Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Summary

Капиллярного изоэлектрической фокусировки является метод на основе антител, сверхчувствительная, высокая пропускная способность, позволяя подробную характеристику белков и их изоформы биологических пробах крайне мала. Ниже описывается протокол для обнаружения и количественного определения специфических белков и их изоформы автоматизированные и роботизированные образом.

Abstract

Immunoblotting стала обычной техники во многих лабораториях для характеризации белка из биологических образцов. Следующий протокол предоставляет альтернативную стратегию, капиллярные изоэлектрической фокусировки (главный), с много преимуществ по сравнению с обычными immunoblotting. Это на основе антител, автоматизированных, быстрое и количественный метод, в котором полный западных blotting процедуры происходит внутри ультратонких капилляров. Этот метод не требует гель для передачи мембраны, зачистки помарки, или рентгеновские пленки, которые обычно требуются для обычных immunoblotting. Здесь, протеины разделены согласно их заряда (Изоэлектрическая точка; Пи), используя меньше, чем микролитр (400 nL) общего белка lysate. После электрофореза, белки являются иммобилизованных на стенки капилляров, ультрафиолетовый свет лечения, следуют первичный и вторичный (пероксидазы (ПХ) конъюгированных) Антитело инкубации, привязку которого обнаруживается через расширение Хемилюминесценция (ЭСЛ), создавая световой сигнал, который может быть захвачен и Записанная камерой зарядовой (связью ПЗС). Цифровые изображения могут быть проанализированы и количественно (площадь пика) с помощью программного обеспечения. Эта процедура высокая пропускная способность может обрабатывать 96 образцов одновременно; очень чувствительна, с обнаружением белка в диапазоне пикограмм; и производит высоко воспроизводимые результаты благодаря автоматизации. Все эти аспекты являются чрезвычайно ценными, когда количество образцов (например, образцы тканей и биопсии) является ограничивающим фактором. Методика имеет более широкое применение, включая скрининг наркотиков или антител, открытия биомаркеров и диагностических целей.

Introduction

Капиллярные изоэлектрической упором (главный) является автоматизированной, основанный на капиллярной иммуноанализ, устраняющее белков на основе их заряда^1,2,3. Это очень воспроизводимость и способный разрешать белков и их post-translationally модифицированных изоформ быстро и количественно. Она представляет альтернативу обычные методы, такие как Западный blotting. В то время как Западный blotting очень хорошо для подтверждающих наличие обильные белков в легкодоступном образцов; изменчивость, время потребления и точный количественный всех присутствующих задач, в частности при ....

Protocol

1. клетки культуры, стимуляции и Lysis

Примечание: Этот метод может использоваться с многие типы клеток. Чтобы проиллюстрировать метод, описан пример использования человеческого пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs).

1. Культура HUVECs на желатин покрытием, 10 см Петри в эндотелиальных клеток базального среде с соответствующих добавок (см. Таблицу материалы), а также содержащая 5% FCS, эпидермального фактора роста (5 нг/мл), Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF: 0,5 нг/мл), основные ФБП (10 нг/мл), инсулин подобный фактор роста (20 нг/мл), гидрокортизон (0,2 мкг/мл) и аскорбиновой кислоты (1 мкг/мл).

Results

Дизайн новой пробирного: Пробирного пластины схема приведена на рисунке 1A. Максимально 96 скважин может использоваться от 384-ну пластины в блоках 12 скважин для каждого условия (антител). Каждый блок 12 скважин можно запустить либо из A1-A12 и A13-A24. Цветом строк позволяют отличить образцы или реагенты друг от друга. В шаблоне пробирного (рис. 1B), соответствующую информацию для этого могут храниться конкретн.......

Discussion

Чувствительность и разрешение белки имеют решающее значение для протеомических исследований биологических образцов. Существует большое значение в состоянии обнаружить белки, которые присутствуют в минуту количествах в клетках. Главный может предложить улучшена чувствительность и разрешение для обнаружения белков и их изоформы⁴.

Эта технология успешно используется в многих протеомических исследований отчеты^5,6

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5– 8 (вложенный) градиент разделения, pH 2– 4 пробки	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
смесь ингибиторов DMSO	ProteinSimple	040-510	Ингибиторы фосфатазы; для разведения cIEF 1:50 используется
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Ингибитор протеазы; для разведения cIEF 1:25 используется
стандартная лестница pI 3	ProteinSimple	040-646	Для разведения cIEF 1:60 используется
образец разбавитель	антител ProteinSimple	040-649
	ProteinSimple	040-309
Концентрат промывки	ProteinSimple	041-108
Протеин анолитаSimple		040-337
Протеин	католитаSimple	040-338
Перекись XDR	БелокSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis	Buffer ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 упаковка) для	ProteinSimple	CBS700
Набор для анализа/крышки	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-rabbit IgG (H+L)	Джексон ИммуноResearch	711-035-152	Для использования цИЭФ (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Джексон ИммуноResearch	715-035-150	Для цИЭФ используется (1: 300)
Фосфо-Эрк 1/2 Первичная клеточная	сигнализация	9101	Для цИЭФ используется (1: 50)
Pan Erk Первичная клеточная	сигнализация	9102	Для используемой ИЭФ (1: 100)
Программное обеспечение Компас	БелокSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& НБСП; C-22221	Базальная среда для эндотелиальных
клеток Среда для роста эндотелиальных клеток MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Добавка к MV2 выше
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Инсулиноподобный фактор роста
Bioruptor (Sonicator)	Диагенод	B01020001
белок BCA Набор для пробирных анализов	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Протеиновые гели	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Беговой буфер (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Трансферный буфер (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF мембрана	Millipore	IPVH00010
			аппарат для микрофуговых пробирок
Центрифуга
Микротитровальный пластинчатый адаптер для центрифуги
Пипетторы
Советы
по льду