Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание внеклеточного кислой рН культуры системы

15.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56660

⸱

19 ноября 2017 г.

 , 
1Innovative Technology Laboratories, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, 2Laboratory for Systems Biology and Medicine, RCAST, The University of Tokyo

В этой статье

Краткое содержание

Кислотные опухоли микроокружения играет важнейшую роль в прогрессии опухоли. Для оценки воздействия кислой рН внеклеточной на раковых клеток в пробирке, мы создали простые кислотные культуры системы.

Аннотация

Условия микроокружения опухоли, например гипоксии или питательных голода, играют важную роль в прогрессии рака и злокачественности. Однако роль кислой внеклеточного pH в агрессивность опухоли и ее основной механизм не изучено широко по сравнению с гипоксической или питательных голода условий. Кроме того, четко определенной культуры метод, чтобы имитировать микроокружения кислой внеклеточного опухоль полностью не сообщалось.

Здесь мы представляем простой в vitro метод культуры для поддержания с использованием кислой рН внеклеточной сокращен бикарбоната и повышение лактата или концентрации HCl в среде культуры. Средний рН поддерживается в течение не менее 24 ч и постепенно снизился на 72 ч после культуры PANC-1 и AsPC-1 поджелудочных клеток рака. Три отдельных кислотных средств массовой информации условия в этом исследовании высоко upregulated рН отзывчивым генов, например, MSMO1, INSIG1и IDI1 по сравнению с гипоксией или питательных голода. Upregulation этих генов может использоваться в качестве маркера кислой рН. Эти простые методы полезны для выяснения основных механизмов злокачественности опухоли под кислых опухоли микроокружения. Таким образом наша система культуры внеклеточного кислой рН позволяет открытие клеточного кислой рН ответы не только в раковых клетках, но и в Главные ячейки, например почечной трубчатых клетки, по отношению к другим кислой расстройств включая, диабетический кетоацидоз, молочно-кислый ацидоз, почечный ацидоз трубчатых и респираторный ацидоз.

Введение

Микроокружения опухоли играет важную роль в прогрессии опухоли и раковых клеток метаболизм1,2,3. Раковые клетки часто подвергаются в условиях гипоксии, питательных лишения и кислой рН внеклеточной (pHe). Однако, как подробно не выяснены роль ПТО в прогрессии опухоли как гипоксия или питательных голода. Пластинчатые теплообменники в опухолевой ткани может стать кислой, достигнув около рН 6,84,5. Кислой рН возникает от аэробных и анаэробных гликолитических экскреции протонов (H+) и лактат пролиферирующих рак клеток5,6.

Недавние исследования показали, что кислотные pHe индуцированной гистона диацетилморфина, окислении жирных кислот и экзоцитоз кислой лизосомы для адаптации к тяжелой кислой среде7,8,9,10. Однако механизмы, через который внеклеточного подкисления влияет на поведение рака и идентификации ключевых регуляторов в кислой рН микроокружения опухоли не были полностью определены. Кроме того несколько докладов описал различные средства массовой информации кислой рН, используя неясным концентрации бикарбоната, трис, трубы и HEPES буфер или лактата и HCl, но есть несколько сообщений, чтобы продемонстрировать стабильность скорректированного среднего ни всеобъемлющим Сравнение нескольких отдельных кислой культуры media7,8,9,10

Для выяснения ключевых регуляторов и метаболические изменения в раковых клетках в контексте внеклеточного подкисления, мы создана модель простой в vitro культуры для поддержания кислой pHe и проанализирована роль ПТО в раковых клетках11. С помощью этого метода, мы сохранили кислой среде культуры с pHe 6.8 при 37 ° C под 5% CO2, используя снижение бикарбонат концентрации в среде культуры. рН 7,4 был использован как нормальное и контроль среднего. Средний рН поддерживается в течение не менее 24 ч и постепенно снизился на 72 h в культуре клеток поджелудочной железы PANC-1 и AsPC-1. Поскольку расширение гликолиз ускоряет экскрецию не только протонов, но и лактат7,8,9, мы также создали метод культуры, подражая лактат индуцированной ацидоз, добавляя лактат, вместо того, чтобы сократить концентрация бикарбонатов. Кроме того HCl индуцированной кислой ПТО в среде позволяет исключить возможность того, что клеточных реакций на кислой рН питательной среды, не за счет снижения концентрации бикарбонатов. Кроме того с рН 6,4 до 7,4 с различными бикарбонат концентрации с использованием различных средств массовой информации, мы можем оценить степень воздействия Пхе на клеточных реакций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка кислой среде культуры

  1. Подготовка элемента управления (рН 7,4) и культуры среднего низкий pH (pH 6.8)
    1. Растворите 4,75 г порошка DMEM без L-глютамина в 500 мл воды.
    2. Готовят раствор3 NaHCO 0,33 М в бутылке герметично.
      Предупреждение: Важно использовать давление туго бутылку, поскольку NaHCO3 испускает газом CO2 при нагревании и термически разлагаются.
    3. Автоклав среды и решение. Разрешить эти буферы остыть до 25 ° C.
    4. Добавьте 5 мл 200 мм L-глютамином, 5 мл пенициллин-стрептомицина и 50 мл плода бычьим сывороточным до 500 мл DMEM без бикарбоната.
    5. Для управления (рН 7,4) среднего добавьте 2,4 мл раствора3 NaHCO 0,33 М на 100 мл DMEM без бикарбоната. Для средних и низких pH (pH 6.8) добавьте 0,6 мл раствора3 NaHCO 0,33 М на 100 мл DMEM без бикарбоната.
    6. Проверьте Средний рН после 24 ч инкубации при 37 ° C под 5% CO2.
      Примечание: Количество NaHCO3 раствора необходимо скорректировать в зависимости от среднего pH, которая может различаться в зависимости от содержания CO2 инкубатора и давление воздуха. В идеале в первый раз, это лучше для измерения среднего pH с различными концентрации бикарбоната определить соответствующее количество NaHCO3 решение для добавления к среде DMEM.
      1. Сбор культуры среднего сразу же после удаления культуры блюдо из CO2 инкубатора и измерить pH с помощью рН метр. Держите средние температуры при 37 ° C, с помощью водяной бане при необходимости. Измерьте Средний рН три раза независимо друг от друга.
        Примечание: NaHCO3 раствор должен храниться при температуре 4 ° C и каждого средства массовой информации должны быть свежеприготовленные. Коммерчески доступные продукты, которые могут быть использованы в настоящем исследовании, перечислены в Таблице материалов.
  2. Подготовка лактат индуцированной или HCl индуцированной кислой среде культуры
    1. Добавьте 100 мл среды управления (подготовленных на шаге 1.1.5) 74 мкл раствора молочной кислоты или 125 мкл 1 M HCl.
    2. Проверьте Средний рН после 24 ч инкубации при 37 ° C под 5% CO2.
      Примечание: Количество молочной кислоты или раствор HCl также должна корректироваться с учетом средних pH, которая может различаться в зависимости от содержания CO2 в инкубаторе и давление воздуха. В идеале это лучше для измерения среднего pH с последовательным лактата или концентрации HCl для определения надлежащей суммы для адаптации к желаемой рН среды.

2. Заготовка и лечении клетки

  1. Начало культивирования клеток при 37 ° C, под 5% CO2 по крайней мере за 1 неделю до выполнения экспериментов.
    Примечание: Линии клетки, используемые в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.
  2. Проход клеток, когда они достигают 70-90% confluency. Не позволяйте клетки, чтобы стать вырожденная. Измените носитель каждые 2-3 дня во время ежедневных культивирования.
  3. Вымойте клетки, добавив 5 мл PBS. Аспирационная PBS и добавить отсоединение фермента например 1 мл трипсина.
  4. Инкубируйте при 37 ° C, до тех пор, пока клетки округляются и начать снимать.
  5. Добавьте 5 мл питательной среды на отдельные ячейки и деактивировать фермента. Суспензию клеток передавать 15 мл трубки и центрифуги для 3 мин при 300 x g. аспирата супернатант и вновь приостановить клетки с питательной среды.
  6. Количество жизнеспособных клеток с помощью Горяева и Трипановый синий.
  7. Семя 5.0 x 105 клеток/колодец 10 см блюдо в 10 мл среды. Инкубировать клетки для 24 ч при 37 ° C под 5% CO2.
  8. Аспирационная питательной среды, вымыть клетки с 5 мл PBS и добавляют 10 мл кислой среде культуры, подготовленный в разделе 1. Инкубировать клетки для 24 ч при 37 ° C под 5% CO2.

3. РНК изоляции

  1. Аспирационная питательной среды и вымыть клетки с 5 мл PBS. Нарушить клетки путем добавления РНК добыча реагента (см. Таблицы материалы).
  2. Скрип блюдо кратко, затем удалить РНК добыча реагента с пипетки и хранение РНК добыча реагент/ячейку lysate в 1,5 мл трубку. Оставьте при комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Добавьте 250 мкл хлороформе и встряхнуть трубки для около 15 s. оставить при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифуги на ≥8, 000 x g за 5 мин.
  4. Осторожно снимите водяной участок с помощью пипетки. Оставьте позади некоторых из водной фазы. Место в другой 1,5 мл.
  5. Добавить 550 мкл изопропанола в водной фазе и осторожно перемешать. Оставить при комнатной температуре на 5 мин центрифуги на максимальной скорости (каналов ≥20, 000 x g) для 20 мин при 4 ° C.
  6. Слить изопропанол и добавить 1 мл 75% этанола в DEPC очищенной воды. Осторожно перемешать. Центрифуга на 8000 x g за 5 мин.
  7. Пипетка этанола и пусть гранулы воздушно-сухой.
  8. Добавьте примерно 15-25 мкл (в зависимости от урожайности) DEPC очищенной воды в Пелле РНК. Тщательно перемешать.
  9. Измерять концентрацию изолированных РНК путем измерения ОД на 260 Нм, используя спектрофотометр.

4. синтез cDNA

  1. Объединить следующие компоненты в пробке реакции PCR: до 5 мкг всего РНК, 1 мкл Oligo dT (50 мкм) или случайного праймера Mix (60 мкм), 1 мкл 10 мм dNTP и свободной от нуклеиназы водой до общего объема 14 мкл.
  2. Смешать и кратко центрифуга компонентов, с помощью малых настольная центрифуга (~ 5 s). Денатурируйте образцы РНК праймер для 5 мин на 65 ° C. Спиновые кратко (~ 5 s) с использованием малых настольная центрифуга и оперативно поставить образца на льду, по крайней мере 1 мин.
  3. Добавьте следующие компоненты: 4 мкл 5 x обратный транскрипции буфера, 1 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл), 1 мкл АБС битор РНКазы (40 U/мкл).
    Примечание: В Таблице материалах приведены примеры коммерчески доступные наборы
  4. Крышка трубки, перемешивают, а затем кратко центрифуга содержимого с помощью малых настольная центрифуга (~ 5 s). Инкубируйте комбинированных реакционной смеси при температуре 50-55 ° C за 10 мин.
  5. Инактивирует реакции по инкубации при 80 ° C за 10 мин.

5. измерение кислоты отзывчивым ген выражение с использованием ПЦР в реальном времени

  1. Объединить следующие компоненты в пластине 384-ну реакции: 1 мкл шаблон cDNA, 0,75 мкл 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 мкл 50 мкм вперед Грунтовка, 0,3 мкл 50 мкм обратный грунт, 1 мкл Taq-полимеразы, 2.5 мкл 10 x буфер полимеразы Taq, 2,5 мм 20 мкл dNTP, 16.65 мкл воды.
    Примечание: Пример коммерчески доступные наборы указаны в Таблице материалов. В таблице 1приводится перечень праймеров. 96-луночных реакции пластина может использоваться также в этом шаге. Могут также использоваться другие датчики (например, Taqman зонд).
  2. Настройка эксперимента и следующую программу ПЦР в реальном времени PCR системе: 50 ° C за 2 мин, 1 цикла; 95 ° C в течение 10 мин, 1 цикла; 95 ° C 15 s и 60 ° C в течение 1 мин, 40 циклов; 95 ° C 15 s, 1 цикл; 60 ° C 15 s, 1 цикл; 95 ° C 15 s, 1 цикл.
  3. Место пластину в инструменте ПЦР. Запустите программу.
    Примечание: Upregulation реагировать генов рН, MSMO1, INSIG1и IDI1 может быть измерен уровня белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для определения концентрации соответствующих бикарбонат, мы подготовили DMEM в диапазон 0 - 8 мм NaHCO3 (конечная концентрация в среде культуры) и преуспел в подготовке культуры СМИ с pH от 6,4-7.4 (рис. 1). Мы подготовили DMEM с 8 мм NaHCO3 (рН 7,4) как управления среднего и 2 мм NaHCO3 (рН 6,8) как средство с кислой рН по данным предыдущего доклада, заявив, что внеклеточного pH достигает pH 6.8 для солидных опухолей

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали систему культуры простой кислой рН и его процесса оценки. Сочетание трех методов средних подкисления, т.е., снижение бикарбонат концентрации, лактат дополнение и добавления HCl, позволило нам тщательно исследовать механизм рН ответ и сравнить клеточный ответ на другие опухоли microenvironmental условия, такие как гипоксия или питательных голода.

Суть этого метода заключается в том, определить соответствующие концентрации бикарбоната, лактат и HCl в культурной среде. И...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор Аяно кондо является сотрудником КЁВА скончалась Кирин Co., Ltd.

Благодарности

Мы благодарим членов Отдела наук генома и лаборатории для биологии и медицины, RCAST, в университете Токио. Мы особенно благодарим д-р H. Aburatani, д-р T. Кодама, (LSBM, RCAST, в университете Токио), д-р K. Tomizuka, д-р T. Есида и д-р а.
Kunisato (кайова скончалась Кирин Co., Ltd.) полезные обсуждения и поддержки. Эта работа была частично поддерживается за счет целевых субсидий для молодых ученых (А) (26710005, т.а.), субсидий для научных исследований в инновационных областях (26116711 и 16 H 01567, т.а.) и субсидий для сложных
Исследования (16K 14605, т.о.) от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии, Takeda научного фонда (т.о.), Кобаяси Фонд исследований рака (т.о.) и проекта по изучению рака и Терапевтические эволюция (P-создать) и практических исследований для управления инновационным рака от агентства Японии для медицинских исследований и развития, AMED (т.о.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты
Модифицированная среда Дульбекко) Ниссуи» 2Nissui05919
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher10438
NaHCO3Wako191-01305
L-глютаминовый растворThermo Fisher25030-081
Пенициллин-стрептомицин смешанный раствор (стабилизированный)Nacalai09367-34
0,5 г/л-трипсин/0,53 ммоль/л-ЭДТА раствор, с фенолом краснымNacalai32778-05
0,5%-ный раствор трипанового синего морилкиNacalai29853-34
Раствор молочной кислотыSigma-Aldrich252476
раствор соляной кислотыSigma-AldrichH9892
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134
SuperScript IV Система синтеза первой нитиThermo Fisher18091
Power SYBR Green PCR Master Mix Прикладные биосистемы4368702 
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Cell lines
PANC-1ATCCCRL-1469
AsPC-1ATCCCRL-1682
KMS-6JCRB Cell Bank
TIGJCRB Cell Bank
MRC9ATCCCCL-212
HUVECATCCCRL-1730
Name<strong>Company<strong>Номер в каталоге<strong>Комментарии
Equipment
NanoDrop Один микрообъемный УФ-Вид спектрофотометр с Wi-FiThermo FisherND-ONE-W
QuantStudio 5 Система ПЦР в реальном времениThermo FisherCRL-1682
JCRB0432

Ссылки

  1. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
  2. Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
  3. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  4. Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
  5. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
  6. Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
  7. McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
  8. Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752(2015).
  9. Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
  10. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).
  11. Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Поддержание внеклеточного pHацидоз микроокружения опухолиpH-зависимая экспрессия геновлактат-индуцированный ацидозHCl-опосредованный ацидозметод снижения содержания бикарбонатакультура клеток рака поджелудочной железыпротокол экстракции РНКанализ методом ПЦР в реальном времени
Создание внеклеточного кислой рН культуры системы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.