стимул и загрузить файл стимул по умолчанию, нажав кнопку «Чтение стимул файл». Затем нажмите на кнопку «Запустить файл стимул» начать стимул файл по умолчанию, состоящий из протокола приобретение раздражителей и данных, описанных в примечании ниже.
Примечание: (i) 30 испытания 2 на s и 2 s OFF полного поля flash (5 лм/m2 интенсивности) с помощью зеленый светодиод. (ii) 120 s данных без использования зеленый светодиод для записи спонтанная активность сетчатки на аналогичные сроки. (iii) 1 или более наборов глутамата инъекции, состоящий из 30 испытаний инъекции глутамата на 0,1 psi с ms 10-30 инъекций раз (примерно 100-300 pL на инъекцию) и 3 s interpulse длительности. В случае многосайтовой инъекции выберите 2 или более портов придать одновременно.
Рисунок 10: Peristimulus гистограммы визуальных, спонтанное, и ответы глутамата. (A) представитель peristimulus гистограммы (30 мс binwidth) Спайк данных из подмножества электродов в рис. 9A, в среднем через 20 испытаний визуального светлых стимуляции. Общая шкала ставка Спайк был применен для всех электродов и показано на левой оси y. Черная линия в каждом сюжете электрода представляет средний Спайк ставку для всех шипов, записанный во время первой секунды после включения зеленый светодиод. Как видно, визуальной стимуляции вызвало переходных возбуждающим всплеска темпы ответ на всех электродов за исключением Топ центр электрод, который имели тормозящий переходный к свету. (B) ответы скорость средняя спонтанное Спайк записаны в же электроды без каких-либо визуальных или химические стимуляции. Без стимуляции Спайк тарифы на каждый электрод относительно постоянной. (C) ответы скорость средняя Спайк записаны в же электродов в ответ на глутамата инъекций в месте над центральным электродом. Только переходный очевидным является возбуждающим ответ на электроде непосредственно в месте инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол может использоваться для химически стимулировать нормальный, одичал тип сетчатки, а также фоторецепторных выродились сетчатки, несмотря на существенные сотовой Ремоделирование, вызванные потерей фоторецепторов. До начала экспериментов с либо фоторецепторных выродились или одичал тип сетчатки, записи и стимуляции оборудование (рис. 1 и рис. 2) необходимость быть готовятся и pMEA (рис. 5)...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, представленные здесь, демонстрирует уникальный нейронной стимуляции парадигма, в которой нейроны сетчатки химически стимулируются путем впрыскивать родной нейромедиатора химических веществ в недрах сетчатки в пробирке. Этот метод химического стимуляции предлагает несколько преимуществ над обычной электрической стимуляции техники, в том числе избирательности и высокой фокуса специфичность нейронов целевой. Протокол выше детали как небольшой объем пневматические инъекции нейромедиатора глутамата доставлены ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Работы, представленные в документе был поддержан национального научного фонда, новые рубежи в области научных исследований и инноваций (NSF-EFRI) программа предоставить номер 0938072. Содержание этого документа являются исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NSF. Авторы также хотел бы поблагодарить д-ра Samsoon Инаятом за его работу, проектирование и тестирование начальной экспериментальной установки для химической стимуляции и г-н Ashwin Raghunathan за его работу, проектирования, изготовления и оценки microfluidic многопортовое устройство, используемое в Это исследование.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микроэлектродная матрица, перфорированная компоновка | Многоканальные системы, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| усилитель MEA | Многоканальные системы, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Нижняя перфузионная заземляющая плита для многоканальных систем pMEA | , GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-осевой моторизованный микроманипулятор | Sutter Instruments, Новато, Калифорния | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Система управления микроманипулятором | Sutter Instruments, Новато, Калифорния | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Портальный стиль подставка для микроманипулятора с линейным салазом | Sutter Instruments, Новато, Калифорния | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-канальный программируемый многоканальный инжектор | давления OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Производитель: Harvard Apparatus UK | PM-8000 или PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Производитель: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integration Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния | Axopatch 200A | Axopatch 200A был заменен на более новую модель Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch Clamp головная сцена | Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Набор для вакуумных отходов | ALA Scientific Instruments, Фармингдейл, Нью-Йорк | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Держатель для пипеток | Warner Instruments, Хамден, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Предварительно вытянутый 10 μ m диаметр стеклянных микропипеток | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom стереомикроскоп | Nikon, Токио, Япония | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Микроскоп штанга с двойным линейным шариком несущий кронштейн | Old School Industries, Inc., Даконо, Колорадо | OS1010H-16BB http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm | |
| Zoom Стереомикроскоп с C-светодиодами Гибридная светодиодная стойка | Nikon, Токио, Япония | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Инвертированная микроскопическая система | Nikon, Токио, Япония | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-глутаминовая кислота (глутамат) | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| Чашка Петри 60 мм (высота 10 мм) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | Прозрачная чашка Петри 60 мм; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Щипцы | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Стандартный скальпельный блад #24 | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 500247 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ | |
| Ручка скальпеля #4 | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Нейлоновая сетка Kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Решетка для среза арфы | ALA Scientific Instruments, Фармингдейл, Нью-Йорк | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl электродные гранулы сравнения | многоканальные системы, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4-канальная гравитационная перфузионная система ALA с 4-канальным клапаном | Scientific Instruments, Фармингдейл, Нью-Йорк | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Белфаст, | Великобритания Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μ m диаметр) | Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Трубка для микроотверстий Tygon (диаметр 1,6 мм) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Держатель инструмента для наклона со стальной канюлей | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT По | одному из них было использовано для максимальной перфузии и всасывания; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Производитель: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Производитель: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Красный фонарь Wesson Galaxy | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Производитель: https://www.smith-wesson.com/ Производитель: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Остин, Техас | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Программное обеспечение для фундаментальных исследований | Nikon, Токио, Япония | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
Ссылки
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239(2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009(2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002(2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010(2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505(2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148(2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
