Method Article

Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

DOI:

10.3791/56837

⸱

March 8th, 2018

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biological Sciences, The University of Alabama

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья демонстрирует подробный протокол для изоляции ДНК и высокопроизводительного секвенирования библиотека строительство из материалов гербариев, включая спасение исключительно низкого качества ДНК.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гербариев являются незаменимым источником растительного материала, который может использоваться в различных биологических исследований. Использование образцов гербария связано с рядом проблем, включая пример сохранения качества, деградации ДНК и разрушительной выборки редких образцов. Для того, чтобы более эффективно использовать гербарий материал в большой последовательности проектов, необходим надежный и масштабируемый метод подготовки ДНК изоляции и библиотека. Этот документ демонстрирует надежный, начало в конец протокол для ДНК изоляции и высок объём библиотека строительства от образцов гербария, не требуют изменений для отдельных образцов. Этот протокол является специально для низкого качества сушеных растений материала и принимает преимущество существующих методов путем оптимизации измельчения тканей, изменения выбора размера библиотеки и представляя шаг необязательный reamplification для низкой урожайностью библиотек. Reamplification библиотек ДНК низкой урожайностью может спасти образцов, полученных от образцов незаменимым и потенциально ценный гербарий, отрицая необходимость дополнительных деструктивных выборки и без внесения заметных последовательности смещения для общего Филогенетические приложений. Протокол был протестирован на сотни видов травы, но ожидается быть адаптированы для использования в других линий завода после проверки. Этот протокол может быть ограничено путем крайне деградировавших ДНК, где фрагментов нет нужного размера в диапазоне размеров, и вторичных метаболитов в некоторых растительных материалов, которые препятствуют чистый изоляции ДНК. В целом этот протокол вводит быстрый и всеобъемлющий метод, который позволяет для изоляции ДНК и библиотека подготовка 24 проб в меньше чем 13 h, с только 8 h активного практического времени с минимальными изменениями.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гербарий коллекции являются потенциально ценным источником как видов, так и геномного разнообразия для исследований, включая филогенетики1,2,3, популяционной генетики4,5, сохранению Биология6, инвазивные виды биологии7и черта эволюции8. Возможность получения богатого разнообразия видов, популяций, географических точках, и моменты времени подчеркивает «сундук»9 это гербария. Исторически деградированных характер гербарий, полученных ДНК препятствовало ПЦР-проектов на базе, часто relegating исследователей с использованием только маркеры в высокой копии, например регионов геномом хлоропластов или внутренней трансляции распорку (СТС) о рибосомных РНК. Качества образцов и ДНК широко зависят методы сохранения9,10, с двуцепочечные разрывы и фрагментации от жары, используемых в процессе сушки, будучи наиболее распространенных форм ущерба, создание так называемые 90% ДНК карцер, заполнена на основе ПЦР исследования11. Помимо фрагментации второй наиболее распространенной проблемой в гербарий геномики является загрязнение, такие как, производный от эндофитные грибов13 или грибов приобрел посмертных после сбора, но до монтажа в гербарий12, хотя Эта проблема может быть выполнено bioinformatically, учитывая право грибковых базы данных (см. ниже). Третий и менее распространенные, проблема изменения последовательности через цитозина дезаминирование (C/G→T/A)14, хотя он считается низкой (~ 0.03%) в гербарий образцов11. С появлением высокопроизводительного секвенирования (HTS) вопрос о фрагментации может быть преодолена с короткой читает и последовательности глубины12,15, позволяя геномных данных приобретение от многочисленных образцов с низким качеством ДНК и иногда даже разрешительные весь геном последовательности15.

Гербарий образцы становится все более часто используются и более крупный компонент филогенетических проектов16. Текущий вызов с использованием образцов гербария для HTS неизменно является получение достаточных двойной мель ДНК, является необходимым условием для последовательность протоколов, от многочисленных видов своевременно, без необходимости оптимизации методов для отдельных образцы. В этом документе протокол для экстракции ДНК и библиотека подготовки образцов гербария показано что использует преимущества существующих методов и изменяет их для быстрого и воспроизводимые результаты. Этот метод позволяет для полной обработки от образца к библиотеке 24 пробы в 13 h, с 8 h практическое время, или 16 h, с 9 ч практический время, когда требуется дополнительный reamplification шаг. Одновременная обработка более образцов является достижимым, хотя ограничивающим фактором является мощности центрифуг и технических навыков. Протокол призван требовать только в типичных лабораторное оборудование (Термоциклер, центрифуги и магнитные стенды) вместо специализированного оборудования, такие как распылитель или sonicator, для сдвига ДНК.

Размер фрагментов ДНК качество и количество сдерживающими факторами для использования образцов гербария в высокопроизводительного секвенирования экспериментов. Другие методы для изоляции гербарий ДНК и создания высокопроизводительного секвенирования библиотек продемонстрировали полезность использования как мало, как 10 нг16ДНК; Однако они требуют экспериментально определить оптимальное количество PCR циклов, необходимых для подготовки библиотеки. Это становится нецелесообразным, когда решения с весьма небольшим количеством жизнеспособных двойной мель ДНК (dsDNA), как некоторые образцы гербарий производят только достаточное количество ДНК для приготовления одной библиотеки. Метод, представленные здесь использует единый количество циклов независимо от качества образцов, поэтому не ДНК теряется в шагов оптимизации библиотеки. Вместо этого шаг reamplification вызывается, когда библиотеки не соответствуют минимальной суммы, необходимой для виртуализации. Многие образцы гербарий редки и имеют мало материала, что делает его трудно оправдать разрушительной выборки во многих случаях. Чтобы противостоять этому, представленный протокол позволяет dsDNA ввода размеров менее 1,25 нг в процесс подготовки Библиотека, расширение сферы применения жизнеспособных образцов для высокопроизводительного секвенирования и свести к минимуму потребность в разрушительной выборки образцов.

Следующий протокол оптимизирован для трав и протестированы на сотни различных видов из образцов гербария, хотя мы ожидаем, что протокол может применяться для многих других групп растений. Она включает в себя шаг необязательный восстановления, который может использоваться для сохранения низкого качества или редких образцов. Основываясь на более чем двух сотен гербарий образцов испытания, этот протокол работает на образцах с низкой ткани ввода и качества, позволяя для сохранения редких образцов через минимальным разрушительным выборки. Здесь показано, что этот протокол может обеспечить высокое качество библиотек, которые можно упорядочивать для проектов на базе phylogenomics.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. до начала

  1. Сделать свежий цетиловый триметиламмония бромид (CTAB) буфера17 , добавив 20 g CTAB, 10 g поливинилпирролидона (ПВП) 40, 100,0 мл 1 М трис рН 8,0, 40 мл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8,0, 280.0 мл 5 М NaCl и 400.0 мл реактива воды вместе и довести общий объем до 1 Л, с использованием реагентов класс воды. Отрегулируйте пэ-аш до 8.0.
    Примечание: Дополнительные реагенты могут добавляться к CTAB в зависимости от вторичных соединений в отдельных таксонов. См Allen et al. 18 для тщательного список добавка реагентов.
  2. 10 мкл β-меркаптоэтанол 5 мл CTAB буфера.
    Примечание: это может быть подготовлен в пакеты по 50 мл и хранится при комнатной температуре 3 – 4 недель.
    1. CTAB раствор в ванну с водой 65 ° C тепла.
  3. Холод ступок и пестиков в-20 ° C по меньшей мере 20 мин.
  4. Метка 4 комплекта 2 x n 2-мл пробирок (где n = число выборок). Положите 1 комплект помечены трубы на льду.
  5. Холод изопропиловый спирт на льду или в морозильной камере-20 ° С.
  6. Удаления твердой фазы реверсивные иммобилизации (ОСПР) бисер (см. Таблицу материалы) из холодильника и дать им возможность сбалансировать до комнатной температуры (по крайней мере 30 минут).
  7. Подготовка 80% этанола.
  8. Выберите образцы гербарий для добычи и извлечения ~ 1 см2или 10 мг, ткани в образец, предпочтительно листовой материал.

2. ДНК добыча

  1. Растереть2 ~ 1 см предварительно гербарий ткани с помощью prechilled ступок и пестиков. Добавьте жидкого азота и стерилизовать 30 – 50 мг песка. Растереть до ткани превращается в мелкий порошок.
    Примечание: желательно 10 мг или больше ткани, но менее также работал в некоторых случаях. После испарения жидкого азота, добавьте больше при необходимости до тех пор, пока ткань полностью землю. Другой общий метод для подрыва клеток и тканей является использование било шарик. Однако этот метод оказался не хорошо работать для образцов, используемых в этих экспериментах.
  2. Перевод замороженных порошка на два 2 мл пробирок (добавить не более половины объема трубки). 600 мкл теплым раствором CTAB к каждой пробке и смешайте трубы тщательно путем инверсии и vortexing.
    Примечание: Поскольку количество и качество материалов гербариев зачастую является низким, выполнение изоляции ДНК в двух повторений помогает получить более высокие урожаи.
  3. Проинкубируйте образцы в ванну водой 65 ° C для 1 – 1,5 ч, vortexing каждые 15 мин.
  4. Супернатант центрифуги образцы на 10000 x g для 5 минут передать свежий набор помечены трубы (~ 500 мкл). Выбросите Пелле, с использованием стандартной нехлорированные удаления процедуры.
  5. 4 мкл РНКазы-A (10 мг/мл) к каждой пробке и смешайте переворачивать или закупорить. Проинкубируйте образцы при 37 ° C тепла блок или водой ванну 15 мин.
  6. Добавьте одинаковый объем (~ 500 мкл) 25:24:1 фенола: хлороформ: изоамилового алкоголя смеси, когда трубы достигла комнатной. Смесь тщательно закупорить вверх и вниз и/или с инверсией. Центрифуга трубы на g 12000 x 15 мин передача водный слой (верхний слой) на свежий набор помечены трубы (~ 400 мкл). Отказаться от органического слоя в контейнер хлорсодержащих отходов.
    Примечание: Шаг 2.6 может быть повторен если ожидается большое количество вторичных соединений в растительному материалу.
  7. Добавьте одинаковый объем (~ 400 мкл) 24:1 хлороформ: изоамилового алкоголя смеси. Смесь тщательно закупорить вверх и вниз и/или с инверсией. Центрифуга трубы на g 12000 x 15 мин передача водный слой (верхний слой) на новый набор prechilled, помечены трубы (~ 300 мкл). Отказаться от органического слоя в контейнер хлорсодержащих отходов.
  8. Добавьте одинаковый объем (~ 300 мкл) prechilled изопропанол и 12 мкл ацетат натрия 2,5 М для каждой трубы. Проинкубируйте образцы при-20 ° C за 30-60 мин.
    Примечание: Время инкубации может быть продлен (до ночи инкубации), но качество ДНК будет уменьшаться, чем дольше Проинкубируйте образцы.
  9. Брать пробы из морозильника и центрифуги трубы на 12000 g x 15 мин снимите и выбросьте супернатант нежно не нарушая гранулы. Помыть лепешка, подвеска с свежими 70% этанола (примерно 300 – 500 мкл). Для каждого образца, удвоилось Объедините два отдельных гранул в один с сопутствующими этанола.
    Примечание: Образцы должны быть объединены в одну трубку, сначала с использованием этанола и затем продолжить. Это не надо мыть каждый образец с этанолом отдельно.
  10. Центрифуга для трубы на 12000 g x 10 мин удалить и отбросить супернатант нежно не нарушая гранулы. Воздух сухой гранулы.
    Примечание: Образцы могут быть высушено быстрее с помощью блока сухого тепла (не превышает 65 ° C). Убедитесь, что образцы не слишком сухой, как это может уменьшить окончательный выход ДНК.
  11. Приостановите изолированной ДНК в 50 мкл 1 x TE. Хранить в морозильной камере-20 ° C для длительного хранения или 4 ° C для использования на следующей неделе.

3. контроль качества (КК)

  1. Побегите гель агарозы для проверки качества.
    1. Подготовьте 1 x буфер Tris/Борат/ЭДТА (КЭ), добавляя 54 g Tris база, 27,5 г борной кислоты и 3.75 g ЭДТА динатриевая соль, в результате чего общий объем до 5 Л, с использованием реагентов класса воды.
    2. Подготовить гель агарозы 1%, добавив агарозы 1 г на 100 мл 1 x TBE. СВЧ решения до тех пор, пока не агарозы является видимым. Добавить 0,01% нуклеиновой кислоты геля краситель (см. Таблицу материалы). Пусть прохладно колбу, пока она теплая на ощупь. Смешайте хорошо помешивая. Вливают каппу для геля агарозы и дайте ему сидеть до тех пор, пока он твердеет.
    3. Смешайте 3 мкл пример, 2 мкл Реагента класс воды и 1 мкл 6 x загрузки красителя. Загрузите образцы в матрице геля, отметив их порядок.
    4. Запуск образцов для 60 – 70 мин на 60 – 70 V. изображение гель под УФ светом с правильной экспозиции и фокус.
      Примечание: Наличие четкой высокомолекулярного группы является признаком высокого качества ДНК, хотя мазки обычно указывают деградации ДНК. Большинство образцов гербария деградации.
  2. Запустить анализ количественной dsDNA (см. таблицу материалы), чтобы определить количество двойных мель ДНК.
    1. Используйте 2 мкл пример для анализа.
      Примечание: Разведения не требуются для количественной оценки анализа материалов гербариев, поскольку они, как правило, быть в минимальных количествах. Успешное библиотеки были сделаны из как 1.26 всего dsDNA нг от этого шага.

4. Стрижка ДНК

Примечание: Это оптимизированная версия коммерческого fragmentase двуцепочечной протокола (см. Таблицу материалы).

  1. Место dsDNA фрагментации фермент на льду после vortexing для 3 s.
  2. В стерильные 0,2 мл полимеразной цепной реакции (ПЦР) трубку микс 1 – 16 мкл изолированных ДНК с 2 мкл сопутствующих буфер реакции фрагментации. Довести объем до 18 мкл путем добавления нуклеиназы свободной воды. 2 мкл dsDNA фрагментации фермента и вихревой смесь для 3 s.
    Примечание: Количество ДНК необходимы варьируется в зависимости от концентрации ДНК (цель для 200 ng всего в трубе).
  3. Проинкубируйте образцы при 37 ° C 8.5 мин. Затем добавьте 5 мкл 0,5 М ЭДТА трубы.
    Примечание: Этот шаг необходимо выполнить только как инкубационный период над прекратить реакции и предотвращения чрезмерного сдвига образцы ДНК.

5. шарик очистки

  1. Однородный Спри бусы, vortexing.
  2. Довести объем стриженый ДНК до 50 мкл, добавив 25 мкл нуклеиназы свободной воды. Мкл 45 комнатной температуре Спри бусины (90% объема) для 50 мкл стриженый ДНК и перемешать тщательно, закупорить вверх и вниз.
    Примечание: Добавление бусы на 90% от объема общей выборки производится для удаления маленьких фрагментов ДНК, часто ниже 200 пар оснований.
  3. Пусть Проинкубируйте образцы для 5 минут поставил трубы на магнитные пластины и пусть сидят в течение 5 мин тщательно снимите и выбросьте супернатант.
    Примечание: Будьте осторожны чтобы не мешать бисер, как они содержат желаемых целей ДНК.
  4. Добавьте 200 мкл свежие 80% этанола в трубы на магнитную подставку. Инкубации при комнатной температуре за 30 s и затем осторожно снимите и выбросьте супернатант. Повторите этот шаг один раз. Воздух сухой Бусины для 5 мин при трубки магнитного стенд с открытой крышкой.
    Примечание: Избегайте чрезмерного высыхания бисер. Это может привести к нижней восстановления ДНК.
  5. Удаление трубы от магнита. Элюировать ДНК из бисера в 55 мкл 0.1 x TE и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз. Инкубации при комнатной температуре для 5 минут место трубы на магнитную подставку и ждать решения превратить ясно (~ 2 мин).
  6. Стащить 52 мкл супернатант. Запустите анализ количественной оценки ДНК на образцы для проверки восстановления и начальной концентрации, которая переходит в библиотеки преп.
    Примечание: Библиотеки были сделаны с общей dsDNA оценкам, менее 1,25 нг, хотя в каждом случае reamplification требовалось.

6. Библиотека подготовка

Примечание: Это модифицированная версия коммерчески доступные библиотеки комплекта (см. Таблицу материалов протокол).

  1. Конец Prep
    1. Добавьте 3 мкл эндонуклеазы и фосфат, хвостохранилища ферментов и 7 мкл сопутствующих реакции буфера до 50 мкл очищены, стриженый ДНК. Тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз. Спин трубы для удаления пузырьков.
      Примечание: Общий объем должен быть 60 мкл.
    2. Поместите образцы в Термоциклер с следующей программы: 30 мин при 20 ° C, 30 мин при температуре 65 ° C, затем провести на 4 ° C.
      Примечание: С подогревом крышка было присвоено ≥75 ° C
  2. Перешнуровка переходник
    1. Разбавить адаптер 25 – 50 раз (работает адаптер концентрации 0,6 – 0,3 мкм). Добавьте 30 мкл лигирование мастер смеси, 1 мкл лигирование усилитель и 2,5 мкл адаптер для короткого чтения последовательности высок объём трубки.
      Примечание: Общий объем должен быть 93.5 мкл.
    2. Тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз. Спин трубы для удаления пузырьков. Инкубируйте трубы при 20 ° C на 15 мин.
    3. 3 мкл коммерческой смеси урацила ДНК glycosylase (UDG) и VIII эндонуклеазы glycosylase лиазы ДНК (см. Таблицу материалы) для трубы. Убедитесь, что общий объем составляет 96,5 мкл. тщательно перемешать и инкубировать при 37 ° C 15 мин с использованием Термоциклер.
      Примечание: Крышки должно быть присвоено ≥47 ° C. Оригинальная версия коммерческого протокола имеет выбор размера после адаптер лигирование шага, следуют шарик очистки в качестве последнего шага. Этот протокол, который достигает более высокой урожайности, переключает порядок этих шагов и реализует выбор размера в качестве последнего шага.
  3. Очистка для удаления ферментов и небольшие фрагменты
    1. Однородный магнитные бусы, vortexing.
    2. 78 мкл Спри магнитные бусы (80% объема) и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз.
      Примечание: Добавление бусы на 80% объема общей выборки производится для удаления маленьких фрагментов ДНК, которые часто короче, чем 250 пар оснований. Более строгие удаление небольших фрагментов ДНК является (i) удалить излишки адаптеров и (ii) подчеркивают амплификации более крупных фрагментов в следующих шагах.
    3. Пусть образцы Инкубируйте 5 минут положить трубы на магнитные пластины для 5 минут осторожно снимите и выбросьте супернатанта, содержащий ДНК вне диапазона желаемого размера.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не мешать шарики, которые содержат желаемых целей ДНК.
    4. Добавьте 200 мкл свежие 80% этанола в трубы на магнитную подставку. Инкубации при комнатной температуре за 30 s и затем осторожно снимите и выбросьте супернатант. Повторите этот шаг один раз. Воздух сухой бусы на 5 мин, пока трубка на магнитного стенд с открытой крышкой.
      Примечание: Избегайте более сушки бисер. Это может привести к нижней восстановления ДНК.
    5. Удаление трубы от магнита. Элюировать ДНК целевой из бисера, добавив 17 мкл 0.1 x TE и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз.
    6. Инкубации при комнатной температуре для 5 минут место трубы на магнитную подставку и ждать решения превратить ясно (~ 2 мин).
    7. Стащить 15 мкл супернатант.
  4. Амплификации PCR
    1. Добавьте 25 мкл высокой верности ПЦР мастер смеси, 5 мкл короткий читать высокопроизводительного секвенирования библиотека приготовительный 5' грунтовка и 5 мкл высок объём короткие последовательности чтения библиотеки приготовительный 3' грунтовки, 15 мкл уборка лигируют адаптер ДНК.
      Примечание: Общий объем должен быть 50 мкл.
    2. Смешайте хорошо vortexing. Поместите образцы в Термоциклер с помощью параметров в таблице 1: Термоциклер Усилительная установка.
      Примечание: Из-за низкой количество входных ДНК требуется большое количество циклов.
Шаг циклаТемп.ВремяЦиклы
Первоначальный денатурации98 ° C30 s1
Денатурация98 ° C10 s12
Отжиг/расширение65 ° C75 s12
Окончательное расширение65 ° C5 мин1
Удерживайте4 ° C

Таблица 1: ПЦР протокола денатурации, отжиг и расширение раз и температур. Температура и время были оптимизированы для реагентов, представленные в настоящем Протоколе. Если изменяются реагентов, температура и время должны быть оптимизированы снова.

  1. Выбор размера для желаемого библиотека размера
    Примечание: Этот шаг шарик будет удалить фрагменты выше и ниже целевого показателя.
    1. Однородный Спри бусы, vortexing.
    2. Добавить 25 мкл (50% объема) комнатной температуре магнитные бусы и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз. Пусть Проинкубируйте образцы для 5 минут поставил трубы на магнитные пластины и пусть сидят в течение 5 мин тщательно удалить и передать новый набор помечены трубы супернатант.
      Примечание: Этот объем может корректироваться основаны на размер желаемого библиотеки. Супернатант содержит фрагменты ДНК желаемого размера. В первой инкубации из бисера бусин являются обязательными большие библиотеки фрагментов. Они удаляются, чтобы сосредоточиться на тех, кто в диапазоне 400 – 600 пар. Супернатант содержит небольшие фрагменты.
    3. Мкл 6 комнатной температуре Спри бусины в надосадке и смесь тщательно, закупорить вверх и вниз. Пусть Проинкубируйте образцы для 5 минут поставил трубы на магнитные пластины и пусть сидят в течение 5 мин.
      Примечание: Этот объем может корректироваться основаны на размер желаемого библиотеки в соответствии с шагом 6.5.2.
    4. Осторожно снимите и выбросьте супернатант.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не мешать шарики, которые содержат нужный ДНК. В инкубации второй бусины бисер являются обязательными фрагменты, оставшееся после первоначального удаления крупнейших ДНК фрагментов. Этот набор фрагментов обычно находится в диапазоне желаемого размера.
    5. Добавьте 200 мкл свежие 80% этанола в трубы на магнитную подставку. Инкубации при комнатной температуре за 30 сек, затем осторожно снимите и выбросьте супернатант. Повторите эти действия. Воздух сухой бусы на 5 мин, пока трубка на магнитного стенд с открытой крышкой.
      Примечание: Избегайте чрезмерного высыхания бисер. Это может привести к нижней восстановления ДНК.
    6. Удаление трубы от магнита. Элюировать ДНК целевой из бисера в 33 мкл 0.1 x TE и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз.
    7. Инкубации при комнатной температуре для 5 минут место трубы на магнитную подставку и ждать решения превратить ясно (~ 2 мин). Снять 30 мкл супернатант и передачи в 2 мл трубки (см. Таблицу материалы) для хранения.
      Примечание: Библиотеки могут храниться на уровне-20 ° c для длительного хранения.
  2. Контроль качества
    1. Контроль качества теста на ДНК библиотек. Обратитесь к шагам 3.1 и 3.2.
      Примечание: Для библиотек ДНК, Побегите гель для ~ 45 мин на 96 V.
  3. Библиотека reamplification: необязательный, если количество библиотека не является достаточным.
    Примечание: Образцы с библиотека концентрации ниже 10 Нм можно reamplified с помощью следующих шагов. Reamplification низкой концентрации библиотек можно добиться реальных результатов для секвенирования, но reamplification может привести к скромным сдвиг в разнообразии базового состава, хотя собрал данные (Таблица 3) указывают, что это является незначительным для некоторых показателей .
    1. Разбавьте Грунтовки универсальные reamplification, 10 раз с помощью 0.1 x TE.
    2. Добавьте 25 мкл высокой верности ПЦР мастер смеси, 5 мкл разбавленного универсальный reamplification праймера 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) и 5 мкл разбавленного универсальный reamplification грунтовка 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) в 15 мкл низкой концентрации библиотек. Примечание: Общий объем должна быть на 50 мкл.
    3. Смешайте хорошо vortexing. Поместите образцы в Термоциклер с помощью параметров в таблице 1: Настройка усиления Термоциклер
      Примечание: Из-за низкой количество входных ДНК требуется большое количество циклов.
    4. Очистке бисера
    5. Однородный Спри бусы, vortexing. 45 мкл комнатной температуре Спри бусины (90% объема) и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз.
    6. Пусть образцы Инкубируйте 5 минут поставил трубы на магнитные пластины на 5 мин.
    7. Осторожно снимите и выбросьте супернатанта, который содержит нежелательные ДНК.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не мешать шарики, которые содержат желаемых целей ДНК.
    8. Добавьте 200 мкл свежие 80% этанола в трубы на магнитную подставку. Инкубации при комнатной температуре за 30 сек, затем тщательно удалить и удалить супернатант. Повторите этот шаг один раз.
    9. Воздух сухой Бусины для 5 мин при трубки магнитного стенд с открытой крышкой.
      Примечание: Избегайте чрезмерного высыхания бисер. Это может привести к нижней восстановления целевого ДНК.
    10. Удаление трубы от магнита. Элюировать ДНК целевой из бисера в 33 мкл 0.1 x TE и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз.
    11. Инкубации при комнатной температуре для 5 минут место трубы на магнитную подставку и ждать решения превратить ясно (~ 2 мин).
    12. Снять 30 мкл супернатант. Библиотеки могут храниться при температуре-20 ° C для длительного хранения.
  4. Контроль качества
    1. Контроль качества теста на ДНК библиотек. Обратитесь к шагам 3.1 и 3.2. Для библиотек ДНК Побегите гель для ~ 45 мин на 96 V.
      Примечание: Если двойной полосы рассматривается в гель, это скорее всего является следствием истощения грунт от reamplification шаг. Полосы могут быть удалены путем повторения 6.9, но с использованием только одного цикла в программе PCR, изображены в таблице 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изоляции ДНК и окончательный библиотека доходность
В этом исследовании была продемонстрирована эффективность протокола для изоляции гербарий ДНК и восстановления высокого качества последовательности библиотек, пятидесяти различных образцов с помощью старых от 1920 и самым молодым из 2012 (Таблица 2). Для каждого образца примерно 10 мг ткани листа был использован для изоляции ДНК. Зеленой ткани листа было оказано, если таковые имеются, и был выбран не т...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленные здесь является всеобъемлющий и надежный метод для изоляции ДНК и последовательности подготовки библиотеки из образцов сухих растений. Согласованность метода и минимальная потребность изменить его на основе образца качества делают его масштабируемость для больших последовательности на основе гербарий проектов. Включение факультативного reamplification шаг для низкой урожайностью библиотек позволяет включение низкого качества, малое количество, редкие или исторически важные образцы, которые в проти...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Тейлор Обечон-старший, Teisher Иордании и Кристина Zudock для помощи в выборки образцов гербария и ботанический сад Миссури для доступа к гербарий образцов для разрушительных выборки. Эта работа была поддержка грант от национального научного фонда (DEB-1457748).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Термоамплификатор VeritiApplied Biosystems4452300 96скважин 
Система визуализации геляAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 seriesBeckman CoulterB30137
Цифровая сухая ваннаBenchmark ScientificBSH1001
Система электрофорезаEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ультрачистая вода)ELGA 89204-092
Пробирка для ДНК LoBind Eppendorf301080782 мл
Мини-центрифугаFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
СтупкаFisher ScientificS02591фарфоровый
пестикFisher ScientificS02595фарфоровые
центрифужные пробиркиFisherScientific 21-403-161
Микроволновая печьKenmore405.7309231
Пробирки для анализа кубитовInvitrogenQ32856
0,2 мл Полоска пробирка и колпачок для ПЦРVWR20170-004
Кубит 2.0 ФлуориметрInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Жидкий азот краткосрочного храненияNalgeneF9401
Магнитно-кольцевая подставка ThermoFisher Scientific AM1005096 well 
Водяная баняVWR89032-210
Мешалки с горячей плитойVWR97042-754
Жидкий азотВоздушный газUN1977
1 x TE БуферAmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-МЕРКАПТОЭТАНОЛAMRESCO0482-200ML
Рибонуклеаза АAMRESCOE866-5ML10 мг/мл раствор
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Хлорид натрияbioWORLD 705744
Изопропиловый спиртbio WORLD40970004-1
Нуклеаза Свободная водаbio WORLD42300012-2
Изоамиловый спиртFisher ScientificA393-500
Тригидрат ацетата натрияFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, динатриевая сольIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ультрачистый
гелевый краситель фиолетового цвета (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Набор для подготовки Illumina New England BioLabsE7645L
NEBНext Multiplex Oligos для IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Раствор фенолаSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ХлороформVWREM8.22265.2500
ЭтанолKoptecV1016200 Proof
Кварцевый песокVWR14808-60-7
Реамплификация праймеровИнтегрированные технологии ДНКсм. текст см. текст
Секвенчер v.5.0.1Генные коды

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species? Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18(2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  25. McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).
  30. McKain, M. R. Transposons. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Herbarium DNA IsolationHigh throughput Sequencing LibraryCTAB DNA ExtractionSPRI Bead PurificationDNA Fragmentation EnzymeLibrary Size SelectionOptional Reamplification StepAgarose Gel AnalysisThermocycler AmplificationMagnetic Stand Separation

Related Articles