Здесь мы представляем протокол для оценки воздействия пептидов на миграции бронхиальной эпителиальных клеток. Этот метод позволяет для быстрого и высокую воспроизводимость получения количественных данных на скорость миграции и раны закрытия клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Роман в Vitro раны исцеления Assay для оценки миграции клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цель этой работы заключается в том, чтобы показать новый метод для оценки способности некоторых иммуномодулирующих молекул, например антимикробных пептидов (AMPs), чтобы стимулировать миграцию клеток. Важно отметить, что миграция клеток является событием ограничения скорости во время процесса заживления раны, чтобы восстановить целостность и нормальной функции слоев ткани после травмы. Преимущество этого метода над классической assay, которая основана на вручную сделал нуля в монослое клеток, является использование культуры специальных силиконовых вставок предоставление двух отсеков для создания псевдо-рану поля свободной ячейки с четко определенной ширины (500 мкм ). Кроме того благодаря автоматизированной изображения анализ платформы, можно быстро получить количественные данные о скорости закрытия и ячейки миграции рану. Более точно будет показан эффект двух лягушка кожи усилителей на миграции бронхиальной эпителиальных клеток. Кроме того Предварительная обработка этих клеток с специфичные ингибиторы представит информацию о молекулярных механизмов, лежащих в основе таких событий.
Введение
Основном, известно, что заживление ран в животных является основополагающим процесс для восстановления целостности и нормальной функции слоев ткани после травмы1. Несмотря на эпителиальные поверхности, подвергшихся воздействию внешней среды (например, кожи, органов дыхания и желудочно-кишечного тракта) образуют защитный барьер от физических и химических оскорбления, формирование раны может легко произойти, особенно после операция или микробной инфекции2. В качестве примера колонизации легочной ткани, оппортунистических бактериальных патогенов Pseudomonas aeruginosa, особенно в страдающих кистозный фибро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка клетки
- Семенной 2, 5х106 ячеек в 10 мл из минимальных основных средних (MEM) дополнены глютамин 2 мм (MEMg), плюс 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), антибиотики (0,1 мг/мл пенициллина и стрептомицина) и puromycin (0,5 мкг/мл для отбора и техническое обслуживание ячейки строки) в колбе T75. Инкубируйте настой при 37 ° C и 5% CO2 на 2 дня. Перед началом эксперимента, проверьте слияния клеток под инвертированным микроскопом.
Примечание: Ячеек, которые используются для эксперимента, увековечен человека бронхиальной эпителиальных клеток, преобразованы с лентивирусные вектор присвоении сопротивление puromycin. Они стабильно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол был использован для определения ранозаживляющее действие Esc(1-21) и Esc(1-21) - 1 c с точки зрения миграции активность клеток, индуцированной на бронхиальную эпителиальных клеток, выражая функциональные МВТР. В этот assay, культуры пластины были помещены в скважинах плиты 12-Ну, и каждый отсек был посеян с 35.000 клеток в MEMg с 10% FBS. Клетки достигли полного слияния в течение 24 ч. После этого, был создан разрыв 500 мкм, и каждый хорошо был наполнен MEMg, содержащих пепт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Клетки миграция является важным процессом во многих физиологических и патологических мероприятиях, включая заживление ран, развития эмбриона и метастазов рака. Основная процедура для изучения клеток миграции в пробирке включает в себя: (i) создание монослое клеток, (ii) производство псевдо-рана в вырожденная слой клеток, (iii) захвата изображений в разные временные интервалы до заживления закрытие достигается и (iv) анализ последовательности изображений для того, чтобы определить скорость миграции выбранной ячей.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать
Благодарности
Эта работа была поддержана финансирование от университета Ла Сапиенца и итальянский фонд исследований кистозный фиброз (проект FFC #11/2014 принят делегациями FFC от Сиены, Валчиавенна Sondrio, Череа Il Sorriso ди Дженни и Павии). Частью этой работы также было поддержано в Филы Филы Prot. Грант-RU-2014-1020.
Мы благодарны доктора Лоретты Ferrera (U.O.C. генетики Медика, Istituto Giannina Gaslini, Генуя, Италия) для предоставления бронхиальной эпителиальных клеток.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Минимально необходимая среда (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37° C водяная баня перед применением |
| Глутамин | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat инактивированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Пенициллин и стрептомицин | Евроклон | ECB3001D | |
| пуромицин | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Перед применением подогреть при комнатной температуре |
| DPBS без кальция и магния (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS с кальцием и магнием (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Культуральный вкладыш Ibidi 2 лунки | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Анализ изображений | ibidi | 30002 | |
| Программное обеспечение PRISM | Версия GraphPad | 6.0 |
Ссылки
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
