Улучшенная протокол представлен для измерения экспрессии генов переходных от репортера конструкции в клетках aleurone ячменя после бомбардировки частиц. Сочетание автоматизированных зерна, шлифовальные с 96-луночных пластины фермента анализов обеспечивает высокую пропускную способность для процедуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измеряя экспрессии генов в бомбардировке ячменя Aleurone слои с повышенной пропускной способностью
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Aleurone слой зерна ячменя является важной моделью системы для выражения гена гормона регулируется в растениях. В aleurone клетках гены, необходимые для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). Механизмы GA и ABA сигнализации могут быть допрошены путем введения Репортер ген конструкции в aleurone клетки через бомбардировка частиц, с результатом переходных измеряется с помощью фермента анализов. Улучшенная протокол сообщается, что частично автоматизирует и оптимизирует шаг гомогенизации зерна и assays энзима, позволяя значительно более высокую пропускную способность, чем существующие методы. Гомогенизация пробы зерна осуществляется с использованием автоматизированных ткани гомогенизатор, и GUS (β-глюкуронидазы) анализов осуществляется с помощью системы 96-луночных пластины. Представитель результаты, с использованием протокола показывают, что активность фосфолипазы D могут играть важную роль в активации HVA1 экспрессии генов, ABA, через фактор транскрипции TaABF1.
Введение
Слой aleurone ячмень является система устоявшихся моделей для изучения выражения гена гормона регулируется в растения1. В частности ряд генов, необходимых для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). ГА и ABA, сигнальные пути взаимосвязаны, как выражение некоторых генов, GA-активированный тормозится Аба и наоборот1.
Ценный стратегия для понимания, что роль конкретного участников в GA/Аба сигнализации был введение эффекторных гена конструкции через бомбардировка частиц, следуют....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка эффекторных и Репортер ген конструкции
- Построить эффекторных конструкции, которые используют учредительный промоутер (например кукурузы убиквитин, UBI) диск выражение от желаемого открытым чтение фрейма. Например Постройте плазмида, содержащие UBI::TaABF1 диск сильное выражение учредительного TaABF15.
- Постройте репортер конструкции, которые включают промоутер, чья деятельность будет оцениваться, размещенных вышестоящего кадра открытом чтения, такие как ГАС. Например Постройте плазмида, содержащие HVA1::GUS для измерения выражение из HVA1 промоутер2<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Метод, описанный здесь может использоваться для вилочное любой ген тест в aleurone клетки зерна ячменя. Уровень экспрессии гена теста может быть удобно измерять (рис. 2). Выше пропускная способность протокола, описанные здесь значительно увеличивает эффективность измельчения семян и фермента проба шагов. Этот метод был использован для оценки способности транскрипционным фактором TaABF15,6 для того что.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Введение гена эффекторных конструкции через бомбардировка частиц, следуют переходных выражение репортер конструкций является ценным стратегия для рассечения роль конкретных участников в GA/Аба сигнализации и в результате гена гормона регулируется выражение.
Однако существующие протоколы для проведения таких экспериментов в ячменя aleurone клетки2,3,4,5,6 , .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы благодарят за помощь в проведении экспериментов, Джуди камень для консультации по зерна гомогенизации и Линн Ханнум для консультации по флюометрия Грейсон Батлер и Маргарет Барретт. Эта работа была поддержана Национальный научный фонд (IOB 0443676), путем институционального развития Award (IDeA) от национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под номер гранта P20GM0103423 и гранты Отдел Colby Колледж естественных наук.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| УФ-видимый спектрофотометр | Nanodrop | ND-1000 | |
| Гималайские зерна ячменя | // | Разнообразие голозерного ячменя (хранить в темноте при 4&�; C) | |
| сукцинат натрия | Sigma | S2378 | Реагент для приема раствора |
| хлорида кальция (дигидрат) | Fisher | C79-500 | Реагент для приема раствора |
| для | приготовления | / | 20 мМ сукцинат натрия, 20 мМ хлорид кальция, pH 5,0. Перед использованием стерилизовать путем автоклавирования. |
| хлорамфеникол | Sigma | C0378 | Приготовьте стоковый раствор 10 мг/мл в 70% этаноле. |
| Вермикулит | Фишера | NC0430369 | Используется для вермикулитовых пластин. |
| Круги из фильтровальной бумаги (90 мм) | Ватман | 1001 090 | Используется для вермикулита и для предварительной бомбардировки зерна |
| Вермикулитовые пластины | домашнего изготовления | / | Добавьте 50 мл вермикулита в стеклянную чашку Петри. Сверху на вермикулит положите бумажный круг толщиной 90 мм. Автоклав. |
| щипцы (тонко заостренные) | Фишер | 13-812-42 | Используется для удаления семенной оболочки с зерен ячменя. |
| щипцы (ультра тонкое острие) | Fisher | 12-000-122 | Используется для удаления семенной оболочки с зерен ячменя. |
| Микроносители золота (1,6 Μ m) | BioRad | 1652264 | |
| макроносители | BioRad | 1652335 | |
| хлорида кальция (дигидрат) | Fisher | C79-500 | Приготовьте 2,5 М стоковый раствор и храните 1 мл аликвот при -20°С. |
| спермидин | Sigma | S0266 | Приготовьте стоковый раствор 100 мМ и храните 500 мкм; L аликвоты при -20°С; C (использовать в течение 2 месяцев). |
| разрывные мембраны (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| останавливающие экраны | BioRad | 1652336 | |
| держатели макроносителей | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic система доставки частиц | BioRad | PDS-1000/He | |
| одноосновной моногидрат фосфата натрия | Sigma | S9638 | Реагент для 1М фосфат натрия pH 7,2 |
| натрия фосфат двухосновной | Sigma | S9763 | Реагент для 1М фосфат натрия pH 7,2 |
| 1М фосфат натрия pH 7,2 | домашнего производства | / | Соедините 6,9 г натрия фосфата моноосновного моногидрата с 7,1 г натрия фосфата двухосновного. Добавьте воды до 100 мл. Добавьте NaOH, чтобы получить pH 7,2. |
| дитиотриетол (ДТТ) | Sigma | 43819 | Растворить в воде до 1 М. Хранить при -20°С в 1 мл аликвот. |
| леупептин | Sigma | L2884 | Растворить в воде до 10 мг/мл. Хранить при -20°С; |
| C.глицерин | Sigma | G5516 | Приготовьте 50% раствор в воде. |
| Буфер для помола | домашнего приготовления | / | комбайна 10 мл 1 м фосфата натрия pH 7,2, 500 μ L 1 М DTT, 100 μ Л 10 мг/мл лейпептина, и 40 мл 50% глицерина. Добавьте воды до 100 мл. |
| бусины из нержавеющей стали (5 мм) | Qiagen | 69989 | |
| 2,0 мл трубки | Eppendorf | 22363352 | Эта конкретная модель трубки рекомендуется для использования с гомогенизатором. |
| Гомогенизатор шариков (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12 мм x 75 мм стеклянные пробирки | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Приготовьте исходный раствор 25 мМ и храните 1 мл аликвот при -20°C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Приготовьте 100 мМ стоковый раствор и храните 250 мкм; L аликвоты при -20°С; С. |
| Трис основание | Sigma | T1503 | Реагент для 1М Трис сульфат pH 7,7. |
| серная кислота | Sigma | 258105 | Реагент для 1М Трис сульфат pH 7,7. |
| 1М Трис сульфат pH 7,7 | домашнего приготовления | / | Растворите 12,1 г основания Триса в 100 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,7 с помощью серной кислоты. |
| Хлорид магния | Sigma | M9397 | Растворить в воде до 2 М. |
| Буфер для анализа люциферазы (LAB) | домашнего изготовления | / | Комбайн 3 мл 1 М Трис сульфата pH 7,7, 500 μ л 2 М хлорида магния, 1 мл 1 М ДТТ и 200 мкм; L 0,5 М ЭДТА. Добавьте воды до 50 мл. |
| Смесь для анализа люциферазы домашнего | приготовления | / | Комбайн 15 мл LAB, 800 мкм; L 25 мМ люциферина, 200 мкм; Л 100 мМ АТФ, и 4 мл воды. Это дает достаточную смесь для анализа (20 мл) для 100 анализов люциферазы. |
| люминометр (Сириус) | Бертольд | / | |
| 4-метилумбеллиферил-&бета;-D-глюкуронид (MUG) | Goldbio | MUG1 | Растворяют в ДМСО до 100 мМ. |
| Азид натрия | Sigma | S8032 | Приготовьте 2% исходный раствор в воде и храните 1 мл аликвот при -20°С. |
| 96 луночных планшетов (стандарт) | Fisher | 12565501 | |
| GUS пробирный буфер | домашнего изготовления | / | Комбайн 2,5 мл MUG, 5 мл 1 М натрия фосфата pH 7,2, 400 мкм; L 0,5 M EDTA, 1 мл 1 M DTT, 100 μ Л 10 мг/мл лейпептина, 20 мл метанола и 1 мл 2% азида натрия. Добавьте воды до 100 мл. |
| TempPlate герметизирующая пленка | США Scientific | 2921-1000 | |
| 96 луночных пластин (черная) | Costar | 3916 | |
| карбонат натрия | Sigma | S7795 | Приготовьте 200 мМ раствор в воде. |
| 4-метилумбеллиферон | Sigma | M1381 | Приготовьте 100 мкм; М раствор в воде. Заморозьте 1 мл аликвот при -20°С; С. |
| микропланшетный считыватель флуоресценции | Bio-Tek | FLX-800 |
Ссылки
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene pr....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
