Методическая статья

Ответ слуховой ствола мозга и внешние клетки волос поклеточного патч зажим запись в послеродовой крыс

DOI:

10.3791/56678

⸱

24 мая 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, 3Department of Laboratory Medicines, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Southern Medical University, 4Experiment Teaching Center, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает методы для записи слуховой мозга ответ от послеродового крыса щенков. Для изучения функционального развития внешних волосковых клеток, экспериментальная процедура поклеточного фиксации записи в изолированные внешние клетки волос описан шаг за шагом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внешние клетки волос является одним из двух типов Сензорные клетки волос в млекопитающих улитки. Они изменяют их длина ячейки с рецепторами потенциал, чтобы усилить слабые вибрации низкого уровня звукового сигнала. Морфология и электрофизиологические свойства внешних волосковых клеток (OHCs) развиваться в начале послеродового возраста. Созревание внешние клетки волос может способствовать развитию слуховой системы. Однако процесс развития OHCs не хорошо изучены. Это отчасти трудно измерить их функции электрофизиологических подход. С целью разработки простой способ решить эту проблему, здесь мы опишем пошаговое протокол для изучения функции OHCs в остро диссоциированных улитки от послеродового крыс. С помощью этого метода мы можем оценить улитковый ответ на стимулы чистый тон и изучить уровень выражения и функции Престин мотор белка в OHCs. Этот метод может также использоваться для изучения внутренние волосковые клетки (дивидедов).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Две различные функции улитковый Сензорные клетки волос крайне важны для млекопитающих слуха: mechanoelectric трансдукции (мет) и electromotility1,2. По каналам MET расположен в пучок волосы, дивидедов (дивидедов) и OHCs конвертировать звуковые вибрации мембраны потенциальных изменений, а также электрические сигналы нейронов ганглия иннервируемые спираль. OHCs изменить длину их клетки с мембранного потенциала и усилить вибрации низкого уровня звука. Это действие называется electromotility является производным от Престин двигательные белки, расположенные в боковой стенке OHCs3.

У многих видов, включая грызунов функция слуха незрелых в раннем постнатальном эпохи4,5. Не потенциал действия в ответ на звуковые сигналы могут быть обнаружены в аудиальном кортексе до6,начала слушания7. Разработка морфологии и функция улитки широко изучена в мышь и песчанки, крыса4,5,8. Mechanotransduction и electromotility клетки волос также разработал в начале жизни эпохи5.

Для того чтобы оценить чувствительность слуха крыс на послеродовой разных возрастов, мы разработали метод для слухового мозга ответ (ABR) запись в крыса щенков. Поклеточного фиксации это идеальная технология для расследования OHCs electrophysiologically. Однако по сравнению с фиксации в нейроны и другие клетки эпителия, низкий уровень уплотнения поклеточного ограниченное расследование electromotility изолированных OHCs.

Здесь мы описываем процедуры для расследования OHCs морфологически и electrophysiologically в остро диссоциированных улитки от послеродового крыс. Этот метод может быть изменен для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют развитие внутренней волосы клеток и функции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные протоколы с участием животных темы были утверждены Комитетом Этика животных Южной медицинского университета.

1. подготовить решения для экспериментов

  1. Подготовьте анестетиков (см. Таблицу материалы): 1.5% Пентобарбитал натрия растворяют в ddH2O.
  2. Приготовляют раствор диссекции (см. Таблицу материалы): Растворите одну сумку Leiboviz в L-15 порошка в 1 Л с 1 M NaOH ddH2O. Adjust pH 7,3. Отрегулируйте осмолярности до 300-330 мОсм, используя осмометре и 10 мм HEPES перед использованием.
  3. Растворите 2 мг/мл коллагеназы IV (см. Таблицу материалы) в рассечение раствор, приготовленный на шаге 1.2.
  4. Подготовка иммуноокрашивания решения (см. Таблицу материалы): распустить параформальдегида 4% в-фосфатный буфер (PBS).
    Предупреждение: Параформальдегида токсичен; надевайте соответствующую защиту.
  5. Разбавьте агент проницаемость 0,3% в PBS. Развести 10% нормальной козьего сыворотки в PBS в блокирующем буфере. Разбавьте антитела Престин 1: 200, в блокирующем буфере. Разбавьте 1: 600 Alexa488-конъюгированных антител в блокирующем буфере. Разбавьте 1: 200 Изотиоцианаты B Фаллоидин-тетраметилродамина в PBS.
  6. Подготовить внеклеточного решение (см. Таблицу материалы): подготовка среднего L-15 Leiboviz, как описано выше (шаг 1.2).
  7. Подготовить внутриклеточных решение (см. Таблицу материалы).

2. ABR запись

Примечание: ABR записи ранее описаны подробно в наших предыдущих исследований9.

  1. Анестезировать крысах Sprague-Dawley (SD) (1-14 день старого детенышей и 2 - месячного взрослых, обоих полов) с одной инъекции Пентобарбитал натрия 1,5% (22 мг/кг для щенков и 30 мг/кг для взрослых, внутрибрюшинного (и.п.)).
  2. Место наркотизированных животного в Полиэтилен вспененный плесень обездвижить животное тело. Поместите животное на столе в комнате кулисный звук вибрации. Держите температуру тела животного на 37,5 ° C с грелку.
  3. Протрите области головы с 70% (vol/vol) этанола. С помощью тонкой ножницы, сделать 1-2 мм разрез вентролатеральные внешних Пинна поместить электрод сравнения или землю. Подкожные иглы электрода (запись электрода) находится над черепа вершин (рис. 1A).
  4. С помощью функции генератора, генерировать калиброванные тон очередей (1 ms падение/подъем, плато 3 мс) различных частот (2, 4, 8, 16, 24 и 32 кГц) и интенсивности (снизилась с 85 до 10 дБ SPL с шагом 5 дБ). Изменять частоту и амплитуду вручную или с помощью компьютера. Предоставлять звуковые раздражители через электростатический громкоговоритель, расположенный 10 см от сторону головы животного.
  5. Фильтр (100-1000 Гц), усиливают и средний (256 раз) звук вызвал потенциал с помощью многофункциональных процессора получить abr. Следы ABR контролируется онлайн и хранятся для анализа в автономном режиме. Чтобы завершить запись с одного животного ABR около 40 минут.
    Примечание: Как правило, три-семь пиков (волны я волна VII) с задержкой менее 15 мс может быть определены (рис. 1B). ABR порог определяется как минимальный уровень звука в которой волна I и II могут быть обнаружены.
  6. Усыпить перед животные просыпаются от анестезии (с внутрибрюшинной инъекции Пентобарбитал натрия 0,3 мл 1,5%).

3 рассечение орган из Корти (OC)

  1. Анестезировать крыса щенков. Для крыс менее 6 дней (< P6), держать животное в 100 мм культуры блюдо и обложка блюдо со льдом на 10 мин. Для крыс > P6, анестезировать животное с одной инъекции Пентобарбитал натрия 1,5% (22 мг/кг, и.п.). Обезглавить потомства крыс после анестезии.
  2. Стерилизуйте голову путем распыления с 70% этанола (vol/vol).
  3. Откройте череп вдоль сагиттальной срединной линии с ножницами; Удаление мозга подвергать внутреннего уха.
  4. Перенесите внутреннего уха в 35-мм Петри, заполнены с 3 мл ледяной L-15 (рис. 2A).
  5. Под микроскопом рассечение использование тонкой щипцы для удаления костлявые капсула улитки (рис. 2B).
  6. Берем OC и связанных с ними каннелюры vascularis (SV) от modiolus.
  7. Путем проведения базальная часть SV пинцетом, отдельных OC от SV полностью путем раскрутки медленно от основания к вершине (рис. 2 c).
  8. Равномерно вырежьте OC на три части с помощью тонкой ножницы (Рисунок 2D).

4. иммунофлюоресценции пятнать

  1. С помощью кончика пипетки 200 мкл, передача сегментов OC (шаг 3,8) на стекло слайд и исправить с 100 мкл параформальдегида 4% для по крайней мере 4 ч при 4 ° C.
    Предупреждение: Параформальдегида токсичен; надевайте соответствующую защиту.
  2. Вымойте ткань смещая параформальдегида с 100 мкл свежих PBS. Вымойте ткань три раза за 10 мин.
  3. Инкубируйте ткани с 0,3% проницаемость агентом в PBS на 30 минут при комнатной температуре.
  4. Отказаться от проницаемости агента в PBS и стирать ткани три раза с PBS.
  5. Блок с 10% нормальной козьего сыворотки в PBS на 1 ч при комнатной температуре.
  6. Проинкубируйте с анти Престин C-конечная антитела (1: 200) в блокировании решение для 2 ч при комнатной температуре или при температуре 4 ° C на ночь.
  7. Вымойте три раза с PBS на 5 мин.
  8. Проинкубируйте с Alexa488-конъюгированных вторичные антитела (1: 600) в блокирующие решение за 1 час при комнатной температуре в темноте.
  9. Вымойте три раза с PBS для 5 мин в темноте.
  10. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре в темноте с родамин Фаллоидин (1: 200).
  11. Вымойте три раза с PBS для 5 мин в темноте.
  12. Крепление на стекло слайд с монтажа средних (содержащие DAPI). Изображение с помощью конфокальной микроскопии с помощью 405 нм, 488 нм и 594 нм лазеры. Установить мощность лазера на 0,1-0,5 МВт и сканирования скорость на 0,5 кадр/сек.

5. фиксации записи изолированных OHCs

  1. Использовать съемник пипетки и микро кузнец сделать патч пипетки с наконечник диаметром 2-3 мкм. обратно заполните пипетки с внутриклеточной решения. Как правило первоначальное сопротивление патч пипеткой был 2,5-3,5 MΩ в раствор для ванн.
  2. С помощью кончика пипетки 200 мкл, передача кусок OC (от шага 3.8) в 35 мм Петри. Дайджест ткани с 100 мкл ферментативного пищеварения среды (коллагеназа IV, смотрите Таблицу материалы) за 5 мин при комнатной температуре.
  3. Сместить среднего ферментативного пищеварения с 100 мкл L-15. Вырежьте ткань на мелкие кусочки с помощью микро скальпель изолировать волосковых клеток.
  4. После нежной закупорить, передачи клетки в камеру домашнее небольшие пластиковые (диаметр ~ 1,5 см) заполнены раствором фермента бесплатная баня (~ 1,5 мл, смотрите Таблицу материалы).
  5. Разместите камеру на сцене инвертированным микроскопом. Найти здоровый появляются одиночные OHCs.
  6. Загрузите патч пипетку в главный этап 700B усилителя. Переместите пипетку патч тщательно, микроманипулятор и расположите его вокруг нижней части внешнего клетки волос (рис. 3A).
  7. Зажим поклеточного патч OHC запечатывая боковой стенки клетки тела. Применить легкие всасывания до тех пор, пока разрыв мембраны клетки. Установите потенциальных холдинга на -70 mV. Клетки с доступа к сопротивлению, составлял от 10 до 17 MΩ и мембраны варьировались от 100 до 500 MΩ и считается успешным поклеточного конфигурации.
  8. С помощью компьютерного управления, применяются гиперполяризирующий и расшатывания напряжения (длительность 250 мс и начиная от −140 до + 94 МВ в 13 MV) ячейку, чтобы выявить поклеточного течений.
  9. Усиливают поклеточного течений, фильтр (угловой частоты 5 кГц) по 700B усилитель. Преобразуйте данные по 1440A конвертер и хранилище для анализа в автономном режиме.
  10. Измерьте емкость мембраны OHCs протоколу две синусоиды напряжения стимул контролируется программное обеспечение зажим патч. Установите диапазон напряжения стимулировать от -140 до 110 МВ. Храните данные для анализа в автономном режиме.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ABR можно собрать из наркотизированных крыс щенков старше послеродовой день 7 (P7) с использованием очередей чистый тон (Рисунок 1A). Как показано на рисунке 1B, ABR сигналов, полученных от крыс щенков, показали только три или четыре различных волн с небольшой амплитудой. Обычно до семь пиков наблюдались в ABR сигналов взрослых животных (рис. 1B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В крыс моложе 11 день без потенциал действия в ответ на звуковой стимуляции можно наблюдать в аудиальном кортексе6,7. Таким образом послеродовой день 11 описывается как «слуха onset»10. Развитие слуха функции до начала слушания не было хорошо изучены пока. Используя аналогичный метод для взрослых ABR записи, мы демонстрируем, что abr может вызвали на чистый тон взрыв из крыса щенков моложе P11 (рис. 1). Однако...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантов из 973 программы (2014CB943002) и Национальный фонд Китая естественных наук (11534013, 31500841).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Обезболивающее
Пентобарбитал натрияSigmaP37611,5% в воде
<сильное>Название<сильно>Компания<>Номер в каталоге<сильно>Комментарии
<сильно>Раствор для вскрытия
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 упаковка в 1 л воды
Коллагеназа IV SigmaC51382 мг/мл в L-15
HEPESSigma7365-45-910 мм
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Immunostaining solutions
PBSThermo Fisher Scientific10010023PH 7.3
ПараформальдегидSigma1581274% в PBS
Triton X-100AmrescoZS-06940.3% в PBS
Нормальная козья сывороткаThermo Fisher Scientific10000C10% в PBS
престин антителоSanta CruzSC-22694dil 1:200
Alexa Fluor 488-конъюгированное антителоThermo Fisher ScientificA-11055dil 1:600
Фаллоидин-тетраметилродамин B изотиоцианатSigmaP1951dil 1:200
DAPISolarbioC0060dil 1:20
Name CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Внеклеточный раствор
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 упаковка в 1 л воды
HEPESSigma 7365-45-910 мМ
НазваниеCompany>Номер в каталогеКомментарии
>Внутриклеточный раствор
CsClSigma7647-17-8140
мМ MgCl2Sigma7791-18-62 mM
EGTASigma67-42-510 мМ
HEPESSigma7365-45-910 мм
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Оборудование
ОсмометрGonotecOSMOMAT 3000 базовый
ЩипецWPI14095Пинцет Dumont
Съемник микропипетокИнструмент SutterMODLE-P97
Micro ForgeNarishigenMF-830
Мини операционная системаSutter InstrumentMP-285
MultiClampAxon700B
Система сбора данных с низким уровнем шумаAxon1440A
ES1 динамикTucker-Davis Technologies
TDT система 3Tucker-Davis Technologies
NameCompany>Каталожный номер>Комментарии
Software
SigGenRP программное обеспечениеTucker-Davis Technologies
BioSigRP программное обеспечениеTucker-Davis Technologies
jClampScientific Solutions
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Animal экспериментальных животных >
Центра экспериментальных животных Южного медицинского университета
сильноSD

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123(2001).
  7. De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826(2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи