Этот протокол описывает новый метод для исследования формы химической нейростимуляция wholemount крыса сетчатки в пробирке с нейромедиатора глутамата. Химические нейростимуляция является перспективной альтернативой обычных электронейростимуляция нейронов сетчатки для лечения необратимой слепоте, вызванные фоторецепторных дегенеративных заболеваний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методология для Biomimetic химических Neuromodulation сетчатки крыс с нейромедиатора глутамата в пробирке
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фоторецептор дегенеративные заболевания вызывают непоправимый слепоты через прогрессивные потерю фоторецепторных клеток в сетчатке. Сетчатки протезы являются возникающих лечения фоторецепторных дегенеративных заболеваний, которые стремятся восстановить зрение, искусственно стимулируя сохранившихся нейронов сетчатки в надежде вызывая понятную визуального восприятия больных. Текущий сетчатки протезы продемонстрировали успех в деле восстановления ограниченное видение для пациентов с помощью массива электродов для электрически стимулировать сетчатки, но сталкиваются значительные физические барьеры в восстановлении высокая острота, природные зрение пациентам. Химические нейростимуляция, используя родной нейротрансмиттеров является альтернативой электрические стимуляции биоимитирующие и может обойти основные ограничения, связанные с сетчатки протезов с помощью электронейростимуляция. В частности химические нейростимуляция имеет потенциал, чтобы восстановить более естественным зрение с сопоставимым или более visual acuities для пациентов путем инъекций очень небольших количествах нейротрансмиттеров, же естественными агентами связи, используемых сетчатки химические синапсы, гораздо тоньше разрешением, чем текущий электрические протезы. Однако как сравнительно неизученными стимуляции парадигмы, существует нет протокол для достижения химической стимуляция сетчатки в пробирке. Целью этой работы является предоставить подробные рамки для выполнения химической стимуляция сетчатки для следователей, которые желают изучить потенциал химического neuromodulation сетчатки или аналогичных нервных тканей в пробирке. В этой работе мы описываем экспериментальной установки и методологии для выявления сетчатки ганглия клеток (РЦ) Спайк ответов похож на визуальные легкие ответы в одичал тип и фоторецепторных выродились wholemount сетчатки крыс путем инъекций контролируемых объемов нейромедиатора глутамата в субретинальное пространство с помощью micropipettes стекла и пользовательских многопортовые microfluidic устройство. Эта методология и протокол являются достаточно общими, чтобы быть адаптирована для neuromodulation с помощью других нейротрансмиттеров или даже другие нервные ткани.
Введение
Фоторецептор дегенеративных заболеваний, таких как пигментный ретинит и age-related macular вырождения, являются ведущими наследуемые причины потери зрения и в настоящее время неизлечимых1,2. Хотя эти болезни возникают из целого ряда специфических генетических мутаций, фоторецепторных дегенеративные заболевания как группы характеризуются постепенной потери фоторецепторных клеток в сетчатке глаза, которые в конечном итоге приводит к слепоте. Потерю фоторецепторных клеток триггеров широко реконструкции всей сетчатке, но выжившие сетчатки нейронов, в том числе биполярное клетки и РГК, остаются неповрежденными и о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с принципами, изложенными в руководстве национального исследовательского совета для ухода и использования лабораторных животных. Животных обработки и эвтаназии протоколы были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Иллинойс в Чикаго.
1. Животные модели
- Одичал тип Long-Эванс крысы
- Закупать 24-32 день старого одичал типа с капюшоном длинный Эванс крыс обоего пола, поднятые с ритмом день/ночь стандартная 12 h.
- Темный адаптировать крыса, поместив его в совершенно темн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол может использоваться для химически стимулировать нормальный, одичал тип сетчатки, а также фоторецепторных выродились сетчатки, несмотря на существенные сотовой Ремоделирование, вызванные потерей фоторецепторов. До начала экспериментов с либо фоторецепторных выродились или одичал тип сетчатки, записи и стимуляции оборудование (рис. 1 и рис. 2) необходимость быть готовятся и pMEA (рис. 5).......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, представленные здесь, демонстрирует уникальный нейронной стимуляции парадигма, в которой нейроны сетчатки химически стимулируются путем впрыскивать родной нейромедиатора химических веществ в недрах сетчатки в пробирке. Этот метод химического стимуляции предлагает несколько преимуществ над обычной электрической стимуляции техники, в том числе избирательности и высокой фокуса специфичность нейронов целевой. Протокол выше детали как небольшой объем пневматические инъекции нейромедиатора глутамата доставлены .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Работы, представленные в документе был поддержан национального научного фонда, новые рубежи в области научных исследований и инноваций (NSF-EFRI) программа предоставить номер 0938072. Содержание этого документа являются исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NSF. Авторы также хотел бы поблагодарить д-ра Samsoon Инаятом за его работу, проектирование и тестирование начальной экспериментальной установки для химической стимуляции и г-н Ashwin Raghunathan за его работу, проектирования, изготовления и оценки microfluidic многопортовое устройство, используемое в Это исследование.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микроэлектродная матрица, перфорированная компоновка | Многоканальные системы, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| усилитель MEA | Многоканальные системы, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Нижняя перфузионная заземляющая плита для многоканальных систем pMEA | , GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-осевой моторизованный микроманипулятор | Sutter Instruments, Новато, Калифорния | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Система управления микроманипулятором | Sutter Instruments, Новато, Калифорния | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Портальный стиль подставка для микроманипулятора с линейным салазом | Sutter Instruments, Новато, Калифорния | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-канальный программируемый многоканальный инжектор | давления OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Производитель: Harvard Apparatus UK | PM-8000 или PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Производитель: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integration Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния | Axopatch 200A | Axopatch 200A был заменен на более новую модель Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch Clamp головная сцена | Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Набор для вакуумных отходов | ALA Scientific Instruments, Фармингдейл, Нью-Йорк | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Держатель для пипеток | Warner Instruments, Хамден, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Предварительно вытянутый 10 μ m диаметр стеклянных микропипеток | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom стереомикроскоп | Nikon, Токио, Япония | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Микроскоп штанга с двойным линейным шариком несущий кронштейн | Old School Industries, Inc., Даконо, Колорадо | OS1010H-16BB http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm | |
| Zoom Стереомикроскоп с C-светодиодами Гибридная светодиодная стойка | Nikon, Токио, Япония | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Инвертированная микроскопическая система | Nikon, Токио, Япония | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-глутаминовая кислота (глутамат) | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| Чашка Петри 60 мм (высота 10 мм) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | Прозрачная чашка Петри 60 мм; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Щипцы | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Стандартный скальпельный блад #24 | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 500247 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ | |
| Ручка скальпеля #4 | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Сарасота, Флорида | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Нейлоновая сетка Kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Решетка для среза арфы | ALA Scientific Instruments, Фармингдейл, Нью-Йорк | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl электродные гранулы сравнения | многоканальные системы, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4-канальная гравитационная перфузионная система ALA с 4-канальным клапаном | Scientific Instruments, Фармингдейл, Нью-Йорк | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Белфаст, | Великобритания Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μ m диаметр) | Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Трубка для микроотверстий Tygon (диаметр 1,6 мм) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Держатель инструмента для наклона со стальной канюлей | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT По | одному из них было использовано для максимальной перфузии и всасывания; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Производитель: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Производитель: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Красный фонарь Wesson Galaxy | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Производитель: https://www.smith-wesson.com/ Производитель: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Остин, Техас | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Программное обеспечение для фундаментальных исследований | Nikon, Токио, Япония | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
Ссылки
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Ge....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
