Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии

Краткое содержание

Клетки сетчатки пигментного эпителия могут служить клетки заместительная терапия для передовые формы сухие возраста макулярной дегенерации. Этот протокол описывает генерации большой eyed модель географической атрофии и субретинальное трансплантация человеческих эмбриональных стволовых клеток пигмента сетчатки эпителиальных клеток в этой модели болезни.

Аннотация

Географической атрофии (GA), поздней стадии сухие возраста макулярной дегенерации характеризуется потерей сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) слоя, который приводит к последующим дегенерации жизненно сетчатки структур (например, фоторецепторов) вызывает тяжелые зрением. Аналогичным образом ПЭС потери и снижением остроты рассматривается в долгосрочной последующей вверх больных с передовых влажные возраста макулярной дегенерации (AMD) лечении интравитреальные анти Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Таким образом с одной стороны, это основополагающее значение для эффективного получения НПП клетки от неограниченный источник, который мог бы служить в качестве заместительной терапии. С другой стороны важно оценить поведение и интеграции производных ячеек в модели болезни, влекущие за собой хирургические и тепловизионные методы как можно ближе к те, которые применяются в организме человека. Здесь, мы предоставляем подробный протокол, основанный на наших предыдущих публикаций, описывающий поколения доклинических модели GA с использованием белых кролика глаза, для оценки человеческих эмбриональных стволовых клеток получены клетки сетчатки пигментного эпителия (Госкомсанэпиднадзором ПЭС) в клинически значимых параметр. Дифференцированные Госкомсанэпиднадзором НПП пересаживают в наивные глаза или глаза с NaIO₃-индуцированной GA-как дегенерация сетчатки, используя технику plana Парс transvitreal 25 G. Оценку выродились и пересаженные областей осуществляется смешанных с высоким разрешением неинвазивные в реальном времени изображений.

Введение

Этот протокол описывает поколения большой eyed доклинических модель географической атрофии (GA), которая позволяет оценить интеграции трансплантированных Госкомсанэпиднадзором-НПП в пространстве субретинальное. Здесь подробно описаны методы были использованы в 3 последних публикаций, которые демонстрируют производства обогащенного, чистый и функциональный населения НПП клеток с Госкомсанэпиднадзором¹, а также создание внешнего повреждения сетчатки и фенотип GA-как индуцированных субретинальное инъекции физиологического солевых растворов (т.е., BSS и PBS) или₃ NaIO в кролика глаза^2,3. Далее мы продемонстрировали югу сетчатки подвеска трансплантации Госкомсанэпиднадзором-НПП образуют обширные функциональные монослои с фоторецепторных спасательных мощность².

Несколько преимуществ сопровождать использование глаз кролика для поколения модели GA заболеваний. Во-первых размер кролика глаза, которая составляет 70% объема взрослого человеческого глаза, позволяет клинически значимого трансплантации используя плотность клеток, что намного ниже, чем обычно используется в небольших грызунов глаза (1000 клеток/мкл против 50 000 клеток/мкл)^{4 , 5}. Во-вторых, хирургии в грызунов является обычно транссклеральная через хориоидея, который подрывает сетчатки барьер и потенциально вызывает воспалительной реакции и возможного отказа⁶. Оба этих фактора вместе может привести к multilayering и слипания пересаженные клетки и в целом плохой интеграции пересаженные клетки в нарушена родной ткани сетчатки. Однако большой eyed кролик модель позволяет выполнять хирургической техники с инструментированием идентичны в клинических условиях. В-третьих большими глазами модель также позволяет с высоким разрешением в vivo визуализации и мониторинга пересаженные клетки и вышележащих сетчатки через время^1,2,3. Таким образом мы описываем клинически соответствующим и экономически эффективных доклинических модель, которая должна быть привлекательной альтернативой грызунов для тех, кто с интересом в исследованиях нормальных и больной сетчатки и югу сетчатки пространства.

Протокол

Следующий протокол следует правилам ухода за животными Karolinska Instituet. Все эксперименты на животных с использованием Новой Зеландии альбинос кроликов (Таблица материалов) были утверждены Комитетом по региональным животных этики (Stockholms Норра Djurförsöksetiska Nämnd) (разрешение: dnr 56/15). Использование Госкомсанэпиднадзором (dnr 2011/745-31/3) и передачи и манипуляции Госкомсанэпиднадзором-НПП (dnr 2013/813-31/2) также является шведское законодательство и правилам Каролинского института и был одобрен региональной человеческой этики (Комитет Regionala Etikprövningsnämnden я Стокгольм).

1. субретинальное инъекции иодат натрия (NaIO₃) в животной модели с большими глазами

1. Анестезировать животных внутримышечное введение администрацией в бедро с сочетанием кетамин 35 мг/кг и 5 мг/кг Ксилазина в солевой с помощью шприца 30 G, и расширяются учеников с актуальным глазные капли, используя сочетание cyclopentolate и 2,5% фенилэфрина 0,75%. Надлежащего анестезии подтверждается если животное не реагирует на жесткий щепотку ее задней ноги.
2. Место кролика под хирургический микроскоп с головы перед хирургом (рис. 1A). Использование крышки втягивающего устройства для удаления веки и nictitans мембраны стерильной тканью для сведения к минимуму риска заражения. Использование сбалансированного солевого раствора (BSS) для предотвращения сухости под наркозом в обоих глазах.
3. Для микрохирургии, использования 2-порт (или дополнительный 3-порт) 25 G transvitreal Парс plana технику с-клапанная trocars для вставки микрохирургических инструментов (рис. 1B). Многофункциональные Витрэктомия машина имеет порты для подключения настой канюля, endoillumination, vitrector и Эндовенозное. Для субретинальное инъекции только endoillumination является обязательным, что делает 2-портовый set-up достаточно. Вставьте endoillumation через верхний левый троакара и использовать верхний правый троакар для канюля субретинальное инъекций.
   1. Для настройки 3-порт используйте нижней височной троакар для канюля инфузии BSS. Если дополнительные документы (например, vitrector), используется, вставить их через верхний правый троакар.
   2. Вставьте верхний 2 trocars 1-2 мм от лимба, используя когтистые щипцы захватить и вытеснять конъюнктивы, обволакивающие вставки сайте.
   3. Убедитесь, trocars вставленной transsclerally под углом 30-45° лимба параллельно и перейти к середине кончик троакар. Затем поверните троакара 90° и заранее в глаза, направленный на заднего полюса глаза. Эта процедура будет избежать послеоперационных утечки из sclerotomies, а также уменьшить риск эндофтальмита (т.е., бактериальной инфекции в глаз). Смотрите также Рисунок 2B троакара должности.
   4. Положите одного плоского контактные линзы на роговице визуализировать сетчатки, с синтетическими слезы как контакт гель между глаз и контактных линз (рис. 1A).
   5. Нарисуйте 500 мкл NaIO₃ в 1 мл шприц, подключенных к Расширение трубки (управляемый помощник) и 38 G polytip канюли (управляется хирург).
   6. Вставьте endoillumination зонд через верхний левый троакара и канюли инъекции через верхний правый троакара и продвигать катетер через пространство стекловидного тела к сетчатке, направленных для области чуть ниже головы зрительного нерва.
   7. Разрешить кончик канюля медленно трогать сетчатки, пока фокуса отбеливание является видимым. Инъекции, сам будет проникать сетчатки, позволяя субретинальное доставки. Не позволяйте канюля проникают сетчатки, так как это может вызвать кровотечение.
   8. Придать 50 мкл NaIO₃ subretinally течение 5 s. Поскольку существует естественный расщепления плоскость между сетчатки и основной сосудистое, ясно видны полупрозрачная пузырь следует постепенно формируют во время инъекции.
   9. Во время инъекции медленно втягивать иглы, но убедитесь, что кончик сохраняется в течение пузырь, чтобы свести к минимуму рефлюкса.
   10. После удаления endoillumation и инъекции канюли, удалить с помощью когтистые щипцами trocars и применить легкое давление для 30 s самоуплотняющийся швов менее sclerotomies, используя кончик или тупым концом щипцы.
4. POST-surgically дать 10 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание. Не дают послеоперационные актуальные стероиды или антибиотики. Для Аналгетики дают 0,5 мл бупренорфина 0,3 мг/мл подкожно после хирургии, а также день после операции.
5. После использования вымойте все инструменты, погрузив их на пару секунд сначала в 70% этиловом спирте, во-вторых в 45% этаноле и наконец в дистиллированной воде. Правильно высушите бумажным полотенцем.
6. Посещают животных до тех пор, пока они вновь обрести достаточную сознания и разместить их все в одном encaged. При необходимости (например, для иммуногистохимии целей), усыпить животных путем внутривенных инъекций Пентобарбитал 100 мг/кг (см. Таблицу материалы).
7. Ждать 7 дней, чтобы приступить к трансплантации клеток Госкомсанэпиднадзором НПП.

2. субретинальное трансплантации клеток Госкомсанэпиднадзором НПП в лечение животных

1. Управлять 2 мг (100 мкл) исхода триамцинолона интравитреальные наркотизированных животных, с использованием инъекционной иглой 30 g, вставлены 1-2 мм от лимба в нижней височной квадранте 1 неделю до трансплантации Госкомсанэпиднадзором-НПП и повторно применять его каждые 3 месяца. Убедитесь, что точку кончик к заднего полюса глаза, чтобы избежать сенсорный линзы.
2. Культура Госкомсанэпиднадзором НПП монослоя, как описано выше¹.
3. Извлеките носитель дифференциация клеток (см. Таблицу материалы) 24-ну вырожденная Госкомсанэпиднадзором НПП монослоя и мыть каждый хорошо с 500 мкл PBS без Ca^{2 +} и Mg^{2 +}. Повторите это действие еще раз, для в общей сложности 2 стирок.
4. Отменить супернатанта, 500 мкл трипсина в колодец и инкубировать в течение 12 минут при 37 ° C.
5. Наклона пластины и тщательно удалить трипсина (клетки должна оставаться прикрепленной к пластине). Соберите клетки в 800 мкл свежие 37 ° C подогретую дифференциация СМИ нежный закупорить, или даже соскоб, если необходимо, чтобы получить одну ячейку подвеска.
   Примечание: Используйте стрейнер клетки 40 мкм, если наблюдаются скопления клеток.
6. Подсчет ячеек в камере Горяева, используя 0,2% Трипановый синий, согласно инструкциям производителя.
7. Добавьте 5 мл дифференциации СМИ и центрифуги клеток при комнатной температуре, 300 x g за 5 мин.
8. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в свежей стерилизовать фильтр PBS (прошло через фильтр шприц 25 мм) до конечной концентрации 1000 клеток/мкл.
9. Алиготе предыдущих суспензию клеток в 600 мкл аликвоты и держать на льду до и во время операции.
10. Анестезировать животных администрацией внутримышечно в бедро с сочетанием кетамина и 5 мг/кг Ксилазина 35 мг/кг в солевой с помощью шприца 30 G. Разбавить учеников с актуальным глазные капли, используя amix cyclopentolate и 2,5% фенилэфрина 0,75%. Надлежащего анестезии подтверждается если животное не реагирует щепотку жесткий в своей задней ноги.
11. Место кролика с головой, сталкивается с хирургом. Использование крышки втягивающего устройства для удаления веки и nictitans мембраны стерильной тканью для сведения к минимуму риска заражения. Используйте BSS для предотвращения сухости под наркозом в обоих глазах.
12. Для микрохирургии, использования 2-порт (или дополнительный 3-порт) 25 G transvitreal Парс plana технику с trocars размещены в той же позиции, как описано в шаге 1.3 и Рисунок 2. Если предыдущий sclerotomies являются видимыми, выполните троакара вставки просто рядом, но не через них, чтобы свести к минимуму риск послеоперационных утечки.
    1. Положите одного плоского контактные линзы на роговице визуализировать сетчатки, с синтетическими слезы как контакт гель между глаз и контактных линз (рис. 1A).
    2. После надлежащего кончик позиционирования (см. шаги 1.3.5 и 1.3.6) инъекционные 50 мкл нежно смешанные Госкомсанэпиднадзором НПП подвеска (50 000 клеток) subretinally. Цель центра области₃ предварительно обработанных NaIO отличают характерный «металлик» Эндо освещение рефлекс. Нейросенсорные сетчатки следует отделить легко создание четко видны пузырь. Иглы стерильные H₂O между ними кроликов и после использовать, чтобы избежать иглы, засорение вследствие ячейки флеш сгустки. Заметил изменение иглы при засорения.
    3. Во время инъекции медленно втягивать иглы, но убедитесь, что кончик сохраняется в течение пузырь, чтобы свести к минимуму рефлюкса.
    4. После удаления endoillumation и инъекции канюли, удалить с помощью когтистые щипцами trocars и применить легкое давление для 30 s самоуплотняющийся швов менее sclerotomies, используя кончик или тупым концом щипцы.
13. POST-surgically дать 10 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание. Не дают послеоперационные актуальные стероиды или антибиотики. Для Аналгетики дают 0,5 мл бупренорфина 0,3 мг/мл подкожно после хирургии, а также день после операции.
14. После использования вымойте все инструменты, погрузив их на пару секунд, прежде всего в 70% этиловом спирте, во-вторых в 45% этаноле и наконец в дистиллированной воде. Правильно высушите бумажным полотенцем.
15. Посещают животных до тех пор, пока они вновь обрести достаточную сознания и разместить их все в одном encaged. При необходимости (например для иммуногистохимии целей), усыпить животных путем внутривенных инъекций Пентобарбитал 100 мг/кг.

3. в естественных условиях сетчатки и субретинальное изображений

1. Используйте устройство спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) с сопровождающим программным обеспечением (см. таблицу материалы), для получения поперечных б сканов обработанных животных, согласно инструкциям производителя. Чтобы избежать размытие изображения, убедитесь, что держать влажной роговицы, перемещая с актуальным физиологического раствора каждые 30-60 сек.
   1. Место наркотизированных и ученик расширены животных (см. шаги 1.1 и 2.10) в поворотного кронштейна получить беспрепятственный путь из документа источника света на сетчатку кролика.
   2. Получите по крайней мере 3 октября сканирования с одновременным ИК конфокальная сканирования лазерного офтальмоскопия (IR-cSLO) отражения ссылки изображения представляющих верхней, Центральной и нижней части вводят области.
   3. Получать изображения глазного дна ан лица с cSLO синий, зеленый, инфракрасный и многоцветной лазерного отражения (например, нескольких одновременных лазерных цветов), соответственно.
   4. Захват изображения синий свет аутофлюоресценция (BAF) с использованием голубой свет лазера возможности устройства SD-Октябрь.

Результаты

Представитель в vivo изображения BAF, ИК cSLO и SD-Окт нормальной альбинос кролик сетчатки показаны на рисунке 2. Обратите внимание на различных слоях сетчатки с уровнями их отличительные захвачен SD-Окт инструмент отражения света.

В фигуры 1A и 1B рисунок, установки для создания югу сетчатки шелесту проиллюстрирован: крышка втягив...

Обсуждение

В этом протоколе описан поколения большой eyed модель GA и ее доклинических использования для оценки Госкомсанэпиднадзором НПП интеграции в естественных условиях .

Для перевода регенеративной терапии для GA и связанных с ними заболеваний в клинике⁷важно развивать и оптимизировать методы, которые добросовестно захватить клинические методы для трансплантации и изображений. Кролик — в этом аспекте привлекательным: он имеет сравнительно большой глаз, что позволяет ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
NutriStem hESC XF дифференцировочная среда – bFGF и – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS без Ca2+ и Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Клеточный фильтр 40 μ m Нейлон	VWR	732-2757
Игла 30 G 0.5' ’; 0,3 мм x 13 мм	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 мм Шприцевой фильтр	Acrodisc	PN4612
0,4% трипановый синий	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Использование при 0,2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% этанол	Solveco AB	1047
Кетаминол, 100 мг/мл	Intervet, Boxmeer	511519	Использовать 35 мг/кг кетамина
Rompun vet, 20 мг/мл Bayer	Animal Health	22545	Использовать 5 мг/кг ксилазина
Triescence, 40 мг/мл	Alcon Nordic A/S	412915	2 мг внутривитериального введения
циклопентолата-фенилэфрина, 0,75% + 2,5%	APL	321968	Использовать по 1 капле в каждый глаз
Viscotears	Laboratoires Thé	a 597562
Наружный физиологический раствор	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 мг/мл	Omnidea	77168	Использование 100 мг/мл пентобарбитала
Удлинительная трубка (молоток)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G политип субретинальная канюля	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Одноразовая плоская линза	Volk
Barraquer Colibri втягивающий крышка	AgnTho's AB	42-020-030
Бесклапанные троакары	Alcon Nordic A/S	8065751448
Когтистые щипцы	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Витрэктомия	Аппарат Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ калибр Витрэктомия TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT аппарат	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Использование Heidelberg Eye Explorer версии 1.9.10.0
24 луночные пластины	Sarstedt	83.3922
Гемоцитометр Neubauer	VWR	631-0925
Новозеландские кролики-альбиносы	Lidkö пинги Rabbit Farm, Швеция
		hESC-RPE	Смотрите номер ссылки 1
Buprenodale Vet, 0,3 мг/мл	Dechra	660500	Используйте 0,5 мл бупренорфина подкожно