Методическая статья

Блот Assay количественных Dot для AAV титрования и его использования для функциональной оценки аденоассоциированный вирус Ассамблеи-активации белков

DOI:

10.3791/56766

⸱

12 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись подробности блот assay просто точка для количественный титры аденоассоциированный вирус (AAV) и ее применение для изучения роли Ассамблеи активации белков (ГПД), Роман класса неструктурных вирусных белков, обнаруженных в всех AAV серотипов, в деле содействия Ассамблее capsids, производные от родственных и гетерологичных AAV серотипов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя аденоассоциированный вирус (AAV) широко признается как вектор привлекательным для генной терапии, она также служит вирус модель для понимания биологии вируса. В последнем случае недавнее открытие неструктурных AAV белка, называют Ассамблеи активация белка (AAP), пролили новый свет на процессы в Ассамблее вирусного капсида VP белков в капсида. Хотя многие AAV серотипов требуют AAP для Ассамблеи, мы недавно сообщили что AAV4, 5, 11, и исключения из этого правила. Кроме того мы показали, что ГПД и собрал capsids различных серотипов локализации для различных внутриклеточных отсеков. Этот неожиданный гетерогенность в биологических свойств и функциональной роли ГПД среди различных AAV серотипов подчеркивает важность исследований по ГПД, полученных от различных серотипов. Эта рукопись подробности блот assay просто точка для AAV количественный и ее применение для оценки AAP зависимостей и серотип специфичность в Ассамблее капсида. Чтобы продемонстрировать полезность этот assay блот точка, мы отправились в характеризуют капсид Ассамблеи и АПУ зависимость змея AAV, ранее uncharacterized рептилий AAV, а также AAV5 и AAV9, которые ранее было показано, быть AAP-независимые и зависимые от АПУ серотипов, соответственно. Assay показали, что змея AAV капсид Ассамблея требует AAP змея и не может поддерживаться ГПД от AAV5 и AAV9. Assay также показал, что, в отличие от многих общих Серотипа ГПД, способствующих гетерологичных капсид Ассамблеи по кросс комплементарности, змея АПУ не поощрять Ассамблея AAV9 capsids. Кроме того мы показываем, что выбор нуклеиназы значительно влияет на индикации пробирного блот точка, и таким образом, выбор оптимального фермента имеет решающее значение для успешной оценки AAV титры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденоассоциированный вирус (AAV) является небольшой, не охватило, одноцепочечной ДНК вируса с геном приблизительно 4,7 kilobases (КБ). AAV геном содержит фреймы (ORFs) открыть чтение для генов rep и Кап . В 2010 году ранее неизвестные неструктурных белков, кодируемых + 1 кадра смещается ORF внутри ген AAV2 колпачок был обнаружен Sonntag et al. и играть решающую роль в Ассамблее AAV2 капсид VP мономера белков в Вирусный Капсид1. Ассамблея активация белка (AAP) был назван этот роман белок той роли, которую она играет в содействии капсид Ассамблея1.

ORFs для АПУ были определены bioinformatically в геномах всех parvoviruses в рамках род Dependoparvovirus, но не геномов вирусов различных родов парвовирус семьи1,2. Функциональные исследования этого романа белка первоначально были сосредоточены на АПУ от прототипа AAV2 (AAP2), которая создала важную роль AAP2 в ориентации разобранном виде VP белки ядрышко для их накопления и формирования в полностью собрал capsids1,3,4. AAV2 capsids неспособность собрать в отсутствие AAP выражения был независимо подтверждены несколько групп, в том числе наш1,2,3,4,5 . Последующие исследования на AAV серотипы 1, 8 и 9 подтверждают решающую роль ГПД в Ассамблее капсида, как VP3 мономера белки AAV1, 8, и 9 были не в состоянии сформировать полностью собранный капсида в отсутствие совместного выражения AAP2.

Недавно, через подходов, которые включают в себя использование количественных точка помаркой анализов, мы исследовали способность AAV1 12 VP3 мономеров собрать в capsids в отсутствие экспрессии АПУ и способность AAP1 до 12 для содействия Ассамблее VP3 мономеров из гетерологичных серотипов. Это исследование показало, что AAV4, 5 и 11 VP3 мономеров могут собираться без АПУ. Кроме того, было установлено, что восемь из двенадцати ААР серотипов, мы рассмотрели (то есть, все, кроме AAP4, 5, 11 и 12) отображаются широкие возможности для поддержки капсид Ассамблеи гетерологичных AAV серотип capsids, а AAP4, 5, 11 и 12 отображается существенно ограниченные возможности в этой связи6. Эти четыре серотипов филогенетически далеких от других AAP серотипов2,3. Кроме того исследования обнаружили значительную гетерогенность в субцеллюлярные локализации различных ГПД6. Кроме того, исследование показало, что плотный ассоциации АПУ с собрал capsids и ядрышко, отличительной чертой AAV2 капсид Ассамблеи, обязательно не может распространяться на другие серотипы, включая AAV5, 8 и 9, которые отображают ядрышковые исключение собрал capsids6. Таким образом информация, полученная от изучения любого конкретного серотип АПУ не широко применимо для всех AAP биологии. Такие загадочные характер AAP биологии подчеркивает необходимость изучить роль и функции каждого АПУ от канонического и неканонических AAV серотипов.

Биологическая роль АПУ в Ассамблее капсид может оцениваться путем определения титры полностью упакованы AAV вирусных частиц производится в человеческих эмбриональных почек (ГЭС) 293 клетки, наиболее часто используемых клеточная линия для производства вектора AAV, с или без белка АПУ выражение. Стандартные методы для AAV количественный являются количественного PCR (ПЦР)-7,на основе анализов8 и количественные точка на основе блот assays9. Другие методы для AAV вирусных частиц количественный например иммуноферментного анализа10,11 или измерения оптической плотности12 не являются идеальными для образцов, полученных от многих различных серотипов AAV или образцов загрязненные примесей (сырой лизатов или культуры средств массовой информации), которые часто образцов, используемых для AAV исследований. В настоящее время ПЦР наиболее широко используется для AAV количественный; Однако это необходимо признать возможных предостережений на основе ПЦР анализа, как assay может привести к системной ошибки и титр значительные вариации13,14. На основе ПЦР анализов страдают от ряда потенциально привходящих факторов, таких как присутствия ковалентно закрытых терминала заколки в PCR шаблоны, которые тормозят амплификации13. Даже опытный человек может ввести потенциал отягощающих факторов на основе ПЦР анализа неосознанно13. В отличие от количественных точка анализов помаркой являются метод классической молекулярной биологии, который не включает амплификацию генома и использует гораздо проще принцип с минимальным риском ошибок по сравнению с на основе ПЦР анализов. Этот метод является менее технически сложной; Таким образом результаты анализа достаточно воспроизводимости даже неопытными лицами.

В настоящем докладе мы описываем методологические детали анализа помаркой количественной точки, мы обычно используем для вектора AAV количественный и являют собой пример, как применять пробу для изучения роли Ассамблеи содействие ГПД в общем серотипов (AAV5 и AAV9) и ранее uncharacterized АПУ от змея AAV14. В природе Аав VP белков и АПУ белки выражаются в СНГ от одного гена (то есть, VP-АПУ СНГ дополнения), а в assay, описанные здесь, вице-президент и АПУ белки поставляются в транс от двух отдельных плазмид (т.е., VP-АПУ Транс дополнения). Поскольку каждый VP или АПУ белка из различных серотипов может быть выражена от каждого независимого плазмида, становится возможным проверить гетерологичных VP-АПУ сочетания капсид сборки (то есть, VP-АПУ кросс дополнения). Кратко AAV VP3 из различных серотипов выражается в клетках ГЭС 293 плазмида ДНК трансфекции пакет генома вектора AAV в наличие или отсутствие родственных серотипа АПУ, или в присутствии гетерологичных серотип АПУ. После производства культуры средств массовой информации и lysates клетки подвергаются блот пробирного точка для количественного определения вирусного генома в оболочке капсида. Первый этап анализа помаркой точка является для лечения образцы с нуклеиназы удалить загрязняющие плазмида ДНК и неупакованных AAV геномов в образцах. Неспособность сделать это приведет к увеличению сигналов фона в частности когда assayed неочищенную образцы. Затем следуют протеазы лечения вирусных capsids и выпустить нуклеиназы стойкие вирусных геномов в образце решения. Далее, вирусных геномов денатурированный, смыл на мембрану и гибридизированных с зондом вирусной ДНК генома специфичные для количественный. В примере assay сообщили здесь мы показываем, что змея AAV VP3 требует змея AAP капсид Ассамблеи и что змея АПУ не содействовать Ассамблее AAV9 capsids в отличие от многих ГПД, производный от АПУ зависимых серотипов, которые могут также содействовать Ассамблее гетерологичных серотип capsids. Наконец мы сообщаем важное предостережение для ПЦР или точка на основе блот AAV количественный assays, что выбор нуклеиназы существенно влияет на результаты анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: В таблице 1приводятся рецепты для решения и буферов, необходимых для этого протокола. Для assay блот VP-АПУ кросс дополнения точка для изучения роли AAP белков в Ассамблее капсид протокол, описанные ниже. Метод для более общий Блот assay количественных точка для очищенного титрования вектора AAV объясняется в разделе Представитель результаты .

1. Строительство VP3, АПУ и AAV2 Rep, выражая плазмиды

  1. Строительство pCMV-AAVx-VP3 (x = серотипов)
    1. ПЦР усиливают весь VP3 ORF (1.6 КБ) с использованием высокой верности ДНК-полимеразы и следующая пара грунтовка: VP3 вперед, CTAA-RE1-CACC-N25 (первые 25 нуклеотидов VP3 ORF); VP3 обратный, TCTT-RE2-N25 (последние 25 нуклеотидов VP3 ORF).
      Примечание: RE1 и RE2 являются сайты для ферментов (REs) ограничения для клонирования. CTAA и TCTT являются терминал 5' и 3' tetranucleotides, добавлены для облегчения пищеварения энзима ограничения в конце двуцепочечной ДНК. CACC представляет собой последовательность Козак консенсуса.
    2. Клон продукты RE-digested PCR между соответствующими RE сайты вектора млекопитающих выражение, использующее человека цитомегаловирус немедленно ранний (ЦМВ-IE) усилитель промоутер для высокого уровня выражения.
      Примечание: Для молекулярного клонирования, дайджест 5 мкг ДНК плазмиды позвоночника с restriction enzyme(s) при концентрации 4 U/мкг ДНК за 1 ч при оптимальной температуре. Для ПЦР фрагментов увеличьте единицы ферментов используются (например, 10 U/мкг продукта VP3 ORF PCR 1.6 КБ) и длиннее время инкубации (например, 4 ч) за счет увеличения числа сайтов признание энзима ограничения на единицу длины. Полезная информация в молекулярной биологии ферментов и клонирования процедур, включая бактериальные преобразований можно найти в других15,16,17.
  2. Строительство pCMV флаг-AAPx (x = серотипов)
    1. ПЦР усиливают весь ORF AAP (0,6 КБ) за исключением первого аминокислота с использованием высокой верности ДНК-полимеразы и следующая пара грунтовка: АПУ вперед, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (25 нуклеотидов от 4 нуклеотидов в AAP ORF); AAP обратный, TCTT-RE2-N25 (последние 25 нуклеотидов AAP ORF).
      Примечание: GACTACAAGGACGACGATGACAAA коды тег флаг, который было показано, имеют пагубные последствия4,5 , но может быть опущен, если ненужным.
    2. Клон продукты RE-digested PCR между соответствующими сайтами млекопитающих выражение вектора с ЦМВ-IE усилитель промоутер15,16,17.
  3. Строительство pHLP-Rep
    1. Digest 5 мкг плазмида pAAV-RC2 (7.3 КБ) с 20 единиц каждого Xho я и Xcm и очистить с помощью коммерческих комплект очистки ДНК ДНК или экстракцией фенола и хлороформа.
      Примечание: Удаление 1.8 kb Xho я-Xcm которую я отрывок из 7.3 КБ pAAV-RC2 плазмида приводит к потере экспрессии белков капсид VP при сохранении Rep белков.
    2. Тупой ДНК заканчивается 6 единиц T4 ДНК-полимеразы, агарозы гель Очистить фрагмента ДНК 5,5 КБ и самостоятельно перевязать очищенный фрагмента, используя 50 до 100 нг ДНК и 400 единиц T4 ДНК лигаза согласно производителя рекомендации15.
    3. Следуйте процедуре стандартных бактериальных преобразование ссылаться на шаге 1.1.2 Примечание.
  4. Убедитесь, что плазмидные конструкции Пищеварение энзима ограничения и секвенирования15,18.
  5. Выполните плазмида minipreps или maxipreps, с помощью коммерчески доступные наборы получить достаточное количество плазмидной ДНК для вниз по течению AAV производства экспериментов.

2. производство AAV в ГЭС 293 клеток путем плазмида ДНК Transfection (кросс дополнения проба)

  1. Культура клетки 293 ГЭС в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM)-высокая глюкозы (4,5 г/Л) дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллина и стрептомицина микс и 1 мм L-глютамином, 37 ° C инкубатор с 5% двуокиси углерода (CO2).
    Примечание: Аав титры значительно варьироваться в зависимости от источника ГЭС 293 клеток.
    Предостережение: Хотя AAV могут быть обработаны на биобезопасности уровня 1 (BSL1) сдерживания, BSL2, сдерживания рекомендуется для работы ГЭС 293 клеток.
  2. День -1 (24 ч до трансфекции), плита 6 – 7 x 105 293 ГЭС клеток/колодец в 2 мл полной среды, описанные в шаге 2.1 в знаке 6-хорошо. Это обычно достигает ~ 90% confluency следующий день.
  3. День 0: Transfection
    1. Подготовка к трансфекции ДНК
      1. Убедитесь, что клетки достигли confluency ~ 90%.
      2. Разминка DMEM дополнен с 1% пенициллина и стрептомицина Mix и 1 мм L-глютамином, но без 10% FBS (т.е., сыворотка бесплатно средних) в ванну воды 37 ° C.
      3. Дайте раствору polyethylenimine (PEI) до комнатной температуры.
    2. Подготовка смеси ДНК плазмиды
      1. Смешайте плазмид в 96 мкл фосфатный буфер (PBS) без CaCl2 или2 MgCl в стерильных 1,5 мл microcentrifuge трубы, как указано в таблице 2. Общее количество ДНК-2 мкг/хорошо.
        Примечание: Объемы для плазмида ДНК решения могут быть проигнорированы, если они являются номинальной. Регулировка громкости рекомендуется если общий объем растворов ДНК плазмиды ≥10 мкл.
    3. Трансфекция ПЭЙ
      1. Мкл 4 PEI раствора (1 мг/мл) в PBS-плазмида ДНК смесь (подготовлен как выше). Окончательный объем составляет примерно 100 мкл (5% объема питательной среды). Вихревой трубы кратко и инкубировать ДНК: Пей смесь 15 мин при комнатной температуре.
      2. Время ожидания для инкубации 15 мин для завершения, замените подогретую сыворотки бесплатно среднего, описанные в шаге 2.3.1.2 питательной среды.
      3. После инкубации 15-мин ДНК: Пей смесь является полным, кратко спин трубы с microcentrifuge для сбора жидкости в нижней части трубы и добавить смесь ДНК: Пей каплям питательной среды в каждой скважине ГЭС 293 культуры пластины. Аккуратно агитировать пластины и вернуть их до 37 ° C инкубатор с 5% CO2.
      4. Сохранить в этой среде transfection клетки до сбора урожая в день 5 (без среднего изменения требуется).
  4. День 1 и 2 деньсоблюдайте transfected клеток с pCMV-GFP плазмида под Перевернутый флуоресцентным микроскопом оценить эффективность трансфекции.
    Примечание: для микроскопии флуоресцирования, здесь 10 X / 0,25 числовая апертура цель в сочетании с 10 × окуляра была использована, и 450-490 Нм возбуждением полосового фильтра и 515-565 Нм полосовой фильтр выбросов были заняты. Вышеизложенные условия обычно дает более чем 70% трансфекции эффективность. Клетки могут проявлять некоторые морфологических изменений (например клетки стали тонкий) из-за состояния сыворотки бесплатно.
  5. На 3-5 днейпо-прежнему культура transfected клеток в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.
  6. На 5 деньСоберите клетки и вирус содержащих среднего в 15 мл полипропиленовые пробирки конические закупорить вверх и вниз или соскоб с скребок ячейки.
  7. Хранение образцов-80 ° C до использования.

3. точка блот Assay для AAV количественный

  1. Восстановление вирусных частиц
    1. Быстро разморозить замороженные трубы в ванну воды 37 ° C. Вихревой трубы энергично за 1 мин для максимального восстановления AAV из клеток.
    2. Пелле мусора клетки центрифугированием при 3700 x g на 4 ° C на 10 мин. Взять 200 мкл супернатант от каждой трубы и перенести его в обозначенные microcentrifuge трубу с винтовой крышкой для assay блот точка.
      Примечание: Алиготе оставшиеся супернатант в microcentrifuge трубки и хранить их замороженные при температуре-80 ° C для использования в будущем. Здесь Трубы полипропиленовые microcentrifuge придает с колпачки и уплотнительное кольцо были использованы. Жесткие уплотнения не требуется для предотвращения разливов AAV и фенол хлороформ.
  2. Лечение с Serratia marcescens эндонуклеазы
    1. Подготовьте смесь A и B смеси реагентов (Таблица 3). Добавьте 10 мкл смесь A и 10 мкл Mix B в каждую пробирку. Вихревой трубы для 5 s, кратко спин трубы для сбора жидкости в нижней части трубы и инкубировать трубы при 37 ° C по меньшей мере за 1 час.
      Примечание: Смеси A содержит NaOH и оптимизирует pH для лечения с S. marcescens эндонуклеазы. Mix B добавки магния. Концентрации S. marcescens эндонуклеазы запасов коммерчески доступных фермента может варьироваться. Объем S. marcescens эндонуклеазы необходимо соответственно скорректировать сделать 200 ед/мл после добавления смесь A и Mix B в пробирки на шаге 3.2.1.
      Примечание: Длиннее время инкубации, до 4 ч, может снизить фон сигналов.
    2. В конце инкубации кратко спин трубы с настольная центрифуга для сбора конденсата и решение от сверху и с боков трубы.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы можно хранить замороженные при-20 ° C или -80 ° C.
  3. Лечение протеиназы K
    1. Подготовьте смесь C реагент (Таблица 3). Мкл Mix C 180 в каждую пробирку. Вихревой трубы для 5 s, кратко спин трубы и инкубировать трубы при 55 ° C за 1 час.
      Примечание: ЭДТА в смеси C реагент chelates ионы магния бесплатно и инактивирует S. marcescens эндонуклеазы.
    2. В конце инкубации позволяют образцов до комнатной температуры и кратко спин трубы с настольная центрифуга для сбора конденсата и решение от сверху и с боков трубы.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы можно хранить замороженные при-20 ° C или -80 ° C. Чтобы возобновить протокол, Инкубируйте трубы при 55 ° C за 5-10 мин распустить SDS кристаллы, полностью содержащихся в буфере.
  4. Фенол хлороформ добычи и этанола осадков
    1. 200 мкл фенол хлороформ, образцы и вихревой их за 1 мин спина образцы в microcentrifuge в ≥16, 100 x g ≥5 мин при комнатной температуре.
      Предупреждение: Фенол хлороформ должны обрабатываться в Химический вытяжной шкаф с соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ; т.е., нитриловые перчатки, защитные очки или щит и лаборатории пальто с длинными рукавами).
    2. Перевести 320 мкл водный слой (160 мкл дважды с пипеткой Р200) новой стандартной microcentrifuge трубки (80% водного объема жидкости).
      Примечание: Жизненно важно принять такой же объем водный раствор между образцами, в противном случае теряет assay количественных точности.
    3. Подготовьте смесь D реагента (Таблица 3). Мкл микс D 833 в каждую пробирку. Вихревой трубы для 5 s и инкубировать трубы на-80 ° C для каналов ≥20 мин.
      Примечание: Смеси D представляет собой смесь этанола, натрия ацетат и гликогена для удобного этанола осадков ДНК. Образцы можно хранить при температуре-80 ° C на этот шаг и протокол может быть позднее возобновлен.
    4. Центрифугуйте образцы с microcentrifuge в ≥16, 100 x g при 4 ° C для мин Pour ≥15 покинуть супернатант и один раз пятно на чистой бумажной салфеткой. Положите около 500 мкл 70% этанола в каждую пробирку, вихревой трубы для 5 s и центрифуги трубки с benchtop microcentrifuge в ≥16, 100 x g при 4 ° C для ≥5 мин.
    5. Слить супернатант и один раз пятно на чистой бумажной салфеткой. Сухие гранулы при температуре 65 ° C; Гранулы можно высушить полностью.
      Примечание: Не используйте пипетку для удаления избыточных этанола, который остается после промокательной трубы. Гранулы можно также сушить при комнатной температуре на ночь. Протокол может быть приостановлена здесь и сухие гранулы ДНК может храниться при комнатной температуре в течение нескольких дней с закрытой крышкой трубки.
  5. Ресуспендирования вирусной ДНК в буфере TE
    1. Растворяют гранулы ДНК в 120 мкл буфера TE путем встряхивания каждой трубе, за 30 мин до 1 ч при комнатной температуре.
  6. Точка помаркой
    1. Подготовка стандартов плазмида ДНК
      1. Разбавьте вектора AAV генома плазмидной ДНК до 10 нг/мкл в воде или буфер Tris-HCl (10 мм, pH 8.0). Взять 25 мкл этой разрежения и дайджест с соответствующей энзима ограничения за 1 ч до линеаризации плазмида ДНК, в реакции объем 50 мкл.
        Примечание: Мы делаем дубликат набора пищеварения (см. шаг 3.6.4.1). Соответствующие фермента должен быть один, который режет плазмида ДНК за пределами региона зонд привязки блот точка. Для удобства, разбавленным плазмида ДНК может быть aliquoted (25 мкл/труба) и хранятся замороженные при температуре-20 ° C для использования в будущем. Дайджест плазмидной ДНК, в то время как трубы дрожат в шаге 3.5.1. Не чрезмерно дайджест плазмидной ДНК стандарта.
      2. 450 мкл воды или TE трубка, содержащая переваривается плазмидной ДНК стандартных и тщательно перемешать. Трансфер 70 мкл этой смеси в новой пробки microcentrifuge 1,5 мл с 1330 мкл воды или TE сделать разреженных плазмида стандарт (25 ПГ/мкл).
      3. Следуйте в таблице 4 для создания набора два раза серийных разведений (600 мкл/трубка). Тщательно перемешать разведений, vortexing для 5 s.
    2. Денатурировать вирусной ДНК образцов и стандартов
      1. 600 мкл 2 x щелочной раствор, для каждой стандартной разрежения. Смешайте хорошо vortexing для 5 до 10 s. инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
      2. Мкл 120 2 x щелочной раствор для каждого вирусной ДНК образца. Смешайте хорошо vortexing для 5 до 10 s. инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. Настройка аппарата блот точка
      1. Использование ножницами, вырезать промокательной (например, Зета зонд) мембраны для соответствующего размера для количество образцов и стандартов. Замочите мембраны с водой на 10 минут перед его размещением на аппарат блот точка. Обложка неиспользуемых скважин на аппарат мембраны.
        Примечание: Ручка мембраны с чистым пинцетом. Чтобы покрыть пустой скважин, может использоваться светло синий защиты листа, который поставляется с мембраной. Не позволяйте мембраны высохнуть до обязательных образцов и стандартов. Для более подробной информации о Ассамблеи и использовании аппарата пожалуйста, обратитесь к руководство пользователя19.
      2. Добавьте воду колодцев, которые будут загружены образцы. Применение вакуума и тянуть воду через скважины для проверки ошибок и тестирование при фиксированной. Снова затяните винты при применении вакуум для обеспечения жесткие уплотнения.
        Примечание: Неполная герметизация может привести к утечке образца между скважинами.
      3. После того как вода полностью вытащил, освободить вакуум полностью (т.е., вакуумный коллектор должен быть открыт для давления воздуха).
    4. Загрузка стандарты и образцы для аппарата блот точка
      1. Применить 400 мкл каждого разреженных плазмидной ДНК стандарт для каждой скважины и запустить четыре полосы стандартных растворов. Использовать два отдельных аликвоты стандартная дайджест и загружать каждый в двух экземплярах. Примените 200 мкл/хорошо каждого вирусной ДНК образца.
        Примечание: Используя оставшиеся ~ 40 мкл денатурированного образцов, разбавленным образцы могут быть подготовлены (например, десятикратного разреженных образцы с использованием 20 мкл пример плюс 180 мкл 1 x щелочной раствор) и смыты при необходимости.
      2. Примените нежный вакуумный тянуть решения ДНК через скважины.
        Примечание: Вакуума давление необходимо скорректировать, частично открыв трехходовой клапан, так что вакуумного давления применяется к точка пятно аппарата, а также атмосфера (т.е., с краном оружия, дислоцированные в примерно 45 ° угол где он шумит громче всасывания).
      3. После того, как все колодцы опустели, отпустите вакуум, регулируя трехходовой клапан. Мкл 400 1 x щелочной раствор для каждой скважины, содержавшего стандарты и образцы. Подождите 5 минут до повторного применения вакуума для очистки скважины.
      4. Повторно применить вакуум таким же образом (см. шаг 3.6.4.2).
      5. Разберите аппарат блот точка под вакуумом, удалить мембрану и промойте его с 2 x SSC. Место мембраны на чистое бумажное полотенце ДНК прыгните стороной чтобы удалить избыток 2 с x SSC.
      6. УФ crosslink блотирования ДНК мембраны с соответствующей сшивателя УФ; мембрана теперь готов для гибридизации.
        Примечание: Мокрый мембраны может использоваться для УФ сшивки. Сушеные, УФ сшитый мембраны может храниться при комнатной температуре. Дополнительную информацию можно найти в Таблице материалов.
  7. Гибридизация и мытья
    1. Разминка в гибридизации буфер в ванне с водой 65 ° C.
    2. Ферментативно ярлык ДНК зонд с радиоактивными α -32P дЦТФ и очистить его с помощью коммерчески доступные наборы согласно рекомендации производителя.
      Примечание: Мы используем зонд 0,5 – 2,0 в длину от региона усилитель промоутер или последовательности кодирвоания протеина в вирусного генома КБ. Хотя этот протокол использует 32P-меченых радиоактивные датчики для обнаружения сигнала, нерадиоактивных хемилюминесцентный или флуоресцентных зондов может также использоваться (см. раздел " обсуждение ").
    3. Мембраны в бутылке гибридизации с ДНК прыгните стороной вверх, Промойте мембрану с 5 мл подогретую гибридизации буфер и отбросить буфера. Затем добавляют 10 мл подогретую гибридизации буфера и поместите бутылку в вращающейся печи гибридизации на 65 ° C. Вращайте ≥5 мин.
    4. Тепло денатурируют 20 мкл 10 мг/мл стриженый сельди или решения ДНК лосося спермы и 32P-меченых зонд (≥107 cpm) для 5 мин, поместив трубы на наборе блок тепла при 100 ° C. Затем оснастка холод их на льду ≥2 мин, спина кратко и держать на льду до использования.
      Предупреждение: Для радиоактивных ДНК-зонды, должны использоваться 1.5 мл пробирок с винтовой крышкой и уплотнительным кольцом.
    5. Быстро добавить спермы денатурированной ДНК и радиоактивных зонд гибридизации буфер в гибридизации бутылки и встряхнуть бутылку для 10 s смешивать. Вернуться 65 ° C духовке бутылку и инкубировать и бутылка с вращением на 65 ° C для ≥4 h.
    6. После гибридизации, остановить вращение, удалите гибридизации бутылки и затем Залейте раствор радиоактивных зонд в 50 мл Конические трубки с герметичным уплотнением колпачок. Храните зонд в соответствующий контейнер, помещены в холодильник для радиоактивных материалов.
      Примечание: Используется буфер гибридизации с зондом, который хранится при температуре 4 ° C может повторно использоваться по крайней мере 5 раз, поместив 50 мл Конические трубки с герметичным уплотнением колпачок, содержащий буфер гибридизации в ванну воды 100 ° C за 5 мин.
    7. Промойте мембрану мыть буфера, нагревают до 65 ° C. Добавить 20-30 мл буфера мыть бутылки гибридизации и повернуть на 5 мин повторить это мыть 2 еще раз.
      Примечание: Измерения радиоактивности Вымойте решения и записать его, если требуется местных институтом.
    8. Во время стирки мембрана, место светомассы изображений экрана на ластика изображения на 5 мин.
    9. После третьей стирки Удалить мембрану из бутылки гибридизации, удалить излишки буфера на мембрану с бумажными полотенцами и место мембраны в прозрачные пластиковые бумаги держатель. Проверьте радиоактивных сигналов на мембрану с помощью счетчика Гейгера. Разоблачить изображений экрана стирается фосфора мембраны для 10 минут в ночь в зависимости от интенсивности сигнала.
    10. Сканирование на экран с помощью образа фосфора, сканирование системы и получить данные об интенсивности сигнала каждой точки.
  8. Анализ данных
    1. Нарисуйте калибровочной кривой с помощью таблиц и данных анализа программного обеспечения (например, Excel).
      Примечание: Log-log – линейная регрессия использовалась для рисования кривой стандартного.
    2. Определите нанограмм эквивалент (нг экв) для каждого из образцов вирусной ДНК методом интерполяции. Нг eq-это количество плазмида ДНК используется для рисования кривой стандартного, эквивалентное количество вирусных молекул ДНК. Когда плазмидной ДНК длиной 8000 bp, 1 нг eq вирусной ДНК одноцепочечной AAV соответствует 2.275 x 108 частиц.
      Примечание: Нг eq может быть преобразован в число вирусных частиц следующих уравнений:
      Уравнение для расчета одноцепочечных частиц AAV; Количественная оценка ДНК; формула молекулярной генетики.
      Уравнение для расчета двухцепочечных частиц AAV с использованием длины плазмиды; научная формула.
      Количество частиц AAV условно выражена как «вол» (вектор геномов) или «DRP» (я устойчивые частицы DNase).
    3. Вычислите AAV концентрации исходных материалов. Потому что блотирования вирусной ДНК представляет собой 66,7% Формула расчета процентов: (320/400 × 200/240 × 100%) для анализа данных. вирусной ДНК в исходных материалов, 1 нг eq соответствует 1,7 x 109 частиц/мл формула расчета математического уравнения, умножение на деление отношений, научная нотация .
      Примечание: Данное исправление не требуется, если все вирусной ДНК, содержащихся в исходный материал смыл на мембране без потери (см. Рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представитель результат помарки количественных точка для количественный очищенный запасов вектора AAV, производится в крупных масштабах показан на рисунке 1. С этой точкой блот assay титр двунитевая AAV2G9-ЦМВ-GFP вектор фондовой было определено. Вектор был очищен от двух раундов хлорида цезия (CsCl), градиент плотности ultracentrifugation следуют диализа как описано20. В общем очищенный запасов вектора AAV, три различные объемы каждой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем докладе описан в полезности анализов помаркой количественных точка для изучения AAV ГПД и их роль в Ассамблее капсида. Знания, полученные от этих исследований может обеспечить подробное понимание врожденной различия в процессе AAV капсид Ассамблеи и функциональной роли ГПД между различными серотипов. В этой связи точка кросс дополнения AAV VP3-АПУ пятно пробирного, показали, что змея AAV VP3 отображается строгих зависимостей на совместное выражение его родственных AAP капсид Ассамблеи и что змея АПУ не поощря...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Сяо Сяо в университете Северной Каролины в Чапел-Хилл за предоставление нам с pEMBL ЦМВ-GFP плазмиды. Мы благодарим Кристофер Чэн и Samuel J. Хуан для критических чтении рукописи. Эта работа была поддержана предоставляет служба общественного здравоохранения (низ R01 NS088399 и T32 EY232113).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
БензоназаMilliporeSigma1016970001упоминается как Serratia marcescen endonuclease в основном тексте.
ДНКаза IRoche4716728001упоминается как ДНКаза I энзим А.
ДНКаза IInvitrogen18047019в основном тексте упоминается как ДНКаза I Фермент В.
DNase INew England BiolabsM0303Lупоминается как DNase I Enzyme C в основном тексте.
1,5 мл Прикрепленное уплотнительное кольцо Винтовая крышка Микроцентрифужные пробиркиCorning430909
1,5 мл Микроцентрифужные пробиркиThermo Fisher Scientific05-408-129
15 мл Полипропиленовая коническая трубкаCorning352097
3 м Ацетат натрияTeknovaS0298
50 мл Полипропиленовая коническая трубкаCorning430291
Клетки AAV-293Agilent240073клеточная линия HEK-293, оптимизированная для упаковки вирионов AAV.
AccuGENE 0,5 М ЭДТА РастворLonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Bio-Dot ApparatusBio-Rad1706545
Бычий сывороточный альбуминMilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
ХлороформMilliporeSigma372978
Набор экстракторов ДНКWako Pure Chemical Industries295-50201Используется для количественных точечных блоттингов на очищенном вирусе. На каждом этапе мы используем только половину объема всех реагентов, рекомендованных для Схемы протокола 2 в инструкции, предоставленной производителем.
Дульбекко s Модифицированная среда Eagle (DMEM) - высокий уровень глюкозы (4,5 г/л)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10BCells Thermo Fisher Scientific18290015
этанол 200 ProofDecon Labs2716
Фетальная бычья сывороткаVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095Именуемая полисахароза 400.
Флуоресцентный микроскопZeissAxiovert 40 CFL
ГликогенRoche10901393001
Сперма сельди ДНКInvitrogen15634-017
Пробирки для гибридизацииThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Здравоохранение Медико-биологические наукиImageQuant TL
L-глутамин 200 мМLonza17-605E
Гексагидрат хлорида магнияMilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100
Mini Quick Spin DNA ColumnsMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
Пенициллин/стрептомицин 10K/10KLonza17-602E
Фосфат буферизованный физиологический растворLonza17-516F
Кассета для фосфорной визуализацииЗдравоохранение Медико-биологические наукиРазличные
экраны фосфорной визуализацииGE Здравоохранение Медико-биологические наукиРазличные
плазмидные макси-наборыQIAGEN12162
Платина Pfx ДНК-полимеразаИнвитроген
PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
PolyvinylpyrrolidoneMilliporeSigmaP5288
Prime-It II Random Primer Labeling KitAgilent Technologies300385
Primer AAP Forward (N25 нуклеотиды из 4-го нуклеотида в AAP ORF, RE1 является сайтом фермента рестрикции для клонирования): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer
AAP Reverse (N25 является последними 25 нуклеотидами AAP ORF, RE2 является сайтом фермента рестрикции для клонирования): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Праймер VP3 Forward (N25 первые 25 нуклеотидов VP3 ORF, RE1 является сайтом фермента рестрикции для клонирования): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer
VP3 Reverse (N25 является последними 25 нуклеотидами AAP ORF, RE2 является сайтом фермента рестрикции для клонирования): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Proteinase K SolutionInvitrogen25530-049
Ферменты рестрикцииNew England BiolabsРазличные
ДНК спермы лососяInvitrogen15632011
серологические пипеткиThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Хлорид натрияThermo Fisher ScientificS271-10
Цитрат натрия Трехосновной дигидратMilliporeSigmaC8532
T4 ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0203L
ТермоамплификаторEppendorf6321000515
обработанный культурой тканей 6-луночный планшетCorning
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-Saturated PhenolInvitrogen15513-047
UV CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Используется оптимальный режим сшивки, обеспечивающий дозировку УФ-энергии 120 мДж/см2.
Зондовая мембрана ДзетаBio-Rad162-0165
В основном тексте GE 11708013353046

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211(2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AAV

Похожие статьи