Методическая статья

Сбор и извлечения образцов профессиональных воздуха для анализа ДНК, грибковых

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56730

⸱

2 мая 2018 г.

 ,  , 
1Allergy and Clinical Immunology Branch, Health Effects Laboratory Division, National Institute for Occupational Safety and Health, Centers for Disease Control and Prevention

В этой статье

Краткое содержание

Определение грибковых разнообразия в среде — это метод, используемых в профессиональных медицинских исследований для выявления опасностей для здоровья. Этот протокол описывает экстракции ДНК от профессиональных воздуха образцов для амплификации и последовательности грибковых ее регионов. Этот подход обнаруживает много грибковых видов, которые могут быть пропущены методами традиционной оценки.

Аннотация

Традиционные методы выявления грибковых облучения профессиональных средах, таких как культуры и подходы на основе микроскопии, имеют некоторые ограничения, которые привели к исключению многих видов. Достижения в области за последние два десятилетия привели исследователей гигиены обратиться к молекулярной основанные подходы для выявления грибковых опасностей. Эти методы привели к выявлению многих видов в крытый и производственной среды, которые не были обнаружены с использованием традиционных методов. Этот протокол детали подход для определения грибковых разнообразия в воздухе образцы через геномной ДНК добычи, усилители, последовательности и таксономической идентификации грибковых внутренней трансляции распорку (СТС) регионах. ЕГО результаты секвенирования в обнаружении многих грибковых видов, которые не обнаружены или трудно определить на уровне видов, с использованием культуры или микроскопия. Хотя эти методы не обеспечивают количественные показатели грибковых бремени, они предлагают новый подход к идентификации опасностей и может использоваться для определения общей видовое богатство и разнообразие в профессиональной среде.

Введение

Грибковые облучения в крытый и производственной средах может привести к респираторных заболеваний, включая аллергической сенсибилизации и астмы1. Определение опасностей, грибковых имеет важное значение для оценки рисков и предотвращение воздействия на работников. Эти грибковых опасности может быть результатом крытый заражения, проникновения наружного воздуха или экологические нарушения, которые приводят к перевозки грибковых материалов в районы, где работники являются настоящей2. Методы оценки воздействия грибковых включали выборки жизнеспособных культуры, а также микроскопические идентификация грибковых спор. Эти подходы имеют несколько ограничений и часто упускаем многие грибковых видов, которые могут способствовать общей грибковая бремя3. Подходы, основанные на культуру можно только дифференцировать эти жизнеспособных грибковых организмов, которые можно выращивать на питательных средах. Выявления грибковых спор до уровня видов через микроскопии могут быть confounded, споры, обмена аналогичными морфологии. Оба метода являются сильно зависит от микологи для анализа и выявления грибковых видов, с многих оставшихся неизвестными.

Для улучшения существующих методологий, используемых в профессиональных рисков идентификации и оценки воздействия, многие исследователи обратились к молекулярно-технологий. Подходы на основе виртуализации для оценки микробного разнообразия в крытый и профессиональной среде выявили широкий спектр плесневые столкнулись по сравнению с методами микроскопии и жизнеспособной культуры3,4 ,5. Метод, представленный здесь описывает отбор проб воздуха профессиональной среды и извлечение геномной ДНК для идентификации потенциальных опасностей грибковые. Идентификация опасности осуществляется путем виртуализации ядерной рибосомных внутренней трансляции распорка, или ее, регионы, которые сильно варьируется среди грибов и часто используются для различения плесневые6,7, 8,9. Многие виды найдены в профессиональной настройки, такие, как некоторые виды, принадлежащие к типу Базидиомицеты, не поддаются в жизнеспособные культуре и трудно дифференцировать микроскопически. Эти грибы были отмечены в высокое относительное изобилие в крытый и профессиональной среды, оценку последовательности грибковых ее регионы3,4,10. ЕГО виртуализации предоставляет больше знаний в разнообразие грибов, возникших в крытый и профессиональной среде.

Протокол описанные здесь методы, используемые для сбора, извлекать и усилить грибковых ее регионов от биоаэрозоли для анализа последовательностей детали. Этот подход использует Национальный институт профессиональной безопасности и здоровья (NIOSH) две ступени циклонов аэрозоля сборники для сбора твердых частиц в воздухе. Этот сборник был разработан для сбора биоаэрозоли и отдельный вдыхаемых (аэродинамический диаметр ≤4 мкм) и не вдыхаемых (> 4 мкм аэродинамический диаметр) частицы, которые позволяет для выявления грибковых организмов в пределах помещений, которые являются наиболее скорее всего быть вдыхании работника11. Другие пробоотборники воздуха, включая циклон пробоотборники, доступны на рынке, имеют возможность собирать частицы в вдыхаемых диапазоне (< 4 мкм) с помощью фильтров12,13. В противоположность этому сборники аэрозоля-двухступенчатый циклон NIOSH отделяет грибковых видов, основанный на их аэродинамический диаметр в одноразовые, полипропиленовые трубы, которые могут быть немедленно обработаны для нисходящие приложения14.

Процессы извлечения геномной ДНК и усиливая грибковых регионах ее подробно изложены в настоящем Протоколе. Извлечения представлены были разработаны методологии специально для извлечения геномной ДНК от грибков и бактерий, как многие коммерческие наборы целевой mammalian клеток, бактерии или специально дрожди15. Грунты, используемые в данном исследовании отбираются на основе их общий охват грибковых ее 1 и 2 ее регионов4,5. Последовательность этих регионов позволяет сравнивать многих накренился ее последовательностей, включая те, что последовательность ее 1 региона, ее 2 региона или в ее 1 и 2 ее регионах. Грибковые разнообразие проб воздуха, собранных в крытый настройки с помощью приведены эти методы, выявить значительное число последовательностей, типы, облеченных микологии и микологии, а также другие последовательности, принадлежащих к менее доминирующим грибковых типы, такие как Отдела зигомицетов. Широкое разнообразие грибковых последовательности, определенные с помощью этого подхода будет не захвачен с помощью методологии идентификации традиционные опасности как культивирование или микроскопии. Секвенирования грибковых ее регионов обеспечивает метод расширения для выявления грибковых опасностей и позволяет для лучшего понимания воздействия крытый и профессиональных грибковых.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка NIOSH аэрозоля сборники

Примечание: Сборники аэрозоля NIOSH является сборники аэрозоля две ступени циклонов, который собирает биоаэрозоли с помощью двух труб выборки и фильтр из политетрафторэтилена (ПТФЭ).

  1. Перед Ассамблеей внимательно осмотрите сэмплер. Проверьте сэмплер, чтобы убедиться, что он не поврежден, все винты находятся на месте и уютно и уплотнительной ленты вокруг шов формируется две половинки нетронутыми. Осмотрите сборники уплотнительное кольцо, чтобы убедиться, что он не имеет каких-либо вмятин, трещин или слезы и что он имеет очень тонким слоем силиконовой смазки.
    Примечание: Сэмплер включает в себя 37 мм 3 мкм PTFE фильтр в полистироловые или полипропиленовые трехсекционный фильтр кассетный.
    1. Соберите Кассетный фильтр, поместив целлюлозы или пластиковый фильтр поддержки пеленального (с фильтрами) на решетчатой поверхности базового образца (см. Рисунок 1). Используете фильтр щипцы поставить фильтр на верхней части фильтра площадку поддержки коллекции стороной вверх.
    2. Уплотнение кассеты фильтра, с помощью ручной или Пневматический пресс. Рука закрытие позволит воздух течь вокруг фильтра и уменьшить эффективность. Вставьте кольцевой кусок (капот расширения) и использовать прессу для протолкните его вниз, плотно и равномерно. Нажмите вниз капот расширения на фильтр достаточно плотно, чтобы убедиться, что воздух не протекает вокруг фильтра.
      Примечание: Верхняя часть кассеты не используется во время выборки, но должен быть сохранен для покрытия фильтр после завершения отбора проб.
    3. Установите собранный кассеты на вершину сэмплер и протолкните его вниз, насколько это возможно. Оберните кусок ленты 19 мм (3/4 дюйма) вокруг внешней Кассетный фильтр и сборники провести Кассетный фильтр на место и выступать в качестве резервного копирования уплотнение для предотвращения утечек.
    4. Ввинтите каждую пробирку плотно и полностью в сборники до тех пор, пока она днища и оберните лентой вокруг каждой трубы в качестве вторичного уплотнения против утечки.
      Примечание: Первый трубки, 15 мл полипропиленовые трубы, собирает не вдыхаемых частиц с аэродинамическим диаметром > 4 мкм. Второй трубы, Трубы полипропиленовые microcentrifuge 1,5 мл, собирает вдыхаемых частиц между 1 и 4 мкм. Оставшиеся мелкие частицы, < 1 мкм, собраны на PTFE фильтр (см. Рисунок 2).
  2. Калибровка потока воздуха через NIOSH сборники с банкой калибровки перед каждым использованием, как различия в фильтры и пробоотборники вызовет поток воздуха меняться.
    1. Чтобы использовать калибровки jar, вставьте кувшин Luer фитинга в верхней части Кассетный фильтр, место сэмплер в банку и печать банку.
    2. Подключите калибровки jar расходомер калибровки и насос для отбора проб. Включите расходомер и позволить ему теплый на несколько минут. Обратите внимание, что расходомер всегда должна иметь фильтр прилагается к его входе чтобы избежать загрязнения расходомер и сэмплер.
    3. Включите насос для отбора проб и позволить ему баллотироваться на несколько минут, чтобы согреться и стабилизации.
    4. Регулировка насоса для задания правильного потока на 3,5 Л/мин.
      Примечание: Скорость потока для аэрозоля сборники NIOSH обычно присваивается 3,5 Л/мин. На этой скорости потока сэмплер соответствует критериям ACGIH/ISO вдыхаемых частиц выборки16. Другие скорости потока может использоваться, если размеры различных отсечения желательны или уменьшить уровень шума, но следует знать, что если используется другой расхода, то пробоотборник будет больше не соответствуют вдыхаемых выборки критериям.
    5. Когда калибровка закончена, отключите насос и расходомер.

2. статические и личные аэрозольных проб

  1. Настройка NIOSH аэрозоля пробоотборник для отбора проб либо личных или статической области.
    Примечание: Статические выборки относится к с помощью аэрозоля сборники, пока он присоединен к штатив или другое устройство Холдинг (см. рис. 3), как против личной выборки при сборники и насос монтируются на человека изучается (см. Рисунок 4).
    1. Для статических территориальной выборки, держите изучается пробоотборники как можно ближе к конкретной области. Держите пробоотборники от воздухозаборников, номер входов и места, которые могут быть на пути воздушного потока.
      Примечание: Концентрации аэрозолей может значительно изменяться даже на короткие расстояния, особенно если источник аэрозоля в номер17.
    2. Для личного выборки, настроить сборники в зоне дыхания человека. Прикрепите сэмплер отворот, плечо или грудь и поместите насос отбора проб на талии или в рюкзаке.
      Примечание: В зоне дыхания обычно считается 30 см полушария, окружающих человека нос, из которой будет нарисована большинство воздуха во время ингаляции17.
  2. Убедитесь, что сборники трубы хорошо очищают от заливов сборники и что ничто не препятствует заливов или вмешательства с воздуха в сборники. Сборники трубки должны не пережат или сильно перегнут. Любые блокировки вызовет насос, чтобы остановить.
  3. Включите насосы. Через минуту или две проверьте, если насосы по-прежнему работает.
    Примечание: Проведение воздуха выборки для периодов времени, начиная от как мало, как 10 мин до полного 8 h рабочей смены, в зависимости от окружающей среды10,18,19. Результаты представлены на рисунке 6 , представитель в течение 60 мин выборки в помещении.
  4. После завершения отбора проб воздуха, собирайте образцы труб и фильтров. Удаление Уплотнительная лента, отвинтить трубы и ограничить их. Поместите третья часть фильтр кассетный фильтр. Хранить образцы на 4 ° С до готовности для обработки.

3. Добыча геномной ДНК от пробы воздуха

  1. Извлечь из каждого этапа NIOSH BC251 сборники геномной ДНК (геномная ДНК). Обработки воздуха, выборки коллекции трубок и отдельно фильтрации для определения вдыхаемых и не вдыхаемых микробной аэрозолей в образце.
    Примечание: в качестве альтернативы, трех этапов можно комбинировать и извлечены, если образец посевным материалом слишком мал.
    1. В классе II биологической безопасности кабинета или ламинарного потока чистого скамейке асептически удалите фильтр. Протрите кассеты выборки с использованием 70% этанола и подглядывать выборки кассеты открыть с помощью инструмента кассеты открытие. Используйте фильтр стеклоподъёмника нажать панель фильтра и поддержка вверх. Понять фильтр с помощью фильтра щипцами и поместите его в стерильных Петри. Cut фильтр на 6 равных частей и поместите их в 2 мл усилены тубы 300 мг стеклянные бусины (0,2 - 0,5 мм).
    2. Поместите трубку, содержащую фильтр в жидком азоте для 30 s и сразу же поместить его в шарик мельница гомогенизатор на 4,5 м/с для 30 s.
    3. Повторите шаг 3.1.2 один или два раза, до тех пор, пока фильтр измельчается. Небольшие кусочки нетронутыми фильтра могут оставаться. Добавьте 0,5 мл буфера lysis (4 M мочевины, 200 мм трис, 20 мм NaCl, 200 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), рН 7,4).
    4. Добавление 0,3 мл буфера lysis 15 мл и 1,5 мл воздуха сборники трубы. Вихревой трубе для 10-15 s при вертикальном положении и затем еще 10-15 s перевернутой. Передавать содержимое каждой трубы армированные 2 мл пробирки, содержащие 300 мг стеклянные бусины.
      Примечание: Большинство материалов, собранных в каждой тюбике сборники будут накапливаться в верхней части трубки.
    5. Обрабатывать все трубы в гомогенизатор мельница шарик, 4.5 м/с для 30 s и центрифуги их на 20000 x г за 1 мин в 22 ° C. Передача supernatants стерильные 1,5 мл microcentrifuge трубы и центрифуги трубы на 20 000 x g снова за 1 мин в 22 ° C. Повторите этот шаг.
  2. 30 мкл Реагента лизис (см. Таблицу материалы), для каждой трубки и инкубировать трубы при 37 ° C 15 мин.
  3. Добавить 0,2 мл буфера привязки (мочевины 10 М, 6 М гуанидина HCl, 10 мм трис-HCl, 20% Тритон X-100, рН 4,4) и протеиназы K (100 мкг/мл) для каждой трубки и инкубировать трубы при 70 ° C для 10 минут добавить 100 мкл изопропанола для каждой трубы.
  4. Передача решения экстракт в стеклянные волокна фильтра трубки (вместимость 700 мкл) помещены в 2 мл коллекции трубок и центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок 2 мл.
  5. Добавить 0,5 мл ингибитор удаления буфера (5 M гуанидина HCl, 20 мм трис-HCl, рН 6,6, 38% этиловом спирте) к каждой пробке и центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок 2 мл.
  6. Добавить 0,5 мл буфера мытья (20 мм NaCl, 2 мм трис-HCl, pH 7.5, 80% этиловом спирте) к каждой пробке и центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок 2 мл. Повторите этот процесс.
  7. Центрифуга для коллекции трубок на 20000 x g для дополнительного 1 мин при 22 ° C, чтобы удалить любые остаточные мыть буфера. Отменить коллекции трубок и поместить фильтр трубы в новой коллекции трубок.
  8. Добавить 100 мкл теплый (≥70 ° C) Элюирующий буфер (10 мм трис-HCl, рН 8,5) к каждой пробке и инкубировать их при комнатной температуре на 1-2 мин центрифуги коллекции трубок на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C. Передать пробки microcentrifuge стерильные 1,5 мл трубки пустой фильтр и повторно применить элюаты из шага 3.8. Инкубации при комнатной температуре на 1-2 мин центрифуги на 20000 x g за 30 сек при 22 ° C.
    Примечание: Элюаты может использоваться непосредственно для шага 4 или хранимой в-20 ° C до готовой к использованию. Геномная ДНК может храниться до одного года при-20 ° C. Рекомендуется, что ДНК храниться при температуре-80 ° C, при необходимости длительного хранения.

4. усиление грибковых рибосомной ДНК

  1. Используйте универсальные грибковых грунтовки для того чтобы усилить ее регионов 1 и 2 от извлеченного геномная ДНК.
    Примечание: Для этого протокола, грунтовка пары Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') используются для предоставления наибольший охват ее регионов4,5. Другие наборы грунт, например те, которые усиливают ITS1 или ITS2 регионов в одиночку, может использоваться.
    1. Настройка полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждого образца, в трех экземплярах 50 мкл реакциях в стерильных 0,5 мл ПЦР трубы или 96-луночных ПЦР планшетов следующим образом: 5 мкл извлеченный шаблон ДНК (шаг 3), 33.3 мкл воды класса PCR, 5 мкл 10 x PCR буфера , 1,5 мкл 50 мм MgCl2, 1 мкл 10 мм 2'-deoxynucleoside 5'-трифосфатов, 0.5 мкл 20 мкм Fun18Sf вперед грунт, 0.5 мкл 20 мкм ITS4R обратный грунтовки и 0,2 мкл полимеразы дна Taq .
    2. Выполняют реакции в тепловой циклователь: Денатурация при 95 ° C 3 мин; 6 циклов денатурации (96 ° C, 30 s) отжига (50 ° C, 45 s) и выдвижение праймера (72 ° C, 3 мин); 20 циклов денатурации (96 ° C, 30 s), отжига (50 ° C, 45 s) и выдвижение праймера (72 ° C, 1 мин); и выдвижение праймера на 72 ° C для 10 min. держать реакция смеси при температуре 4 ° C до следующего шага.
  2. Комбинат, что тройные ПЦР-реакции очистить, используя комплект для очистки на основе мембранных кремнезема.
    Примечание: Эта процедура позволяет для удаления компонентов ПЦР (грунты, дНТФ, ферменты, соли, и т.д.) и других загрязняющих веществ от амплифицированного ДНК препаратов.
    1. Объединить три реакции для каждого образца (всего 150 мкл) в стерильных 1.5 мл пробирок microcentrifuge. Добавление привязки буфера (5 M гуанидина HCl, 30% изопропиловый спирт) в объеме 5 x (750 мкл) и перемешать раствор, закупорить вверх и вниз по десять раз.
    2. 450 мкл смеси спина столбцов в коллекции трубок и центрифуги трубы на 17 900 x g для 30 s. отменить фильтратами. Добавить оставшиеся 450 мкл столбцы и центрифуги на 17 900 x g для 30 сек при 22 ° C.
      Примечание: Спина столбцы содержат кремний мембраны, которая позволяет для адсорбции ДНК в столбцы.
    3. Отменить фильтратами и добавьте 750 мкл Отмывающий буфер (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 80% этиловом спирте) счетчик столбцов. Центрифуга для столбцов в 17 900 g x 30 сек при 22 ° C.
      Примечание: Этот процесс удаляет примеси из реакции PCR, упомянутых выше.
    4. Отменить фильтрата и центрифуги пустые столбцы в 17 900 x г за 1 мин в 22 ° C.
      Примечание: Этот шаг заключается в удалении любых остаточных отмывающего буфера, который может вмешиваться в нисходящие приложения.
    5. Передать стерильные 1.5 мл пробирок microcentrifuge спин столбцы. 45 мкл буфера (10 мм трис-Cl, рН 8,5) и инкубировать трубы при комнатной температуре на 5 мин центрифуги спин столбцы в 17 900 x г за 1 мин в 22 ° C.
    6. Сразу использовать eluted дна для шаги 4 и 5 или хранить при температуре от-20 ° C до готовности для использования.
      Примечание: Ампликонов может храниться до одного года при-20 ° C. Рекомендуется, что ДНК храниться при температуре-80 ° C, при необходимости длительного хранения.

5. Проверка грибковых его усиления, с помощью электрофореза геля агарозы

  1. Литой агарозы 1% гель, содержащий 1 бромид ethidium мкг/мл. Растворите агарозы в кипящей 1 x буфер Tris ацетат ЭДТА (ТЭ). После того, как раствор остынет до примерно 50 ° C, добавьте бромид ethidium и вылить в гель бросили.
  2. После затвердевшим геля агарозы, погружать гель в 1 x TAE и подготовить ампликонов загружаться на геле. До 8 мкл амплифицированного ДНК 2 мкл 5 x загрузки буфера.
    Примечание: Эти тома может быть скорректирована в зависимости от концентрации желаемого загрузки буфера.
  3. Загрузите образцы, все 10 мкл, на гель наряду с ДНК лестница для размера ссылкой. Побегите гель на 75 V (6 V/см) для примерно 90 мин и визуализировать полос, обычно наблюдается между 750 и 1000 пар оснований, с использованием ультрафиолетового света (см. Рисунок 5).

6. последовательность и анализ грибковых ее регионов

  1. Последовательность извлеченные геномная ДНК или усиленные грибковых ее регионов и анализировать последовательности, используя текущий и соответствующие методы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Распределение видов в среде может быть оценена с помощью относительного изобилия, определяя количество клонов каждого OTU, определенных в пробах воздуха. Рисунок 6 -крона единицы, представляющие таксономически размещены видов в помещении после 60 мин отбора проб воздуха. Можно отметить, что среда содержит целый ряд видов в рамках двух основных грибковых типы, микологии и микологии, а также виды, принадлежащие к типу отдела зигомицетов (патогену microsporu...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Определение грибковых разнообразия в профессиональной среде, используя подходы, основанные на последовательности улучшилась идентификации и воздействия оценки грибковых опасности. Используя этот подход позволил для выявления многих дополнительных грибковых видов, которые часто не обнаруживаются с помощью культуры или микроскопия основе методов оценки. Здесь представлен метод отбора проб биоаэрозоли от профессиональных и крытый сред и добыча геномной ДНК из проб воздуха для его усиления и последовательности. Сильно зависи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают официальную позицию национального института профессиональной безопасности и здравоохранения, центры по контролю и профилактике заболеваний.

Благодарности

Эта работа частично поддержали межведомственного соглашения между NIOSH и NIEHS (AES12007001-1-0-6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробоотборник биоаэрозольного циклона NIOSH BC251BC251Пробоотборник NIOSH еще не поступил в продажу. Пожалуйста, свяжитесь с Уильямом Линдсли, доктором философии (wlindsley@cdc.gov) для получения пробоотборника NIOSH
Стерильные микроцентрифужные пробирки Fisherbrand с завинчивающимися крышкамиFisher Scientific02-681-3731,5 мл полипропиленовые микроцентрифужные пробирки для отбора проб воздуха; резьба завинчивающейся верхней резьбы должна совпадать с резьбой пробоотборника NIOSH
Конические центрифужные пробиркиNIOSH Corning35209615 мл полипропиленовые пробирки для отбора проб воздуха
Виниловая лента для чистой комнаты, легко снимаемая, ширина 1/4 дюймаMcMaster-Carr76505A1уплотнительная лента
Фильтрующая кассета, прозрачный стирол, 37 ммSKC Inc.225-3LF3-компонентная кассета для отбора проб (без фильтра). Содержит: кассетное основание, удлинительный кожух, кассетную крышку и входные/выходные пробки,
гидрофторные мембранные фильтры из ПТФЭ, 3.0 и микро; m, 37 ммEMD MilliporeFSLW03700Содержит: 37 мм, 3.0 &; m Фильтры из ПТФЭ и поддерживающие накладки
Фильтрующие щипцы FisherbrandФильтрующие щипцыFisher Scientific09-753-50
Модель 502 Precision PanaPressPanaVise502пневматический кассетный пресс изготовлен из этого прецизионного пресса для оправки
Scotch Super 33+ виниловая изолентаMcMaster-Carr76455A2119 мм лента
Многоцелевая калибровочная банка, большаяSKC Инк.225-112калибровочный стакан
универсальный PCXR4 насос для отбора пробSKC Inc.224-PCXR4Насос для отбора
проб Массовый расходомер 4140TSI Inc.Расходомер4140
Roche High Pure PCR Template KitRoche Diagnostics11796828001Kit используется для экстракции геномной ДНК. Содержит: Лизисный буфер, Связывающий буфер, Протеиназу К, Буфер для удаления ингибитора, Промывочный буфер, Буфер для элюирования, Фильтрующие пробирки из стекловолокна и пробирки для сбора 2 мл
Fisherbrand 2 мл Армированные полипропиленовые винтовые пробирки с крышкамиFisher Scientific153401622 мл армированные пробирки для гомогенизации бусин
Стеклянные бусины, промытые кислотой, 212-300 & микро; mSigma-AldrichG1277стеклянные бусины
Fisher Scientific Bead Mill 24 ГомогенизаторFisher Scientific15-340-163гомогенизатор
гранул CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10XSigma-AldrichC8740лизис реагент
Platinum Taq полимеразаInvitrogen10966-018Содержит: Platinum Taq polymeraza, 10X PCR буфер (без MgCl2), 50 мМ MgCl2, KB Extender
dNTP MixInvitrogen18427-08810 мМ dNTP mix
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106Набор используется для очистки грибковых ампликонов. Содержит: Buffer PB (связывающий буфер), Buffer PE (промывочный буфер), Buffer EB (буфер для элюирования), краситель для индикатора pH (опционально) и нагрузочный краситель
GelPilot Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis SystemThermo FisherB1 или B2
TrackIt 1 KB Plus DNA LadderThermo Fisher10488-085DNA Ladder
Пробоотборник NIOSH

Ссылки

  1. Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
  2. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
  3. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
  4. Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
  5. Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
  6. Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28(2005).
  7. Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
  8. Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629(2014).
  9. Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863(2012).
  10. Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
  11. Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
  12. Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
  13. Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308(2015).
  14. Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
  15. Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
  16. ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
  17. Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
  18. Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
  19. Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
  20. Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
  21. Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
  22. Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189(2010).
  23. Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
  24. Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

occupational air samplingNIOSHITS

Похожие статьи