Этот протокол описывает использование головы подготовка в vitro изолированные черепаха для измерения кинематика их движений глаз. После удаления мозга из черепной коробки могут стимулировать черепных нервов с токи для количественного определения поворотов глаз и изменения в размеры зрачка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Глазной кинематики, измеряется в Vitro стимуляции черепных нервов в черепаха
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
После того, как умерщвлены животных, их ткани начинают умирать. Черепахи предлагают преимущество из-за длительного времени выживания их тканей, особенно по сравнению с теплокровных позвоночных. Из-за этого в vitro эксперименты в черепах может выполняться продолжительное время расследовать нервные сигналы и контроля за их целевого действия. Использование изолированных головы подготовки, мы измерили кинематика движения глаз в черепах, и их модуляции электрических сигналов осуществляется черепных нервов. После мозг был удален из черепа, оставляемого черепных нервов, расчлененный головы был помещен в карданов подвес для калибровки движения глаз. Электроды стеклянные были прикреплены к черепных нервов (глазодвигательные, trochlear и отводящего) и стимулировали с токами вызывают движения глаз. Мы наблюдает движения глаз с инфракрасной видео, системы слежения и количественных вращений глаз. Импульсы тока с диапазоном амплитуды, частоты, и поезд длительности были использованы для наблюдения за влияние на ответы. Поскольку подготовка отделены от мозга, эфферентные пути собирается целевых мышц может быть рассмотрен в изоляции расследовать нейронных сигналов в отсутствие централизованной обработки сенсорной информации.
Введение
Обоснование использования Красноухая черепах в электрофизиологических экспериментов:
Красноухая черепахи (Красноухая scripta elegans), считаются одним из худших инвазивных видов в мире1 и может указывать, что экосистема находится в беде. Причина почему настолько успешным Красноухая черепахи плохо понял, но это может быть отчасти из-за их терпимая(ый) физиологии и владение нервной ткани, которые могут выжить в гипоксических условиях2,3,4 . Их использование для экспериментов не угрожают их числа и с минимальными усилиями....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Красноухая черепахи, как мужчины, так и женщин, были приобретены у поставщиков. Черепахи были размещены в теплой животных люкс, содержащий два 60-галлон ванны оснащены кирпич острова для загорать под 250-W инфракрасный свет. Окружающей среде сохранялся на 14/10-h свет/темно цикла с температурой воды в 22 ° C. Огни были включены в 6:00 утра и выключен в 8:00 вечера. Танки оснащены системы фильтрации были очищены каждую неделю, и черепах кормили ad libitum каждый день. Забота о Красноухая черепах и все из следующих экспериментальных процедур описанных здесь32,33 были утверждены институционал....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 показывает кадры изображения взяты из видео, описывающих рассечение. Изображения обеспечивают типичные места нервов до резки от мозга.
Рисунок 1: кадры изображения, снятые на видео вскрытие Показать места зрительного нерва (НИИ), глазодвигательного нерва (НИИИ), Блоковый нерв (nIV) и отводящего нерв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Важнейшие шаги:
Важнейшие шаги в рамках этого протокола являются следующие: 1) вскрытие и бережно сохранить жизнеспособность пересекал нервов; 2) соответствие размеров путем всасывания электродов черепных нервов для обеспечения последовательного реагирования; и 3) размещение в голову в карданного предоставлять адекватные калибровки вращений глаза.
Устранение неполадок:
Вскрытие может быть сложным, но после его завершения в несколько раз, шаги д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы благодарят г-жи Полетт Мак-Кенна и Лиза Pezzino в этом исследовании для секретариатской поддержки и г-н Фил Ауэрбах для технической поддержки. Авторы также поблагодарить Drs. Майкл Ариэль и Майкл S. Джонс (Сент-Луиса школа медицины при университете) за представление нам подготовить в vitro изолированные головы. Финансирование для поддержки этого сотрудничества было предоставлено кафедра биологии (Роберт S. Чейз фонд), академический научно-исследовательского комитета и программе нейробиологии в Лафайет колледже. Наконец эта работа посвящена г-н Фил Auerbach, который скончался 28 сентября 2016 гг.; он выведен сканирующий электронный микроскоп и признала ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Красноухие черепахи-ползуны | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (длина панциря 15-20 см) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co., LLC. | S5886 | |
| Хлорид калия | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Хорид магния | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Декстроза | Сигма-Олдрич Ко. ООО. | C5767 | |
| Концентрированная соляная кислота | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Хлорид кальция | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH-метр | Oakton | pH 6 + | |
| электрод для стимуляции всасывания | A-M Systems | 573000 | Биполярный аспиратор. Обратите внимание, что 573000 был заменен на 573050. |
| Капиллярное стекло | A-M Systems | 626000 | Однокамерное боросиликатное капиллярное стекло без микроволокна, длина 10 см, наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,50 мм |
| Альтернативный электрод для стимуляции всасывания | A-M Systems | 573050 | Биполярный аспиратор. Требуется капиллярное стекло большего диаметра: 627000, внешний диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,68 мм |
| Стереоскоп | Lieca | GZ7 | Диапазон увеличения, 10x – 70x |
| Волоконно-оптический источник света | Amscope | HL250-A | 150 Вт Волоконно-оптический микроскоп осветитель световой короб |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | нержавеющая сталь, прямая пружина, 5,25" |
| Тупой зонд для препарирования | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall зонд, двусторонний зонд и искатель, 6-дюймовые |
| микроножницы | Carolina Biological Supply Company | 623555 | ножницы для микропрепарирования Iris, нержавеющая сталь, лезвия 0,5 дюйма, тонкие щипцы длиной 4,75 дюйма |
| Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Щипцы Jewelers, дюмонт No5, сплав из нержавеющей стали, 4,25" | |
| Изогнутые щипцы | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Средний наконечник, изогнутые щипцы, нержавеющая сталь, 4-дюймовая |
| ручка скальпеля | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Рукоятки скальпеля, No 3, |
| лезвие скальпеля | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Лезвия скальпеля, No 11, стальная |
| гильотина | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine гильотина типа 7575 |
| Шпатель | Sigma | Z648299 | Micro ложка и шпатель для взвешивания. Используйте небольшой шпатель: 5,9 дюйма Длина x 0,07 дюйма Диаметр ручки с квадратным концом: 0,17 дюйма х 1,3" длинный, другой конец круглый: 0,17" х 1,27 дюйма |
| длинный крючок | Autozone | 98069 | Набор крючков и отмычек SureBilt. Используйте болгарку для затупления острых кончиков крючка, чтобы предотвратить травмирование рта животного. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% баланса углекислого газа сертифицированная кислородная стандартная газовая смесь, размер баллона 200, регулятор CGA-296 |
| Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Одноступенчатый латунный аналитический цилиндрический регулятор 0-100 фунтов на квадратный дюйм CGA-296 с игольчатым выходом. Используйте латунный регулируемый клапан воздушной трубы, чтобы перейти от внутреннего диаметра 3/8 дюйма, виниловой трубки, подключенной к регулятору, до внутреннего диаметра 3/16 дюйма, с соединением воздухопровода, идущим к воздушному камню или стеклянной пипетке Пастера. | |
| Регулируемый клапан воздушной трубы | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Латунный клапан |
| Жесткий стол | Неизвестный | Неизвестный | Автоклавная дверь уложена на прочный стол. Девять теннисных мячей диаметром 5 дюймов изолируют вибрации от верхней поверхности стола. |
| 5-дюймовый теннисный мяч | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: мячи не разрезаются и удерживаются во встроенной раме на нижней стороне дверцы автоклава. |
| Альтернативный виброизоляционный стол | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Жесткая система контроля вибрации, целостность 1: Размеры поверхности, 3' x 6'Gimbal |
| ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Столик от SUPER III-A Scanning EM | 5-осевой эуцентрический столик: линейные движения X, Y и Z, ± 20 мм, точность 0,1 мм; Вращения, вертикальные, ± 10°, и горизонтальный, ± 12,5°, с 1,25°; точность. Примечание: из документа о списании. | |
| Патрон для кардана | Неизвестный | Неизвестный | Патрон из старого микротома неизвестного производства был обработан по размеру вала держателя образца сканирующего ЭМ-столика |
| Альтернативный кардан | ThorLabs, Inc. | GN2/M с | двухосевым угломером MBT602/M (GN2/M), установленным на 3-осевом микроблочном столике с регуляторами винтов с накатанной головкой (MBT602/M): конструкция патрона для удержания головы черепахи с глазом на высоте 12,7 мм над верхней поверхностью гониометра (расстояние до точки вращения) |
| Видеосистема слежения за движением глаз | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Метод слежения: инфракрасное видео по темному зрачку; Черно-белая камера (артикул BC02): 30 Гц, 640 x 480; Системные требования: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Визуальный диапазон: Горизонтальный +/- 44°;; по вертикали +/- 20°°; Точность ~0,5°; Пространственное разрешение ~0.15°; Разрешение по размеру зрачка ~0,03 мм; Данные глаз: X, Y-положение взгляда, высота и ширина зрачка, кручение, дельта-время, общее время и области интереса (ROI); Связь в режиме реального времени (артикул 0022): 4-канальный аналоговый выход с восемью входными каналами TTL для маркировки кодов в файле данных |
| Многопозиционное магнитное основание | Harbor Freight Tools | Pittsburg, артикул #5645 | Магнитный держатель достигает 12 дюймов и создает магнитное притяжение 45 фунтов. Используйте для позиционирования камеры. Прорежьте отверстия на конце стержня для крепления камер. |
| Микроманипулятор | Kopf | 900 | 5-осевая манипуляция для крепления аспираторного электрода: X, Y, Z линейный ход, 2 оси вращения |
| Область диссекции на стреле | Lieca | GZ6 | Диапазон увеличения, 6,7x – 40x |
| Стимулятор нервов/мышц | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Двойной импульсный стимулятор напряжения: два выходных канала, которые могут работать независимо или синхронизироваться для генерации неизолированных импульсов постоянного напряжения (от 10 мВ до 150 В). Импульсы могут быть одиночными (10 и мкм; с до 10 с), повторяющиеся (от 0,01 Гц до 1 кГц) и поезда (от 1 мс до 10 с) и синхронизированные с входами и выходами TTL. Отправляйте выходы TTL по выходным каналам разъема DB25 во входные каналы TTL ViewPoint EyeTracker. Примечание: Astro-Med Grass Telefactor больше не работает. |
| Устройство для изоляции тока | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Блок изоляции токо-стимула: обеспечивает безопасную подачу постоянного тока с помощью S88 к препарату. PSIU6 подключается с помощью кабеля BNC к одному из выходных каналов S88. Переключатели умножителя на PSIU6 позволяют S88 генерировать широкий спектр амплитуд тока в диапазоне от 0,1 и микро; От А до 15 мА. |
| Альтернативный стимулятор нервов/мышц с изоляцией | A-M Systems | 2100 | Изолированный импульсный стимулятор: Блок имеет встроенный изолятор для производства постоянных токов. |
Ссылки
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-42....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
