Методическая статья

Выявление и количественная оценка Plasmodium falciparum в водный красных кровяных клеток, ослабленных общее отражение инфракрасной спектроскопии и многомерного анализа данных

DOI:

10.3791/56797

⸱

2 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Biospectroscopy, Monash University, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Nursing and Health Sciences, Monash University, 3Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 4Department of Medicine, University of Melbourne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем собой протокол для выявления и количественной оценки Plasmodium falciparum в зараженных водный красных кровяных клеток, используя аттенуированные полного отражения инфракрасного спектрометра и анализа многомерных данных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем метод количественной оценки и выявления паразитов в водный красных кровяных телец (эритроцитов), используя простой benchtop ослабленных общее отражение Фурье преобразование инфракрасного (ATR-FTIR) спектрометра в сочетании с (многомерный анализ данных MVDA). 3D 7 P. falciparum были культивировали 10% паразитемии кольцо стадии паразитов и используется для всплеска эритроциты свежие доноров изолированы для создания разрежения серии между 0-1%. 10 мкл каждого образца были помещены на центр ATR алмазов окна для получения спектра. Образец данных лечился улучшить соотношение сигнал-шум и для удаления воды, и затем вторая производная был применен для решения спектральной функции. Данные затем были проанализированы с использованием двух типов MVDA: первый анализ главных компонент (PCA) чтобы определить любые промахи и затем частичной регрессии методом наименьших квадратов (PLS-R) построить модель количественной оценки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Малярия является одним самых разрушительных болезней нашего времени; более половины населения живет на риск в эндемичных регионах и он непропорционально бремя бедных1,2,3,4. Большая часть этого вопроса является бессимптомных носителей и ранней стадии пациентов, которые выступают в качестве резервуаров для комаров векторов5, вызывая пики инфекции во влажных сезонов и позволяет ему сохранять в общинах. Малярия вызывается пять Plasmodium паразитов, наиболее смертоносной из которых является P. falciparum , который приводит к наиболее тяжелая форма болезни2.

В настоящее время методов для диагностики малярии менее совершенны. Оптическая микроскопия, текущего золотого стандарта, может определять только 62-88 паразитов/мкл в зависимости от используемого метода6. Кроме того, из-за интенсивность и высокие навыки, необходимые, в многих регионах микроскопия misdiagnoses > 50% случаев, особенно с низкой паразитемии уровней2, которые можно непосредственно отнести отсутствие ресурсов в этом районе и результаты в злоупотребление противомалярийных препаратов. Другие 2 основные диагностические методы являются диагностические экспресс-тесты (БДТ), которые используют антитела для обнаружения и анализы полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые являются дискриминационными и количественно паразитов из ДНК. В настоящее время БДТ только способны обнаруживать P. falciparum и P. vivax по крайней мере 100 паразитов/мкл крови, что приводит к редких форм этого заболевания лечить. 7 , 8 в отличие от этого, анализы ПЦР дискриминацию и количественно разных видов плазмодия чувствительность 0.0004-5 паразитов/мкл крови. Однако он требует дорогостоящих реагентов, оборудования и технических навыков и таким образом не подходит для области применения.

Очень чувствительной, надежной и доступной техника имеет важное значение для улучшения диагностики раз и таким образом улучшение результатов лечения пациентов и возможность ликвидации болезни. Ослабленная общее отражение Фурье-спектроскопии преобразования (ATR-FTIR) предлагает потенциальным решением этой проблемы. Предыдущие работы показал, что возможности для выявления и количественной оценки P. falciparum в метаноле фиксированной мазков крови, достижение пределов обнаружения из < 1 паразитов/мкл крови (< 0,0002% паразитемии)9, которая сопоставима с методами ПЦР. Недавние исследования показали, что это возможно для выявления и количественной оценки паразитов водных проб и таким образом устранить на этапе фиксации. Однако такие факторы, как водяной пар, спектральные шума и обработки данных необходимо принимать во внимание для достижения оптимальных результатов10.

Этот протокол имеет целью показать новых пользователей как приобрести ATR-FTIR спектры и подготовить модель регрессии для обнаружения P. falciparum от водных проб эритроцитов (РБК)10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пожалуйста проконсультируйтесь с соответствующим безопасности листы (MSDS) и искать соответствующую подготовку по биобезопасности уровня 2 (BSL-2). Все культивирования шаги должно быть сделано в кабинете BSL-2 с помощью асептической техники, значит, есть риск воздействия вредного УФ-излучения от дезактивации шаги, игла палку травм и потенциального воздействия на биологические и инфекции, если паразит культуры вводит любых травм. Кроме того запасов крови от банков крови только экранированные для некоторых заболеваний и потенциал для распространения кровь болезней является потенциальный риск. Добиваться немедленной медицинской помощи в возникновении травмы.

1. Подготовка и измерение 3D 7 серии разрежения паразит Plasmodium falciparum

Примечание: Plasmodium sp. культура является весьма чувствительным. Использовать свежие/оставшийся реагентов и регулярно кормить паразитов, изменив средств массовой информации. Кормовых культур, ниже 5% паразитемии каждый второй день; кормить культур между 6-10% паразитемии один раз или два раза в день; и кормить культур между 11-20% до 4 раза в день. Паразиты, которые начинают голодать теряют форму и начать контракт. В таком случае кормить и разбавленных немедленно, изменив СМИ и добавив запасов RBCs. сбор донорской крови в пробирки, содержащие гепарина как антикоагулянт и меру в течение первых 6 ч.

  1. Культура в общей сложности 30 мл 7 3D штамм Plasmodium falciparum паразитов согласно стандартному протоколу до тех пор, пока паразитемии достигает 10% кольца.
  2. Синхронизация паразитов
    1. 11 ч после shizogeny в жизненный цикл паразита, Ресуспензируйте культуры и передачи в 50 мл Конические трубки с помощью автоматических дозаторов.
    2. Центрифуга культуры на 300 – 400 x g и стандартных лабораторных условиях (25° C и 100 кПа) за 5 мин.
    3. Удалите супернатант составление с пипеткой или с помощью пипетки Пастера придает вакуум не нарушая гранулы. Выбросите отходов СМИ в Блич 10% раствор.
    4. Медленно добавьте 12 – 15 мл 4% раствора сорбитол Пелле, с использованием автоматических дозаторов и смесь культуры, укупорки и инвертирование трубку до тех пор, пока культура является однородной.
    5. Инкубируйте культуры при 37 ° C 15 мин.
    6. Центрифуга культуры на 300 – 400 x g и стандартных лабораторных условиях за 5 мин.
    7. Как описано в шаге 1.2.3 Удалите супернатант.
    8. Добавить 10-15 мл 0,9% физиологического раствора в гранулах и перемешать решения укупорки и инвертирование трубку до тех пор, пока культура является однородной.
    9. Повторите шаги 1.2.6–1.2.8 дважды больше, чтобы вымыть все остатки сорбитол.
  3. Подготовка серии разрежения паразитемии
    1. Вымойте фондовой RBCs как шаги 1.2.6–1.2.9.
    2. Центрифуга для культуры в стандартных лабораторных условиях, фондовая RBCs на 300 – 400 x g 5 мин и отбросить супернатанта как шаг 1.2.3.
    3. Этикетке microcentrifuge трубы как 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% и 1.000% и добавьте 0 мкл, 1 мкл, 2.5 мкл, 7,5 мкл, 10 мкл, 25 мкл, 75 мкл и 100 мкл культуры соответственно с помощью пипетки 0,2-20 мкл.
    4. Добавьте 100 мкл, 99 мкл, 97,5 мкл, 92,5 мкл, 80 мкл, 75 мкл, 0 и 25 мкл запасов RBCs трубки помечены 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% и 1.000%, соответственно.
    5. Центрифуга свежие донорской крови, собранные в антикоагулянт трубы на 1200 x g и стандартных лабораторных условиях за 10 мин.
    6. Удаление плазмы, составление с пипетки и отменяя как описано в шаге 1.2.3.
    7. 900 мкл изолированных эритроцитов в каждую пробирку microcentrifuge и тщательно перемешать, инвертирование 10 x.
  4. Спектральные приобретение
    1. Использование сопровождающих спектральных приобретения программы, нажмите кнопку «Настройки документа» и задайте параметры сбора данных на следующие: 128 сканирование для фона; 32 сканирование для образца; и резолюцию 8/см в диапазоне Максимальная образец документа.
    2. Установите температуру ATR-ФУРЬЕ-спектрометр за рекомендации изготовителя или на ночь.
    3. Очистите кристалл, нежно очистка круговыми движениями с помощью Линт бесплатно салфетки, смоченной ультрачистая вода. Затем тщательно высушите другой свободный протрите Линт.
    4. Возьмите измерения фон воздуха, нажав кнопку «Фон измерение». Каждые 20 минут, чистый кристалл как шаг 1.4.3 и повторите это измерение.
    5. Откройте жить, нажав кнопку «Предварительный просмотр». Соблюдайте плоская, горизонтальная базовых, указывающее, что кристально чист.
    6. Пипетка 10 мкл деионизованной воды непосредственно на середине кристалла и нажмите кнопку «Мера образец». Повторите измерение этой воды после каждого пятого образца.
    7. Сухие кристалл, с использованием Линт бесплатно wipe и нежные круговые движения.
    8. Пипетка 10 мкл пример и нажмите кнопку «Мера образец».
    9. Очистите Хрустальный между образцами как шаг 1.4.3.
    10. Повторяйте до тех пор, пока 3 реплицирует приобретаются, убедившись в случайном порядке образцов и реплицирует.

2. многомерных данных анализа (MVDA)

Примечание: Данные лечение должно быть сделано за весь набор данных для того, чтобы избежать шума и добавления вершины-биологического происхождения. В отличие от анализа над биологически соответствующих регионов: 2980-2800/см и 1750-850/см.

  1. Обработка данных
    Примечание: Две программное обеспечение, например, Matlab (далее Программное обеспечение 1) и X Группировальная машина (далее Программное обеспечение 2) используются в качестве примеров для MVDA. Программное обеспечение 1 имеет возможность выполнять MVDA без добавления графического интерфейса пользователя (GUI). Однако рекомендуется приобрести GUI (Таблица материалов). Следующие инструкции когда ссылаясь на программное обеспечение 1 будет предположить, что в сочетании с коммерчески доступных инструментов GUI, и прилагается пример сценария обработки данных.
    1. Откройте программное обеспечение для анализа соответствующих многомерных данных, нажмите кнопку «Импорт данных» и выберите тип файла для анализа.
      1. В программное обеспечение 1 Ввод «Анализ» в окно команд, чтобы открыть графический интерфейс. Щелкните правой кнопкой мыши поле X, чтобы найти «Импорт данных».
      2. В программное обеспечение 2 перейдите на вкладку «Файл», чтобы найти «Импорт».
    2. Импорт образцов, вода и базовые спектры как наборы данных в рабочую область, выбрав все спектры в каждом наборе отдельно и нажав «Открыть» и дать каждому набору короткое имя, например, «Ват» для набора воды спектров.
    3. Выберите новую таблицу/матрица, нажав кнопку «Новая матрица/вектор» и генерировать вектор n × 1, где n — это количество выборок. Ввод паразитемии каждого образца и дать имя «Паразитемии» вектор.
      1. В программное обеспечение 1 нажмите кнопку «Новая переменная» в окне командной строки.
      2. В программное обеспечение 2 щелкните значок «Новый Matrix».
    4. Печать данных, нажав кнопку «Печать данных значок». Осмотрите спектры для водяного пара эффектов, нажав кнопку «Масштаб» и масштабирование на 1800-1400/см; наиболее четко прослеживается как короткий, резкий, узкие пики вдоль склонов в Амида я и амидной группы II.
    5. В случае экстремальных водяного пара откройте вкладку Правка/предварительного-процессных данных и выберите пункт «Сглаживание». Уменьшить шум и/или сильной водяной пар взносов путем сглаживания образца и воды спектры с использованием до 25 точек сглаживания или использовать метод коррекции водяного пара.
    6. Правильно-горизонтальные базовый с помощью базовой коррекции алгоритма, если это уместно, на вкладке Правка/предварительного-процессных данных же шаге 2.1.4.
    7. Средняя спектров воды и скопируйте матрица размера m n × эквивалентна образца набора данных строки и сократить его до 70% интенсивности, умножив его на 0,7.
      1. В программное обеспечение 1 сделать это в окне команд, вводя следующий сценарий «AverageWater=mean(WaterDataset)». Затем скопировать вставить строки соответствует образец набора данных. Чтобы уменьшить интенсивность, ввод «AverageWater70 = AverageWater * 0,70».
    8. Вычтите среднее воды спектров от каждого образца спектра.
      1. В программное обеспечение 1, сделать это в окне команд путем ввода следующего сценария «WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70».
    9. Откройте вкладку Правка/предварительного-процессных данных, чтобы применить второй производной функции и затем нормализовать данные, выбрав функцию одной нормальной варьировать (SNV) и означает центр данных.
      1. В программное обеспечение 1 сделайте это в одном дыхании. Сначала выберите «Дериватив» и 25 точек ввода сглаживания, полином порядка 3 и производной порядка на образце с помощью 25 точек сглаживания и функцию Савицкий Голея. Затем выберите «SNV» и «Означает центр». Нажмите кнопку «Хорошо/применить».
    10. Откройте вкладку Правка/предварительного-процессных данных и в «Столбец переменные», выберите 2980-2800/см и 1750 – 850/см, убедившись, что галочкой только их коробки.
  2. Анализ данных
    1. Анализ основных компонентов (PCA)
      1. Нажмите кнопку «анализ | Разложение» и выберите PCA.
        1. В программное обеспечение 1 нажмите кнопку «Создать модель».
        2. В программное обеспечение 2 PCA методы ввода. Ввод оптимальное количество основных компонентов (шт.) - в этой работе, 7 - и максимум 100 итераций и выберите перекрестной проверки для проверки метода. Нажмите «Запустить».
      2. Наблюдать за предел доверия 95%, пунктирная кольцо, на участке счеты между PC1 и PC2.
      3. Марк образца спектры с количеством баллов, которые происходят вне предела как потенциальных останцы, используя «Выберите спектры инструмент».
      4. Если отмеченные спектры имеют высокие значения2 Hotellings T и высокой остатков Q исключить их из дальнейшего анализа.
    2. Частичный метод наименьших квадратов регрессии (PLS-R)
      1. Нажмите кнопку «анализ | Регрессия» и выберите «PLS-R».
        1. В программное обеспечение 1, щелкните правой кнопкой мыши блока Y и выберите вектор «паразитемии | Построить модель».
        2. В программное обеспечение 2 PLS-R методы ввода. Выберите векторный «Паразитемии» как ссылка на «Y» и образец набора данных как «X набора данных» и выберите перекрестная проверка как метод проверки. Нажмите «Запустить».
      2. Анализ модели регрессии. Значения R2 над 0,80 и Корень среднеквадратичной ошибки перекрестной проверки (RMSECV) значения, которые меньше, чем 0.1% паразитемии являются приемлемой модели.
      3. Анализ вектора регрессии и идентификации биологических групп.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Участок частично наименьших квадратов (PLS-R) и его ассоциированных регрессии вектор, Рисунок 1a и 1b соответственно, показывают, что сигнал от паразитов являются достаточно отличаются от БС, которые они могут использоваться для формирования модели линейной регрессии, чтобы использоваться для Прогнозирование паразитов в будущих наборах данных.

Надежный, линейная модель PLS-R был сге...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLS-R модель находится под наблюдением многомерный метод, который находит линейную связь, Y = bX + E, между прогнозирования переменными X (здесь, поглощения на каждом волновое) и непрерывной переменной Y (здесь, на уровень паразитемии). Короче говоря, модель сочетает в себе переменные в X, чтобы создать новый набор скрытых переменных (ПЗ), которые захватывают дисперсии на X коррелирует с Y и вычисляет вектор регрессии (b), умноженное на новый спектр результаты в оценке значения y. Сила модели могут быть взяты из двух зна...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование авторам было предоставлено Австралийский исследовательский совет (стипендий FT120100926 будущее в BRW), национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (Грант программы и старший стипендий для ИГБ; Начале карьеры стипендии JSR; Инфраструктуры для научно-исследовательских институтов поддержки схемы Грант института Burnet), и оперативной инфраструктуры правительство викторианской государственной поддержки Грант института Burnet. Мы признаем, что г-н Финлей хвостовик для инструментальной поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Донорская кровь-должна быть собрана квалифицированным врачом
Исходная кровьАвстралийский Красный Крест'-
3D7 Plasmodium falciparumИнститут Бернета-Лабораторияштамм дикого типа
эквивалент RPMI-1640 среда с L-хепами без бикарбоната натрияSigma AldrichR6504
Albumax (Gibco)ThermofisherE003000PJаликвоту в соколиные пробирки объемом 50 мл и хранить в морозильной камере
Бикарбонат натрияSigma AldrichS5761
Giemsa StainSigma Aldrich48900
СорбитSigma AldrichS1876Необходимо отфильтровать перед использованием в культуре
Пробирки для сбора крови (Vacutainers)Becton, Dickonson and Company367671
Погружное маслоThermofisherM3004
50 мл чашки для культурFalcon353025
25 мл наконечники для пипетокFalcon357515
10 мл наконечники для пипетокFalcon357530
Предметные стекла для микроскопаSigma AldrichS8902
Центрифужные пробирки 50 млSigma AldrichT2318
Автоматизированный контроллер пипеткиIntegra-biosciences155 015
Sorvall Legend X1R ЦентрифугаThermofisher75004260
Forma™ 310 Инкубаторы прямого нагрева CO2Thermofisher310TS
Nikon Eclipse E-100 Бинокулярный микроскопNikon InstrumentsE100_2CE-MRTK-1При покупке убедитесь, что объектив 100x содержит масло иммерсионный объектив
Bruker Alpha FT-IR спектрометр с быстроразъемным креплением ATRBruker9308-3700Обязательно запросите насадку "Eco-ATR" при покупке
программного обеспечения для многомерного анализа данныхMatlabMathworks Inc
Unscrambler XCAMOПрограммное обеспечение для многомерного анализа данных
PLS-ToolboxMathworks, Inc.Графический интерфейс пользователя для Matlab
Программное обеспечение для многомерного анализа данных

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).
  2. World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
  3. Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи