Дрозофилы яичника является система отличная модель для изучения развития ниши стволовых клеток. Хотя методы для рассечения личинок и взрослых яичники были опубликованы, куколки завязи Анатомирование требуют разных методов, которые не были опубликованы в деталях. Здесь мы приводим протокол для рассечения, окрашивание и монтаж куколки яичников.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Рассечение и пятнать дрозофилы куколки яичников
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В отличие от взрослых дрозофилы яичников, куколки яичников являются довольно трудно получить доступ и изучения из-за их малого размера, прозрачность и обшивка внутри куколки дело. Задача рассекает куколки яичников также лежит в их физическое местоположение в пределах куколки: яичников окружены жира тела клетки внутри куколки живота, и эти жировые клетки должны быть удалены для надлежащего антитело пятная. Для преодоления этих проблем, этот протокол использует настроенные Пастер пипец извлечь жир тела клетки из куколки живота. Кроме того камерные coverglass используется вместо пробки microcentrifuge во время процесса окрашивания для улучшения видимости куколок. Однако несмотря на эти и другие преимущества инструменты, используемые в настоящем Протоколе, успешное выполнение этих методов по-прежнему может включать несколько дней практики из-за небольшого размера куколки яичников. Методы, изложенные в настоящем Протоколе может применяться к времени курс эксперименты, в которых анализируются яичников на различных стадиях развития куколки.
Введение
Исследования стволовых клеток с использованием дрозофилы яичников широко расширилась с момента первого документации3,2,1,ниши стволовых клеток4. После разработки происхождение генетических средств трассировки, дрозофилы яичника, Анатомирование широко использовались для изучения линий стволовых клеток и сигнальные пути, которые регулируют содержание стволовых клеток, распространение и судьба в нише стволовых клеток. Знание этих сигнальных путей может дать понимание потенциальных причин рака, которые исходят из ошибочной стволовых клеток активности5,6,7. Кроме того, недавно было показано, что соматических стволовых клеток в яичниках дрозофилы , известный как фолликула стволовые клетки (FSCs), сильно напоминают кишечных стволовых клеток млекопитающих во многих аспектах их организации8. По этой причине яичники дрозофилы являются систему весьма полезной моделью для изучения поведения стволовых клеток.
Хотя личинок и взрослых яичников предлагают ключи для раннего развития стволовых клеток и организации окончательный стволовых клеток в нише, соответственно, куколки яичника является промежуточная структура, в которой микрофлорой и соматические клетки реорганизовать и установить их личность 9 , 10. Хотя ряд исследований рассматривали аспекты развития тканей в куколки завязи10,11,12,13, остаются вопросы относительно дифференциации и пространственной организации типов клеток яичников во время развития куколки. В частности спецификации FSCs происходит в этот период. Этот протокол описывает метод для рассечения и пятнать куколки яичников в нужное время точках — метод, который может использоваться в времени курс экспериментов, которые анализируют развития куколки завязи в деталях от личинки до стадии взрослого.
С учетом небольшого размера, прозрачность и недоступность куколки завязи внутри куколки живота, этот протокол использует инструменты, такие как заказ тонким наконечником Pasteur накапайте для удаления тканей брюшной жир тела, препятствуя антитела доступ к яичники. Ясно, камерные coverglass, используемый в ходе антитело пятная предлагает большую видимость куколок и мягче платформы для качания яичников на «Nutator». Основываясь на протокол для личинок завязи Анатомирование Маймон и Гильбоа14, относительно высокая концентрация X-100 Тритон был нанят на начальных этапах пятная процедуру максимально клеточной мембраны permeabilization и антитела доступ к яичников клетки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. типографа
- Объединить приблизительно десять мужчин и пятнадцать женщин взрослых мух дрозофилы желаемого генотипа в пузырек нормальной богатую пищу летать с дрожжей. Чтобы избежать переполненности флакона, позволяют растяжением самки откладывают яйца для не более чем на 2 – 4 ч14.
- Перевести взрослых из флакона в новый флакон, нажав флакон, открытие против различных флакон с лету пищей. Разрешить яйца, чтобы развиться в личинки при комнатной температуре 3 – 4 дней.
2. Выбор женских личинки
- Использование влажной тонкой кистью с мягкой щетиной, сделайте подвижного движения кистью вдоль стены флакона для передачи блуждающих третьего возраста личинок из флакона на стакан, хорошо заполнены до краев с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Вымойте остатки пищи у личинки путем передачи их другому хорошо заполнены с ПБС.
- Отдельные мужские и женские личинки, с помощью щипцов. Идентифицировать мужской личинки пару большие, круглые и полупрозрачные яичек, встроенных в тело жира на боковой стороне тела примерно две трети вниз с его передней конец15. Женщины личинки больше, в среднем, менее полупрозрачный, чем мужчины и имеют гораздо меньше гонад, которые более трудно обнаружить.
- Выберите против мужчин личинками для сбора женщин личинки. Соберите по меньшей мере десять женщин из колодца. Место женщины личинок в отдельном хорошо заполнены с ПБС.
- Использовать щипцы для передачи женского личинки мягко в новый флакон свежих продуктов, летать дополнена дрожжей.
- Место флакона с женской личинок в темном месте для облегчения pupariation16. В течение дня контролировать личинок для pupariation. Как каждая личинка обездвиживает и превращается в prepupa, круг prepupa против флакона и записывать приблизительное время, когда он впервые образует в prepupa. Определите prepupae выпячивание передней дыхальца и сроках формирования puparium17. Разрешить prepupae развивать до желаемого времени точки (измеряется в часах после формирования puparium, АТФ).
Примечание: Любое животное, которое проходят puparium формирование в течение примерно 10 часов интервал может считаться prepupa. Стадия куколки начинается около 12 ч после формирования puparium после того, как внутренние линьки имело место.
3. Подготовка куколок для пятнать антитела
-
Формируют тонкой стеклянной пипетки для использования в последующих шагах для очистки из куколки жира тела.
- Расплавьте кончик стекла Pasteur накапайте над помощью горелки Бунзена. Как стекло плавится, используйте щипцами вытащить кончик горизонтально от остальной части пипетки сформировать кончик тоньше.
- После охлаждения, разорвать небольшую часть кончика пипетки в форме аккуратные круглое отверстие. Прикрепите шарик к другому концу пипетки.
- Загрузите пипетки с ПБС.
- Урожай куколок, которые приклеиваются к стенке флакона, нанесите небольшое падение воды вдоль контактной зоны между куколки и флакона. Подождите 1 – 2 мин, чтобы белок клей растворяют до нежно подъема куколки от стены с влажной тонкой кистью. Передача куколка на стакан хорошо заполнены с ПБС. Посвятите один колодец в куколки чтобы избежать переполненности хорошо.
- Защелки заднего конца куколки с одной парой щипцов, тщательно слезу передней части корпуса куколки с другой парой до тех пор, пока руководитель куколки является видимым.
- Ручка передней большинстве кончик куколки головы с щипцами и осторожно потяните куколки куколки дела.
Примечание: Часть жира тела могут проливаться во время этого процесса. - Отдельные и отбросить в передней половине куколки от задней половины до тех пор, пока остается только брюшной мешок.
-
Извлечь клетки тела жира из живота мешок.
- Возьмите брюшной мешок против нижней части скважины с щипцами в одной руке держа тонкой стеклянной пипетки, заполнены с ПБС в другой руке.
- Цель кончик тонкой накапайте к открытию мешок и медленно накапайте ПБС в брюшную полость, чтобы смыть жир тела клетки, окружающие куколки яичников.
Примечание: Яичников являются пары небольших, полупрозрачный, полосатая и продолговатых структур, которые должны оставаться внутри брюшной мешок. - Смыть что жир тела клетки до тех пор, пока по крайней мере две трети тела жир ушел, или до тех пор, пока яичников видны вблизи открытия брюшной мешок. Очень важно выполнять этот шаг медленно чтобы не мыть в яичниках из живота случайно.
- Изучите и проверить, если яичники вылилось во время мытья клетки жира тела. Если не яичников видны внутри колодец, они должны остались в животе. Если яичники вышли, поместите новые куколки в колодец и повторите этот шаг.
- Передача живота в камеру ясно coverglass, заполнены с фиксации буфера (ПБС, параформальдегида 4%) и поместите крышку на вершине. Чтобы обеспечить достаточное количество яичников выдерживать окрашивание и процесс установки, вскрыть яичников более чем необходимо.
Предупреждение: Фиксация буфер содержит параформальдегида, который является токсичным. Пожалуйста, носите соответствующую защиту как перчатки, защитные очки, и т.д.
4. иммуногистохимии
- На протяжении всего процесса окрашивания используйте корнцанг осторожно надавите любой плавающей яичников в нижней части стекла крышка колодца для обеспечения что яичников полностью погружен в раствор антител.
- Место полосы двухсторонней ленты на плоской поверхности Nutator и затем поместить патрон coverglass на клейкую поверхность.
- Инкубируйте яичников в фиксации буфера из шага 3.7 15 мин при комнатной температуре.
- Промойте яичников три раза в однократном ПБС с 1% тритон X-100 для 5, 10 и 45 мин (1 час в общей сложности), соответственно, чтобы позволить тщательно permeabilization.
- Блокировать яичников в 10% нормальной козьего сыворотки в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 на 30 мин.
- Инкубировать яичников на ночь в 600 мкл основное антитело выбора разбавляют до соответствующей концентрации в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 на 4 ° C.
- Промойте яичников три раза за 5 мин в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100.
- Инкубируйте завязи по 2 ч в 600 мкл вторичное антитело выбора разбавляют до соответствующей концентрации в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 при комнатной температуре.
- Промывайте яичников дважды за 5 мин в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 и один раз в течение 5 мин в однократном ПБС.
5. разбор и монтаж куколки яичников
- Место небольшой капли 1 x PBS на слайд микроскопа. Используйте щипцы передать брюшной мешок от камерных coverglass стакан хорошо заполнены с ПБС. Посвятите один колодец в куколки чтобы избежать переполненности хорошо.
- Разорвать брюшной мешок и любые оставшиеся тела жира с щипцами.
Примечание: Функции яичников, которые являются пары небольших, полупрозрачный, полосатая и продолговатых структур, должны быть видны внутри колодца. Яичников часто плотно окружены жир тела, поэтому очень важно, чтобы убедиться, все тело жира тщательно войной друг от друга. - Перенесите яичников из колодца в каплю 1 x PBS на микроскопе слайд, схватив в центре яичников между советы щипцы. Это очень важно использовать крепко без сжатия яичников так, чтобы не потерять или уничтожить их во время передачи. Добавьте несколько капель 1 x PBS на слайд, когда раствор высыхает с течением времени.
- После того, как все яичники были расчленены и переданы микроскопа, накапайте 40 мкл монтажа среды на coverslip 22 x 22 мм и место coverslip нежно поверх яичников. Пусть сухой ночлег слайд до изображений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное выполнение этой процедуры должно привести к Пятнать антитела ясно, которая показывает структуру и клеточной организации дрозофилы куколки яичников. Иммуногистохимии, изложенные в настоящем Протоколе может использоваться для идентификации типов клеток, широко окрашенных в яичниках личинок и взрослых. Клетки производным от куколки плодоножки Рой клетки,18 (предложенный Fasciclin III в белом) показанный на рисунке 3. Пом...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее критический и сложный шаг этот протокол включает подготовку куколки яичников до фиксации. Чтобы гарантировать, что яичники, малые и похороненный жира тела клетки внутри куколки живота, являются достаточно витражи с антителами, важно не только сорвать большое отверстие в брюшной мешок с щипцами, но также извлечь жир тела клетки, которые препятствуют Яичники от антител. Успешное выполнение этого шага требует применения тонких давления на лампу пипетки Пастера во время мытья клетки тела жира из живота мешок (на...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить.
Благодарности
Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (RO1 GM079351 по д.к.). Мы благодарим Dorothea Godt за ее полезные советы по куколки завязи Анатомирование, на основе ее первоначального протокола. Мы также благодарим Эми Reilein за ее помощь и комментарии на рукопись.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Щипцы, биология | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Камерное покровное стекло | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Диссекционный микроскоп | Nikon | SMZ-10A Конфокальный | |
| микроскоп | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Программное обеспечение | для анализа Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Депрессионные стеклянные точечные пластины | Pyrex | 7220-85 | |
| Пастеровская пипетка | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Пастеровская пипетка колба | Различные поставщики | ||
| Горелка Бунзена | Различные поставщики | ||
| Fisherfinest Premium Матовый микроскоп Предметные стекла | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 мм стеклянные покровные стекла No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Двухсторонняя лента | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Различные поставщики | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Содержит p20, p200, p1000 пипетторы |
| 16% параформальдегида | Электронная микроскопия Sciences | 15710 | Разбавить до 4% параформальдегида в 1x PBS |
| Triton Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | ||
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Разбавить до 1x |
| PBS Нормальная козья сыворотка | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Разбавить до 10% нормальной козьей сыворотки в PBST с 0,5% концентрацией |
| TritonПервичные антитела (в протоколе: 7G10 анти-Фасциклин III разведенный в соотношении 1:250, кроличий антифосфогистон H3 разведенный в соотношении 1:1000) | Различные поставщики (в протоколе: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Разведите в PBST с 0,5% концентрацией тритона | |
| Вторичные антитела (в протоколе: Alexa-546, FITC-конъюгированная антикроличья сыворотка) | Различные поставщики (в протоколе: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Разведите в PBST с 0,5% концентрацией тритона | |
| флаконы | для мух Denville Scientific | V9406 | |
| Ватные шарики, для широких флаконов | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Дрожжи, пекари Сухие активные | MP биомедикалы | 101400 | |
| Корм для мух | Произведено в лаборатории | Смесь воды, пивных дрожжей, кукурузной муки, патоки, агара, этициллина, метил4-гидробензоата и пропионовой кислоты | |
| Самцы и самки мух Drosophila (генотип, используемый в протоколе: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Ссылки
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537(2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52(2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
