Микроскопия на основе методов для оценки миграции эпителиальных клеток во время в Vitro заживление ран

Summary

Эта рукопись описывает, как разрез как поражения на искусственный эпителиальных клеток монослои удобно модель раны исцеления в пробирке, позволяя для воображения, конфокальная или лазерная сканирующая микроскопия, и которые могут обеспечить высокое качество количественные и качественные данные для изучения поведения клеток и механизмы, участвующие в миграции.

Abstract

Миграции клеток является обязательным аспектом для заживления ран. Создание искусственных раны на животных моделях исследования часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, хотя потенциально не хватает точности. В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает подходящую платформу для исследования миграционных поведение ячейки в заживлении ран и влияние лечения на эти клетки. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются в условиях не притока; Однако этот подход может не напоминают природные условия заживления. Нарушения целостности эпителия механическими средствами создает реалистичной модели, но могут препятствовать применению молекулярных методов. Следовательно, микроскопии основанные методы являются оптимальными для изучения миграции эпителиальных клеток в пробирке. Здесь мы подробно два конкретных методов, искусственного рану скретч пробирного и Фронт assay искусственных миграции, который может получить количественные и качественные данные, соответственно, на мигрирующих производительность эпителиальных клеток.

Introduction

Клетки миграции необходим для заживления ран, как он несет ответственность за окончательное закрытие эпителиальных разрыва и восстановлению нарушенных поверхности¹. Выполнение искусственных раны в животных моделях позволяет для репликации этого сложного процесса в физиологических условиях². Однако этот подход часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, которые потенциально не хватает точности для изучения различных процессов, из-за сложного характера процесса заживления раны.

В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает полезной альтернативой жи....

Protocol

1. искусственные рану скретч Assay количественных исследований

1. Подготовка клетки однослойная
   1. Работая в стерильных условиях, семян и расти Mv1Lu или HaCaT эпителиальных клеток в культуре колбы с использованием сыворотки дополнено средней. Обновление среды один раз каждые 24-48 ч. После того, как клетки достигают 80% слияния, отсоедините клеток с использованием соответствующего метода, т.е., trypsinization⁹.
      Примечание: Mv1Lu и HaCaT эпителиальных клеточных линий культивируемых с помощью EMEM и DEMEM питательной среды, соответственно, с 2 мм L-глютамина и инкубировали при 37 ° C с контролируемо....

Results

Искусственные рану скретч Assay количественных исследований: оценки эпидермального фактора роста (EGF) содействие миграции:

EGF является известный индуктор распространения эпителиальных клеток и миграции, и таким образом положительный контроль для количественной оценки миграции продвижение. Mv1Lu и HaCaT клеток монослои были использованы в рану скретч анализов и предварительной обработки изображений были получены. После прививки с .......

Discussion

После кожи или слизистой нарушения барьер функция восстанавливается действиями многочисленных типов клеток, включая фибробластов или иммунной и эпителиальных клеток. Слитно, эти клетки проходят комплекс процесса с участием апоптоза, распространения, дифференциация и главное, фибробластов и эпителиальных клеток миграции, который является конечной механизма, ответственного за восстановление нарушенных тканей и Закрытие поверхностные эпителиальные разрыв^1,12 таким о.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Дульбекко s Модифицированная среда Eagle (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	Дополнительная добавка 10 % FBS
Eagles' s Минимальная незаменимая среда (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Необязательно 10 % добавка FBS
L-Glutamine		Lonza BE17-605E	Использование при дозе 2 мМ
фетальной бычьей сыворотки (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA США	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, США	T4049	Разбавьте по мере необходимости
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Луис, Миссури, США	P9155
Фосфатный буферный раствор Дульбекко (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Разбавить до 1x
24-луночных культуральных планшетов	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-луночных культуральных планшетов	SARSTEDT	83-3920
Эпидермальный фактор роста (EGF)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	E9644	Использовано 10 нг/мл
Круглое защитное стекло	MENZEL-GLÄ SER	MENZCB00120RA020	КОРОТКАЯ ГЛУБИНА РЕЗКОСТИ
Усиленное бритвенное лезвие No 743	Martor (через VWR)	MARO743.50
200 &микро; l стерильные аэрозольные наконечники для пипеток	VWR	732-0541
20 & микро; l стерильные аэрозольные наконечники для пипеток	VWR	732-0528
Цифровая камера сопряженный фазово-контрастный микроскоп	Motic Испания Moticam	камера 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Конфокальный микроскоп	ZEISS Microimaging, Германия	LSM 510 META
10 см Чашка для культур	BD FALCON	353003
Кролик поликлональное антитело против c-Jun	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Использовано 1:100
Антикролик IgG (поликлональная коза) AF 488	Invitrogen	A11008	Использовано 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	14530	Использовано 1:1000
Alexa Fluor 594 фаллоидин (в метаноле) (красный)	Invitrogen	A12381	Использовано 1:100
Бычья сыворотка Альбумин	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	T9284
Обезжиренное молоко	BD DIFCO	232100
ImageJ	Национальный институт здравоохранения, США	Выпуск 1.50i
Zen LSM 510 Программное обеспечение для обработки изображений	ZEISS Microimaging,	Германия Выпуск 5.0 SP 1.1