Мы представляем метод, объединяющий поклеточного фиксации записи и два Фотон изображений для записи Ca2 + переходные процессы в нейрональных дендритов в острой мозга ломтиками.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кальций (Ca2 +) изображений является мощным инструментом для изучения пространственно-временных динамика внутриклеточных Ca2 + сигналов в нейрональных дендритов. CA2 + колебания могут возникать через различные мембраны и внутриклеточных механизмов и играть решающую роль в индукции синаптической пластичности и регулирование дендритных возбудимости. Следовательно возможность записи различных типов Ca2 + сигналов в дендритных филиалов является ценным для групп, изучая, как дендриты интегрировать информацию. Появление двух Фотон микроскопии сделал такие исследования значительно проще, решая проблемы, присущие изображений в живой ткани, такие как рассеяние света и фотоповреждения. Кроме того через сочетание обычных электрофизиологических методов с двух Фотон Ca2 + изображений, можно исследовать местные Ca2 + колебания в нейрональных дендритов параллельно с записями синаптической активности в Сома. Здесь мы опишем, как использовать этот метод для изучения динамики местных Ca2 + транзиентов (кошки) в дендриты ингибирующее интернейронов ГАМК. Этот метод может применяться также к изучению дендритных Ca2 + сигнализации в различных типов нейронов в острой мозга ломтиками.
Введение
Вклад нейрона для сетевой активности во многом определяется динамичный характер синаптических входов, которые он получает. Традиционно преобладает метод характеризации синаптической активности нейронов полагались на записи соматических поклеточного патч зажим постсинаптических токов, вызываемые электрической стимуляции аксонов прохода. Однако только активность проксимально расположен синапсы правдиво сообщили в этом случае1. Кроме того для оценки СИНАПС конкретные механизмы, записи из пар нейронов и дендритов в определенном месте использовались для целевой синапсы интерес и механизмы дендритных интеграции, соответственно. Крупным прорывом в обл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими животных животных защиты Комитет Университет Лаваля и Канадского совета по лечению животных.
1. Предварительная подготовка (необязательно: заранее подготовить 1 день)
- Подготовка трех видов искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) решения (нормальный, сахароза и восстановления решения, 1 Л; см. таблицу 1). Отрегулируйте осмотического давления решения до 300 мОсм ± 1025 и прохладный фаго-сахароза до точки вблизи замерзания (0-4 ° C).
Примечание: Использование низким содержанием натрия режущего раствора (фаго-сахароза) помогает ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С использованием протокола, представленные здесь, мы получили кошки, вызывали соматических текущего инъекции и электростимуляции в дендриты oriens/alveus интернейронов в области СА1 гиппокампа. После исправления нейрона, определены на основе его форму и положение, мы приобрели linescans через проксимальный дендритов в нескольких точках в с учетом расстояния от Сома (рис. 1A). Мы наблюдали снижение амплитуды кошек, индуцированных backpropagating APs как рассто.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, показанный здесь показано, как сочетание двух Фотон Ca2 + изображений и патч зажим электрофизиологии может использоваться для изучения дендритных Ca2 + сигнализации в нейрональных дендритов в острой мозга ломтиками. Этот метод позволяет для контроля как местные Ca2 + фасады вызванные электрической стимуляции или backpropagating ап в дендритных сегменты и ответ соматических клеток. Это делает его отличным инструментом для изучения как различные части дерева, дендритных интегрировать.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы могут не конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Совет канадских институтов здравоохранения исследования, естественные науки и инженерных исследований (СЕНТИ обнаружения Грант) и Фондом Savoy. OC была поддержана кандидат стипендий от Сенти.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Животный штамм: Мышиный CD1 | Charles River | 022 | |
| Изофлуран | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 гидрохлорид | Abcam | ab120337 | |
| Хлорид кальция | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-глюкоза | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Хлорид магния | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Гептагидрат сульфата магния | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| порошок параформальдегида, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Хлорид калия | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Глюконат калия | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Азид натрия | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Хлорид натрия | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| База Тризма | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Тризма гидрохлорид | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Дигидрат фосфата натрия | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Натрия фосфат моноосновный моногидрат | Сигма-Олдрич | S9638 | |
| Биоцитин | Сигма-Олдрич | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Гидразид | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Габазин) | Abcam | ab120042 | |
Аденозинтрифосфат (АТФ)-Трис | Sigma-Aldrich | A9062 | |
Гуанозин (ГТФ)-Na+ | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 | ThermoFisher Scientific | O6812 | |
соль фосфокреатина ди(триса) | Sigma-Aldrich | P1937 | |
Стрептавидин-конъюгированный Alexa-546 | ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Патч Боросиликатные стеклянные капилляры | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Тета-боросиликатные стеклянные капилляры | Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Конфокальный мультифотонный микроскоп | Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Сапфировый многофотонный лазер | Когерентный | ||
| LAS AF Программное обеспечение для сбора изображений | Leica Microsystems | ||
Регулятор температуры TC-324B | Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B | Усилитель Молекулярные устройства | ||
Digidata 1440A Дигитайзер | Молекулярные устройства | ||
Конфокальные Транслятор | Siskiyou | ||
Микроманипулятор | Siskiyou | ||
pClamp Программное обеспечение для сбора данных | Molecular Devices | ||
A365 Изолятор стимулов постоянного тока | World Precision Instruments | ||
Vibraplane Оптический стол | Кинетические системы |
Ссылки
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997). ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
