Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изготовление процедуры и двулучепреломления измерения для проектирования магнитно реагировать лантаноиды Ион Хелатирующие фосфолипидного сборок

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56812

⸱

3 января 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, 2MAX IV Laboratory, Lund University

В этой статье

Краткое содержание

Изготовление процедуры весьма магнитно реагировать лантаноиды Ион Хелатирующие полимолекулярных сборки представлены. Магнитный ответ это продиктовано размер сборки, который портняжничан экструзией через Нанопор мембраны. Магнитные alignability Ассамблей и температуры индуцированные структурные изменения контролируются двулучепреломления измерений, Бесплатный метод ядерного магнитного резонанса и малоуглового рассеяния нейтронов.

Аннотация

Bicelles представляют собой перестраиваемый диска как полимолекулярных сборки формируется из разнообразных смесей липидов. Приложения находятся в диапазоне от мембранных белков структурных исследований ядерного магнитного резонанса (ЯМР) Нанотехнологическое событиям, включая формирование оптически активных и магнитным переключаемый гели. Такие технологии требуют высокий контроль сборки размер, Магнитный ответ и тепловое сопротивление. Смеси 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-фосфохолин-3 (DMPC) и его лантаноиды Ион (Ln3 +) хелатирующих фосфолипидного конъюгата, 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-фосфо этаноламина диэтиленгликоля triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), собрать в высоко магнитно гибкой сборки, такие как DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (молярное соотношение 4:1:1) bicelles. Введение холестерина (Чол-OH) и стероидных производных в бислой результаты в другой набор сборок, предлагая уникальные физико химических свойств. Для состава данного липидов магнитные alignability пропорционален размеру bicelle. Комплексообразование Ln3 + приводит к беспрецедентной магнитные ответы с точки зрения как масштабов, так и выравнивание направление. Термо обратимые распада диска подобных структур в везикулы при нагревании позволяет, пошив Ассамблей измерений методом экструзии через мембранные фильтры с определенными поры размеров. Магнитно юстировка bicelles регенерируются путем охлаждения до 5 ° C, в результате Ассамблея измерения определяется везикул прекурсоров. Здесь это изготовление процедура описана и магнитные alignability Ассамблей количественно измерениями двулучепреломления под 5,5 Т магнитного поля. Двойное лучепреломление сигнал, происходящих из фосфолипидов бислой, далее позволяет осуществлять мониторинг полимолекулярных изменений, происходящих в бислой. Этот простой метод дополняет ЯМР экспериментов, которые обычно используются для описания bicelles.

Введение

Bicelles — диск как полимолекулярных сборки, полученные из многочисленных смеси липидов. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 они широко используются для структурной характеристики мембраны биомолекул методом ЯМР спектроскопии. 6 , 7 Однако недавние усилия призваны расширить поле возможных применений. 5 , 8 , 9 наиболее изученным bicelle система состоит из смеси 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-фосфохолин (DMPC), составляющих плоская часть Ассамблеи и 1,2-dihexanoyl -sn- glycero-фосфохолин-3 (DHPC) фосфолипиды, охватывающих край. 1 , 2 , 3 молекулярная геометрия фосфолипидов, составляющих бислой диктовать архитектура собственн-собранные полимолекулярных структуры. 4 , 5 замена DHPC с DMPE-DTPA генерирует высоко магнитно гибкой и перестраиваемая bicelle систем. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (молярное соотношение 4:1:1) bicelles связать со многими более лантаноиды парамагнитных ионов (Ln3 +) на бислой поверхности, что приводит к расширенной Магнитный ответ. 10 Кроме того, заменив водорастворимый молекул DHPC с DMPE-DTPA/Ln3 + позволяет формирование разбавления устойчивостью bicelles. 11

Магнитные alignability Вселенский полимолекулярных сборок это продиктовано их общей магнитной энергии,

figure-introduction-1(1)

где B магнитного поля, figure-introduction-2 магнитная постоянная, n число агрегации и figure-introduction-3 молекулярные диамагнитного восприимчивость анизотропии сочинять бислой липидов. Таким образом ответ DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles на магнитных полей с учетом их размера (совокупного числа n) и Δχ анизотропия молекулярных диамагнитного восприимчивость. Последний достигается легко, изменив характер хелатные Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 введение холестерина (Чол-OH) или других стероидных производных в бислой предлагает возможность настройки совокупного числа n и магнитной восприимчивости Δχ сборок. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 для данного липидной композиции, большие сборки содержат более липиды, способных содействовать Emag (больше совокупного числа n), что приводит к более юстировка видов. Например, размер DMPC/DHPC bicelles, условно контролируется с помощью оптимизации составления соотношение или общей концентрации липидов. 20 , 21 , 22 хотя это возможно в DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, их термо обратимые преобразования из bicelle везикулы при нагревании предлагает добавил пошива вариантов. Механический означает, такие как прессование через мембранные фильтры позволяет формирование пузырьков. Магнитно юстировка bicelles восстанавливаются после охлаждения до 5 ° C и их размеры зависят от везикул прекурсоров. 11 здесь, мы ориентируемся на возможности изготовления механических процедур с DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1) или DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5) как справочных систем. Этот процесс работает аналогично при работе с другими Ln3 + чем Tm3 +. Широкий спектр возможностей, предлагаемых этими методами выделены на рисунке 1 и подробно обсуждаться в другом месте. 23

figure-introduction-4
Рисунок 1: схема обзор процедур возможно изготовление. Изучал магнитно юстировка Ln3 + хелатирующий полимолекулярных сборки состоят из либо DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1) или DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5). Сухой липидной пленки гидратированных с фосфатного буфера 50 мм на рН 7,4 и концентрации всего липидов — 15 мм. Эффективное увлажнение липидной пленки требует либо заморозить оттаивания циклов (FT) или нагрева и охлаждения циклов (H & C). H & C циклов необходимо регенерировать образцы после последнего замораживание, оттаивание шаг, или для повторного создания образцов хранятся замороженные течение длительного периода времени, если они должны использоваться без дальнейшего экструзии. Эти шаги подробно обсуждаются Isabettini и др. 23 максимально юстировка полимолекулярных сборки достигаются, доставлять различные Ассамблеи архитектуры на основе липидного состава. Bicelle размер и магнитные alignability перестраиваемый методом экструзии (Ext) через Нанопор мембранные фильтры. Представленные выравнивание факторы Af были вычислены от 2D малоуглового нейтронного рассеяния (SANS) моделей DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5) образца, прессованные через 800, 400, 200 или 100 Нм поры. SANS измерения являются дополнительные средства количественной оценки bicelle выравнивания, которые не будут охвачены более подробно здесь. 11 , 16 f колеблется от -1 (параллельные нейтронного рассеяния или перпендикулярной выравнивание bicelles в отношении направления магнитного поля) до 0 для изотропной рассеяния.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Структура bicelles был подробно изучен широкий спектр характеристик методов. 13 выравнивание bicelles воздействию магнитного поля была количественно с помощью ЯМР спектроскопии или небольшой угол нейтронного рассеяния (SANS) эксперименты. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 однако shift и расширение вершины ЯМР, происходящих в присутствии Ln3 + , серьезные ограничения на метод. 15 , 26 , 27 , 28 хотя SANS эксперименты не страдают от этого ограничения, альтернативные и более доступные методы желательны для рутинной квантификации магнитно индуцированных выравнивания сборок в решении. Двойное лучепреломление измерения являются жизнеспособной и сравнительно простой альтернативой. Аналогично для ЯМР эксперименты, двойное лучепреломление измерения показывают ценную информацию о перестановках липидов и фазы липидов, происходящих в бислой. Кроме того контролируются геометрические преобразования, происходящие в Ассамблее полимолекулярных с изменением экологических условий, таких как температура. 11 , 12 , 13 , 16 Δn′ магнитно индуцированных двулучепреломления был использован для изучения различных типов систем фосфолипидов. 13 , 29 , 30 двулучепреломления измерений на основе Техника модуляции фазы в магнитном поле является жизнеспособной метод для определения ориентации bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 возможность расследования bicelles с двулучепреломления в сильных магнитных полях до 35 Т была продемонстрирована также м. Liebi и др. 13

Когда поляризованный свет входит анизотропный материал, он будет преломляется в обыкновенной и необыкновенной волны. 11 две волны имеют разные скорости и перенесены в фазе замедления δ. Степени отсталости δ измеряется и преобразуется в сигнал двулучепреломления figure-introduction-5 для количественной оценки степени анизотропии материала с помощью метода

figure-introduction-6(2)

где λ — длина волны лазера и d — толщина образца. Фосфолипиды оптически анизотропными и их оптической оси совпадает с их длинные молекулярные осей, параллельно хвосты углеводородов. 11 , 12 не замедления измеряется если фосфолипидов произвольно ориентированных в растворе. Замедления измеряется, когда фосфолипидов выравниваются параллельно друг другу. Магнитно индуцированных двулучепреломления figure-introduction-7 может иметь положительный или отрицательный знак в зависимости от ориентации молекул в магнитном поле; Смотрите Рисунок 2. Фосфолипиды, соответствие параллельно оси x приведет к отрицательным figure-introduction-8 , в то время как выровнены вдоль оси z привести положительный figure-introduction-9 . Не двулучепреломления наблюдается, когда оптической оси совпадает с направлением распространения света, как фосфолипидного выравнивает параллельно оси y.

figure-introduction-10
Рисунок 2: Выравнивание фосфолипидов и соответствующий знак магнитно индуцированных двулучепреломления figure-introduction-11 . Знак, измеренной figure-introduction-12 зависит от ориентации фосфолипидов в магнитном поле. Пунктирные линии указывают на оптической оси молекулы. Свет поляризовано на 45° и распространяет в направлении оси y. Магнитное поле B — в направлении z. Этот рисунок был изменен с. м. Liebi. 11 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В случае изотропных коллоидных подвеска bicelles ориентации, вызванных расположение фосфолипидов в бислой будут потеряны, обнуление δ отсталости. Bicelles должны также согласовать для того, чтобы ориентировать оптически активных фосфолипидов в их бислоев, вызывая замедление δ поляризованного света. Следовательно двойное лучепреломление является чувствительной инструмент для количественной оценки магнитные alignability полимолекулярных сборок. Bicelles соответствие перпендикулярно магнитное поле даст положительный figure-introduction-13 , в то время как те параллельно краю даст отрицательный figure-introduction-14 . Знак зависит от согласования установки и могут быть проверены с эталонного образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Изготовление процедура DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1) и DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5) полимолекулярных сборок

  1. Предварительная подготовка
    1. Мытье посуды, перемещая раз с этанолом стабилизировалась хлороформ (> 99% хлороформ) и сухим сжатым воздухом.
    2. Производить 2 различных 10 мг/мл акций решения DMPC и DMPE-DTPA в этанол стабилизированный хлороформе (> 99% хлороформ), 10 мм раствор Чол-ой в хлороформе, этанол стабилизированный (> 99% хлороформ) и 10 мм Стоковый раствор TmCl3 в метанола.
    3. Подготовка 50 мм фосфатного буфера на рН 7,4, смешивая 0,121 г натрия дигидроген фосфата дигидрат и 0.599 г безводного ди-натрия фосфат водорода в 100 мл сверхчистого H2O.
  2. Подготовка фильма сухой липидов
    1. Весить необходимое количество amphiphiles (DMPC, DMPE-DTPA и при необходимости Чол-OH) и Ln3 + биржевые решения отдельных 3 мл стекла оснастки чашки с 2,5 мл шприц стекла.
      1. Объем образца 3 мл DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1, всего липидные концентрации 15 мм), весят в 3.6435 g DMPC Стоковый раствор, 1.4731 g, DMPE-DTPA Стоковый раствор и 0.7126 г TmCl3 Стоковый раствор.
      2. Для объем образца 3 мл DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5, концентрации липидов всего 15 мм) весят в 2.9148 g DMPC Стоковый раствор, 1.4731 g DMPE-DTPA Стоковый раствор, 1.0749 g Чол-OH Стоковый раствор и 0.7126 g Стоковый раствор TmCl3 .
        Предупреждение: Хлороформе и метаноле токсичных и летучих при комнатной температуре. Работа под вытяжной шкаф и оперативно приступить к измерений массы.
    2. Перенос контента оснастки чашки на 25 мл вокруг нижней колбе. Очистите каждый оснастки Кубок в колбу круглым дном с около 2,5 мл соответствующего растворителя.
    3. Удаление растворителя под вакуумом в роторный испаритель при 40 ° C. Задайте начальное давление до 30 000 Па до тех пор, пока удаляется большая часть растворителя. Снижение давления до 100 Па и сухой образца под вращения для минимум 2 ч. получить равномерное сухой липидов фильм на стенах стеклянная колба.
    4. Место в фильме сухой липидов за 1 минуту под устойчивый поток аргона, чтобы избежать окисления липидов в воздухе и хранить в морозильной камере до регидратации образца.
  3. Увлажнение сухой липидной пленки
    1. Добавьте 3 мл раствора фосфатного буфера для раунда нижней колбе достичь концентрации всего липидов 15 мм.
    2. Выполняют цикл замораживания оттаивания (FT) путем погружения колбу под вращения в жидком азоте до тех пор, пока он полностью заморожен (жидкого азота остановки кипящей), а затем тепло обратно до 60 ° C, поместив образца для 5 мин на водяной бане, закрученной фляга непрерывно для помощь процесс плавления. Применить 30 s vortexing перед каждым замораживания цикла, когда образец жидкость для помощи гидратации липидной пленки.
      Примечание: Не липидной пленки должны быть видны на стенках колбы после второй заморозить цикл оттаивания.
    3. Повторите 1.3.2 в общей сложности пять раз. Закройте флакон с крышкой, чтобы избежать ненужных испарения фосфатного буфера, когда образец горячие. Протокол может быть приостановлена, когда образец замораживается.
    4. Перейти к двум нагрева и охлаждения (H & C) циклов стабилизации выходит последний шаг замораживания образца или сохранить замороженные на срок до двух месяцев. Тепла для 40 или 60 ° C для DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + образца (молярное соотношение 4:1:1) или DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5), соответственно, до охлаждения до 5 ° C на 1 ° C/мин сохранить образец 5 мин на максимум и минимум Температура цикла.
    5. Теперь, либо определения двулучепреломления сигнал образца во внешнем магнитном поле (шаг 2) или далее выдавить образца адаптировать bicelle размеры и магнитные alignability (шаг 1.4).
      Примечание: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1) образцы состоят главным образом из bicelles с среднее гидродинамических диаметром DH 70 нм, как свидетельствуют число распределения полученных от динамического рассеяния света (DLS) измерений при 5 ° C. Эти примеры также содержат больше полимолекулярных сборки с среднее DH 500 Нм, как свидетельствуют распределения интенсивности света. DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5) образцы являются весьма полидисперсных размером с типичными интенсивности дистрибутивов, раскрывая среднее DH 700 Нм, в то время как число распределений выявить населения преобладают небольшие bicelles в диапазоне размеров от 200 Нм. Isabettini et al. сообщили более подробную размер распределений и крио передачи электронной микроскопии изображений этих образцов 23
  4. Экструзия полимолекулярных сборок.
    1. Соберите экструдера, как показано на рисунке 3. Использовать перчатки и пинцет с защитой кремнезема трубы для обработки. Мокрый фильтр бумага (5) с несколькими каплями буфера для оптимального размещения мембранный фильтр (6). Убедитесь, что бумага имеет без складок после размещения уплотнительное кольцо (7) на вершине.
      Примечание: Процесс экструзии был протестирован на мембранные фильтры (6) с порами диаметром 800, 100, 200 и 400 Нм; Смотрите Рисунок 7.
    2. Установить ванну водой до 40 ° C для DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1) образцы или 60 ° C для DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5) образцов гарантировать формирование Выдавливаемое везикулы.
    3. Подключите экструдера к бутылке под давлением азота с использованием высокого давления Трубка ПВХ (> 4 МПа) с serto адаптеров и выталкивать жидкого материала через мембрану. 1 MPa давления обычно требуется для экструзии через мембранные фильтры (6) с порами диаметром 200 Нм и выше. 1,5-2,5 МПа требуются для небольших мембранные фильтры (6) с порами диаметром 100 Нм.
      Примечание: Изменить мембранный фильтр, если аномально высоких давлений (> 2,5 МПа) требуются для выдавливания образца (это является первым признаком засорения).
    4. Откройте крышку (10) и вставьте образца с помощью пипетки стеклянные 2 мл. Затем закройте крышку (10) и откройте клапан (12) удерживая образца отводной трубки (2). Закройте клапан давления (12) после завершения цикла экструзии, вентиляционные и продолжать следующего цикла.
      Примечание: Не оставляйте образца в контакт слишком долго с горячей с рубашкой судна (8) чтобы избежать чрезмерного образца потери испарением.
30-60 s является достаточно времени для 3 мл образца сбалансировать в экструдере перед открытием клапана давления (12).
  • Перейти к 10 циклов экструзии для измерения порового данной мембраны, как показано на рисунке 3. Большинство систем bicelle выдавливаются 10 раз через мембраны с порами диаметром 200 и еще 10 раз через мембраны с порами диаметром 100 Нм, гарантируя образца сопоставимости.
  • Теперь определения двулучепреломления сигнал образца во внешнем магнитном поле (шаг 2).

    • figure-protocol-1
    Рисунок 3: Лаборатория экструдер для подготовки bicelle и везикул. Экструдер монтируется снизу вверх: Гора (1), (2) сбор пространства с 2,4 мм (внутренний диаметр) пластиковые отводной трубки и уплотнительное кольцо (3) и (4) больших и малых стабилизации сетки, (5) фильтр бумага, (6) мембранные фильтры, уплотнительное кольцо (7), (8) с рубашкой судна, образец (9. ) крышка с впускной и давления подключения, (10) крышка, винты (11) бабочка, клапан давления (12). Эскиз собрал экструдера показано на правой стороне. Газ азот (N2) поставляется на сосуд под давлением и с рубашкой судна (9) подключен к ванне с водой для контроля температуры. Образец проходит 10 циклов экструзии для любой данной мембранный фильтр поры диаметром (образец пути показаны синим цветом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    2. Двойное лучепреломление измерения DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1) и DMPC/Чол-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 16:4:5:5) полимолекулярных сборок.

    1. Строить и подключите двулучепреломления установки, представленные на рисунке 4 и энергоснабжения соответствующих электронных элементов. Не ставьте PEM, образца и второй поляризатор в пути лазера на данном этапе. Избегайте обнаружения обратно рассеянного лазерного света, покрывая отражающими поверхностями, например алюминия зеркало держатели, с черной бумагой.
    2. Настройка зеркала, чтобы максимизировать интенсивность лазера на детектор, который представлен интенсивность постоянного тока figure-protocol-2 получил от фильтра низких частот в Рисунок 4B.
      Предупреждение: Носить защиты соответствующих глаз при корректировке зеркала и проконсультироваться с преподавателем лазерной безопасности если манипулирования лазеры для в первый раз.
    3. Поверните первый скрещенных линейный поляризатор (поддерживается перпендикулярно падающего луча) для максимального figure-protocol-3 .

    figure-protocol-4
    Рисунок 4: Схематическое представление двойное лучепреломление установки и соединения для оптических сигналов. A) сверхпроводящих электромагнитов поставляет 5,5 Т магнитного поля. Свет от лазерного диода в 635 нм поляризовано двумя скрещенными поляризаторами. Photoelastic модулятор PEM-90 работает на частоте 50 кГц с амплитудой0 2.405 рад и помещен между двумя поляризаторов. Образец находится в магнит между PEM и второй поляризатор. Non поляризационные зеркала направлять свет через различные элементы и окончательно определяется фото детектор. Первый и второй гармоники figure-protocol-5 и figure-protocol-6 сигнала переменного тока контролируются, позволяющих расчет сигнала двойное лучепреломление, давая информацию о магнитных alignability Ln3 + Хелатирующие полимолекулярных сборок. Кювета образец подключен к внешней водяной бане для контроля температуры (синий). Температура образца осуществляется с датчика температуры (красный). B) сигнал от фото детектора подается во второй фильтр низких частот порядка Саллан-ключ (24 V AC источник питания) с частотой отсечения 360 Гц через ±12 V DC braded кабель питания (3). Фильтр низких частот извлекает компонент постоянного тока figure-protocol-7 и доставляет его к ПК интерфейс (4) через BNC 50 кабель Ω. Сигнал от фото детектор доставляется на два замка в усилители (который извлечь первый и второй гармоники figure-protocol-8 и figure-protocol-9 ) через BNC 50 кабель Ω (1) & (2). Гармонический интенсивности обнаруживаются фазочувствительные обнаружения. Следовательно PEM сигнал используется как эталонный сигнал для блокировки в усилители (1f-выход PEM в первый усилитель блокировки и 2f-вывода в секунду, связана с BNC 50 Ω кабели). Выходные сигналы поставляются к блоку ПК интерфейс через кабели Ω BNC 50. Аналоговый приобретение единиц СЛП Ай-110 и СЛП CB-1 оцифровывать сигнал, который передается на компьютер через кабель RS 232 для мониторинга. Датчик температуры типа K также подключен к ПК интерфейс подразделение, где аналоговый приобретение единиц СЛП CB-3 и СЛП TC-120 оцифровка сигнала перед передачей его на компьютер через кабель RS 232 для мониторинга. C) картину схема установки, представленных в B. Ключевые элементы определяются соответствующими числами от 1 до 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    1. Поместите второй скрещенных линейный поляризатор перпендикулярно инцидента лазерный луч, как показано на рисунке 4A. Свести к минимуму figure-protocol-10 , установив второй поляризатор под углом в 90° относительно первого.
    2. Место photoelastic модулятор (PEM) при 0° между двумя скрещенными линейные поляризаторы и перпендикулярно инцидента лазерный луч, как показано на рисунке 4A. Отрегулируйте PEM на частоте 50 кГц и амплитуда A0 до 2.405 rad, как показано на рисунке 5А. Это делает компонент DC независимо от двулучепреломления и повышает figure-protocol-11 .
      Примечание: Оптической оси PEM могут быть настроены на несколько градусов для поддержания постоянной figure-protocol-12 в воздухе перед началом измерения любого образца.
    3. Подождите 1 час после включения лазера и электронного оборудования для стабилизации сигнала.
    Сигнал является стабильным после поэтапного Авто усилители блокировки в остается неизменным.
  • Поместите образец в контролируемой температуре кварц кювет с длиной пути 10 мм и подключить его к внешней водяной бане, первоначально установлена на 5 ° C.
  • Место 0,5 мм толщиной тип K термопары (датчик температуры) непосредственно в образце для мониторинга температуры образца. Убедитесь, что зонд не вмешиваться с лазерного света, поместив белую в пути лазера (после кювета) и ищет тени, вызванные зонд.
    Примечание: Есть 2-3 ° C разница между записи температуры водяной бани и температура образца.
  • Поместите кювету в отверстие магнита, как показано на рисунке 4A. Лазерный свет распространяет горизонтально через образец, отклоняются не поляризовывать зеркалами и обнаружен фото детектор.
    Примечание: Лазер направлена вниз, через образец и обратно вверх по тому же пути для учета эффектов Фарадея (т.е. вращение плоскости поляризации света, вызванных магнитного поля, когда спускаясь отменяется, когда выходит обратно в противоположном направлении).
  • Применить устойчивый воздушный поток сжатого воздуха при комнатной температуре и 10000 ПА на кювету, чтобы избежать конденсации воды на стенках клеток, которые бы уменьшить интенсивность сигнала и увеличить шум. Это особенно важно при измерении при 5 ° C.
  • Обнаруживать первой и второй гармоники figure-protocol-13 и figure-protocol-14 сигнала переменного тока с двумя усилителями блокировки. Auto этап усилители в замок, нажав на кнопку (2) показано на рисунке 5B и отрегулировать чувствительность, как показано на рисунке 5B (1). Убедитесь, что есть не более чем четыре красных баров на усилители, как показано на рисунке 5B (3) чтобы избежать сигнал перегрузки. Примечание вниз занятых чувствительность для обоих усилителей блокировки в программе Tesla_Magnet_Const_V092 , как показано на рисунке 5 c (8). Программа предоставляется дополнительная информация.
  • Рампа магнитного поля до 5,5 Т, поставляя тока магнит через программу Tesla_Magnet_Const_V092 , как показано на рисунке 5 c (5).
  • Получить двойное лучепреломление figure-protocol-15 с помощью уравнения 2, где отсталость рассчитывается с
    figure-protocol-16(3)
    где figure-protocol-17 и figure-protocol-18 являются функции Бесселя первого рода, с figure-protocol-19 и figure-protocol-20 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 участка отсталости в программе Tesla_Magnet_Const_V092, как показано на рисунке 5 c (4).
    Примечание: Отсталости, предоставляемый программой следует не использоваться для расчета двулучепреломления сигнал, если два усилителя замок не работает на том же чувствительность (см. шаг 2.12). Журнал гармонических интенсивностей figure-protocol-21 и figure-protocol-22 должны умножаться на чувствительность усилители блокировки в, чтобы получить правильные размеры. Кроме того сигнал двойное лучепреломление, измеренное под магнитного поля должны быть нормализованы путем вычитания сигнала означает двойное лучепреломление, полученные на 0 т.
  • Мониторинг сигнала двулучепреломления образца на константу или изменение температуры (1 ° C/мин) путем регулирования температуры водяной бани, подключенных к кювете, показанный на рисунке 4.
  • Журнал экспериментальных данных путем заполнения в описании экспериментальной в Рисунок 5 c (8), указав имя файла (9) и нажав на кнопку «START log» (10).

    • figure-protocol-23
    Рисунок 5: иллюстрации занятых настройки и Скриншоты программы. A) PEM параметры: замедление 2.405 rad, длина волны 635 нм, частота 50 Гц. белые круги показывают какие параметры необходимо активировать (USR = определяемые пользователем отсталости, LOC = локальный режим работы). B) блокировки в параметры усилителя. Чувствительность (1) должен быть выбран перед каждым измерением, требуемой в шаге 2.11. Не должно быть более чем четыре красные полоски на дисплее (3), чтобы избежать перегрузки сигнала. Перегрузка происходит, когда включается красный светодиод (1), делая измерения невозможно. Нажмите кнопку auto фазы (2) перед проведением каждого измерения. C) Скриншоты программы Tesla_Magnet_Const_V092 представлена в качестве дополнительной информации. Программа позволяет контроля магнитного поля и записи всех, который выводит сигнал как функцию от времени. Магнитного поля и температура образца строятся в (1). Первый и второй гармоники figure-protocol-24 и figure-protocol-25 сигнала переменного тока, измеряется двумя усилителями блокировки строятся в (2). Интенсивность постоянного тока figure-protocol-26 строится в (3). Замедление рассчитывается как описано в шаге 2.13 и изобразить в (4). Магнитного поля задано в (5). Прямое измерение температуры, записанные термопары типа K представлена в (6) и выходных сигналов (figure-protocol-27 и figure-protocol-28 ) в (7). Дополнительные примеры информации может быть вставлен в (8) как занятого чувствительность усилители, имя выборки и т.д. Данные могут войти и экспортируются в файл .txt, в (9). Запуск и остановка сбора данных с помощью кнопки «START log» (10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Двойное лучепреломление сигнал-экструдированный DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (молярное соотношение 4:1:1) образец контролируется под 5,5 Т магнитного поля во время нагрева и охлаждения цикла от 5 до 40 ° C и обратно со скоростью 1 ° C/мин (рис. 6). Двойное лучепреломление результаты подтвердили высокие магнитные рядов на 5 ° C со значением 1,5 x 10-5, дважды как сильный сообщил экструдированные систем. 6 ,

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Подробный отчет о как двойное лучепреломление измерения были использованы в комбинации с SANS экспериментов для оценки методов для создания высокой магнитной реагировать Ln3 + Хелатирующие фосфолипидов, сборки находится в Isabettini et al. 23 предлагаемого изготовление протоколы также применимы для сборки, состоящий из более ДПФХ и DPPE-DTPA фосфолипидов или содержащие химически инженерии производных стероидов в их бислоя. 11 ,

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Благодарности

    Авторы признают, Швейцарский Национальный научный фонд для финансирования SMhardBi (проект 200021_150088/1). SANS эксперименты были проведены на швейцарской spallation источник нейтронов SINQ, Поль Шеррер областях, Филлиген, Швейцария. Авторы тепло поблагодарить Dr. Joachim Kohlbrecher за его руководство с SANS экспериментов. Установки измерения двулучепреломления под высокие магнитные поля был вдохновлен из существующей установки в высоких поля магнитной лаборатории HFML, Неймеген, Нидерланды. Мы благодарим Бруно Pfister за его помощь в разработке электроники двулучепреломления установки, Ян Corsano и Даниэль Kiechl для создания рамок, разрешительные штрафа и поверхностным выравнивание лазера и д-р Бернхард Koller для постоянной технической поддержки.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC)Avanti Polar Lipids850345P>99%
    1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-этаноламин-диэтилен триаминпентаацетатная кислота гекмониевая соль (DMPE-DTPA)Avanti Polar Lipids790535P>99%
    Тулий(III) хлоридSigma-Aldrich439649безводный, порошок, 99,9% на основе микропримесей металлов
    Диспрозий(III) хлоридSigma-Aldrich325546безводный, порошкообразный, 99,9% на основе следов металлов
    Иттербий(III) хлоридSigma-Aldrich439614безводный, порошк, 99,9% на основе следов металлов
    ChloroformSigma-Aldrich319988содержит этанол в качестве стабилизатора, реагент ACS, ≥ 99,8%
    МетанолСигма-Олдрич34860≥ 99,9%
    ХолестеринAmresco433Ультрачистый сорт
    D2OARMAR химикаты141099,8 атом % D
    Сверхчистая водаMilliporeSynergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    электронный pH-метрMetrohm17440010
    Whatmann Nuclepore 25 мм 100нм мембранный фильтрVWR515-2028
    Мембранный фильтр Whatmann Nuclepore 25 мм 200 нмVWR515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 мм 400 нм мембранный фильтрVWR515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 мм 800 нм мембранный фильтрVWR515-2032
    Ватман Фильтровальная бумагаVWR230600
    25 мл круглая нижняя колбаVWR201-135214/23 NS
    3 мл стеклянная чашка с защелкамиVWR548-0554ND18, 18x30 мм
    2,5 мл стеклянный шприцHamilton
    Дигидрофосфат натрия дигидратMerk1.06342Соль, используемая для изготовления фосфатного буфера
    ди-натрия гидрофосфатаMerk1.06586Соль, используемая для изготовления фосфатного буфера
    Жидкий азотКарбагас-
    Сжатый азот ГазообразныйCarbagas-200бар
    Липидный экструдер 10 мл Липидный экструдер 10 млЛипекс- Полностью укомплектован термобочкой
    Трубка высокого давления из ПВХGR NETUM-должна выдерживать более 4 МПа
    Адаптеры SertoSerto-нитриловые
    перчаткиVWR-2
    мл стеклянные пипеткиVWR612-1702длиной 230 мм
    NewportLPM635-25C
    DSP Двухфазный синхронный усилительSRS SRSSR830
    Фотодиодный детекторSilonex Inc.SLSD-71N55мм2, Кремний, фотопроводящий
    5,5 Т Криогенный МагнитныйКриогенный/OerlikonAG-12 бар Он охлаждаемый. Компрессор RW4000/6000, RGD 5/100 TA криоголовка
    Фильтр нижних частот второго порядкадомашнего сбора-Линейныйисточник питания 24 В постоянного тока, второй порядок, Sallen Key, частота среза 360 Гц, +/- 12 В, макс. 10 мА
    Фотоупругий модуляторHinds instrumentsPEM-90
    Glan-Thompson Кальцитовый поляризаторNewport10GT04диаметр 25,4 мм
    Кварцевая кювета для образцаHellma165-10-40элемент с регулируемой температурой, 0,8 мл, длина пути 10 мм
    Датчик температурыThermocontrol-TypeK, диаметр 0,5 мм, термокоаксиальный
    неполяризационные зеркалаNewport50326-100225,4 мм
    RS 232 кабелиNational Instruments189284-02для подключения к порту RS-232 на передней панели компактных контроллеров FieldPoint
    BNC 50 и Omega; кабель и разъемыNational Instruments763389-01
    cFP-AI-110National Instruments777318-1108-канальный модуль аналогового ввода напряжения и тока для компактного FieldPoint
    cFP-CB-1National Instruments778618-01Интегрированный соединительный блок для проводки к компактному вводу-выводу FieldPoint
    cFP-CB-3National Instruments778618-03Интегрированный изотермический соединительный блок для подключения термопар к модулю cFP-TC-120
    cFP-TC-120National Instruments777318-1208-канальный модуль ввода термопары для компактного FieldPoint
    cFP-1804National Instruments779490-01Ethernet/последовательный интерфейс для NI Compact FieldPoint
    LabView 2010NationalInstruments-Industrial
    Power питаниеTraco PowerTCL 060-124100-240 В переменного тока
    водяная баняJulaboFP40-HEхолодильный/нагревательный циркуляционный насос
    Диодный лазер

    Ссылки

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81 (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92 (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6 (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26 (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. , ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6 (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28 (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117 (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2 (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. , Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82 (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10 (1), 014601(2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. , Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. , Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. , Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). , Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73 (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48 (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17 (8), 2555-2561 (2016).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    DMPCDMPE DTPA
    Изготовление процедуры и двулучепреломления измерения для проектирования магнитно реагировать лантаноиды Ион Хелатирующие фосфолипидного сборок
    Свяжитесь с нами
    Рекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.