Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Глазной кинематики, измеряется в Vitro стимуляции черепных нервов в черепаха

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56864

⸱

2 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media, Juniata College

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование головы подготовка в vitro изолированные черепаха для измерения кинематика их движений глаз. После удаления мозга из черепной коробки могут стимулировать черепных нервов с токи для количественного определения поворотов глаз и изменения в размеры зрачка.

Аннотация

После того, как умерщвлены животных, их ткани начинают умирать. Черепахи предлагают преимущество из-за длительного времени выживания их тканей, особенно по сравнению с теплокровных позвоночных. Из-за этого в vitro эксперименты в черепах может выполняться продолжительное время расследовать нервные сигналы и контроля за их целевого действия. Использование изолированных головы подготовки, мы измерили кинематика движения глаз в черепах, и их модуляции электрических сигналов осуществляется черепных нервов. После мозг был удален из черепа, оставляемого черепных нервов, расчлененный головы был помещен в карданов подвес для калибровки движения глаз. Электроды стеклянные были прикреплены к черепных нервов (глазодвигательные, trochlear и отводящего) и стимулировали с токами вызывают движения глаз. Мы наблюдает движения глаз с инфракрасной видео, системы слежения и количественных вращений глаз. Импульсы тока с диапазоном амплитуды, частоты, и поезд длительности были использованы для наблюдения за влияние на ответы. Поскольку подготовка отделены от мозга, эфферентные пути собирается целевых мышц может быть рассмотрен в изоляции расследовать нейронных сигналов в отсутствие централизованной обработки сенсорной информации.

Введение

Обоснование использования Красноухая черепах в электрофизиологических экспериментов:

Красноухая черепахи (Красноухая scripta elegans), считаются одним из худших инвазивных видов в мире1 и может указывать, что экосистема находится в беде. Причина почему настолько успешным Красноухая черепахи плохо понял, но это может быть отчасти из-за их терпимая(ый) физиологии и владение нервной ткани, которые могут выжить в гипоксических условиях2,3,4 . Их использование для экспериментов не угрожают их числа и с минимальными усилиями, электрофизиологических препаратов может оставаться жизнеспособным в течение длительного длительностей, покуда 18 часов5,6. Преимущество похож на преимущество использования беспозвоночных животных, таких как Раки7, которые также имеют способность выдержать низкий уровень кислорода8.

Методы для измерения движений глаз:

Подходы к оценке движения глаз в лобной глазами животных, с использованием не человеческого приматов были хорошо развиты9. Глаз поворачивается на орбите вокруг трех осей: горизонтальные, вертикальные и кручения. Магнитные Поиск катушка метод обычно считается самым надежным для измерения оборотов, но является инвазивным, требующих небольших бухтах вставляется в склер животных10,11. Видео на основе системы также можно измерить вращений и преимущество неинвазивные. Разработка лучше камеры наряду с инновационной обработки повысили их функциональность, делая видео основанных систем привлекательной альтернативой для рассмотрения12,,1314.

Методы, разработанные для измерения движения глаз в nonmammals были гораздо менее значительными. Меры являются либо низким разрешением или описать только некоторые из замен15,16,17,18. Отсутствие развития может быть частично обвинен на трудность в учебных nonmammals следовать визуальных целей. Хотя движения глаз хорошо изучены в Красноухая черепахи19,20,21,,2223,24,25 ,26,27,28,29,30, из-за вызов в обучение животных для отслеживания целей, точные кинематика их движений глаз это плохо понимать.

Красноухая черепах обычно считаются боковых eyed позвоночных, но потому, что они могут полностью отказаться от их головы в их оболочки31, значительные окклюзии бокового поля зрения, панцирь происходит32. В результате получается, что их визуального линии визирования принуждается к передней, делая их ведут себя подобно лобной eyed млекопитающих. Таким образом их использования в качестве модели для разработки подходов для измерения движений глаз также предлагает уникальный эволюционной точки зрения.

Протокол, описанный в этой работе использует в vitro изолированы с головы подготовка для идентификации кинематика движения глаз в Красноухая черепах. Мозги разделяются из черепов, оставляя нетронутыми черепных нервов. Руководители помещаются в карданов подвес для калибровки движений глаз и вызывают ответы по электрической стимуляции черепных нервов, иннервирующих мышцы глаза. Меры вращений глазами выполняются системой на основе видео, используя программные алгоритмы, которые отслеживать темный зрачок и маркировку радужки. Подготовки обеспечивает возможность измерения кинематики обоих экстраокулярных (т.е., горизонтальные, вертикальные и крутильных ротаций)32 и интраокулярные (т.е., ученик изменения)33 движений.

Система модель для анализа эфферентные нервные пути:

В целом подход обеспечивает возможность учиться как эфферентные нервные сигналы генерации движения глаз, когда мышцы начинают от их расслабленной государства и в отсутствие интегрированной сенсорной информации, обработаны мозга32, следователи 33. Таким образом кинематика глаз может быть рассмотрен в модель системы, в которой они обрабатываются исключительно в эфферентной нейронные пути оставляя мозга и synapsing на мышцы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Красноухая черепахи, как мужчины, так и женщин, были приобретены у поставщиков. Черепахи были размещены в теплой животных люкс, содержащий два 60-галлон ванны оснащены кирпич острова для загорать под 250-W инфракрасный свет. Окружающей среде сохранялся на 14/10-h свет/темно цикла с температурой воды в 22 ° C. Огни были включены в 6:00 утра и выключен в 8:00 вечера. Танки оснащены системы фильтрации были очищены каждую неделю, и черепах кормили ad libitum каждый день. Забота о Красноухая черепах и все из следующих экспериментальных процедур описанных здесь32,33 были утверждены институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) в Лафайет колледже.

1. Оборудование для установки

  1. Подготовьте раствор Рингера черепаха. Добавьте следующее к дистиллированной воды в таком порядке: натрия хлорид 96.5 mM (58.44 г/моль), хлорид калия 2.6 мм (74.56 г/моль), магния хлорид 2,0 мм (203.31 г/моль), натрия бикарбонат 31,5 мм (84.01 г/моль), декстроза 20,0 мм (180.16 г/моль), в основном Соляная кислота для регулировки рН 7,51 и хлорида кальция 4,0 мм (110.98 г/моль) (см. Таблицу материалы). Mix решение при добавлении каждого соли.
    Предупреждение: Концентрированная HCl является опасной (кожи, глаз, вдыхании и попадании опасности).
  2. Советы для всасывания электродов от 5-cm долго капиллярные стеклянные (см. Таблицу материалы), от пожара шлифовальные для различных размеров внутренних диаметров для того, чтобы вместить черепных нервов различной толщины.
    1. Используйте небольшой файл для etch линии через кусок капиллярного стекла. Место в папиросную бумагу и разорвать пополам.
    2. Медленно ролл один из концов капиллярные стеклянные в пламя горелки Бунзена. Периодически проверять подсказка для размера, гладкость и симметрии с помощью рассечение сферы и волоконно-оптический свет источника (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Для черепах с головы шириной между 20 и 30 мм, внутренний диаметр оптимальную установку размеров обычно колеблется от 0,4 до 0,8 мм для глазодвигательного нерва (НИИИ), 0,3-0,6 мм для Блоковый нерв (nIV) и 0,2 до 0,4 мм для отводящего нерва (НвИ).
  3. Чистота и организовать Rongeurs, тупым рассечение зонд, microscissors, тонкой щипцы, изогнутый пинцет и дескриптор скальпеля с лезвиями (см. Таблицу материалы) для рассечения.
    Примечание: Стерилизации инструментов является необязательным.

2. анестезия и эвтаназии

  1. Место черепаха в лед ведро за 60 мин до cryoanesthetize его.
  2. Усыпить черепаха, обезглавливание, с помощью малых животных гильотинные (см. Таблицу материалы).
    1. Аккуратно извлеките пасть животного открыть с небольшой массой шпателем, чтобы крючок можно вставлять и повернул под конец верхней челюсти.
    2. Тянуть с устойчивым давлением продлить голова животного через гильотины. Быстро обезглавить животного.
  3. Место голову черепахи в блюдо рассечение. Иметь достаточно черепаха звонаря решение под рукой, чтобы орошать ткани. Oxygenize раствор с 95/5 O2/CO-2 (см. Таблицу материалы).
  4. Поддерживайте ткани на 4 ° C, поместив льда вокруг вне блюдо.

3. рассечение

  1. Используйте область диссекции с источником света оптического волокна провести вскрытие.
  2. Удаление нижней челюсти. Место тупые рассечение зонд через рот, чтобы облегчить обработку головы. Вырежьте совместное подключение челюсти кости черепа с помощью скальпеля. Используйте rongeurs чтобы вытянуть нижнюю челюсть от черепа. Используйте rongeurs чтобы снять кожу и мышцы от их вложений в спинной и боковых областей черепной коробки.
  3. Удаление позвоночного столба.
    1. Идентифицировать позвоночника на хвостовой конец черепной коробки. Изгиб позвоночника вентрально подвергать спинного мозга. Используйте microscissors чтобы СНиП спинного мозга. Используйте rongeurs для удаления позвоночника и других тканей из черепной коробки, потянув каудально.
  4. Удаление мозга из черепной коробки после резки черепных нервов.
    1. Начиная затылочного, используйте rongeurs сократить двух разрезов на спинной черепной коробки. Сделать разрезы поверхностные, чтобы избежать повреждения мозга под.
    2. Используйте rongeurs для тщательно стянуть спинной черепной коробки. Используйте microscissors для удаления серозным подвергать остальная часть мозга. Удалить достаточно серозным, пока обонятельные луковицы, в передней черепной полости, может быть идентифицирован (см. рис. 1A). Продолжать поливать мозга с раствор Рингера черепаха, при необходимости.
    3. Используйте Изогнутый пинцет для осторожно потяните головного мозга каудально и производить небольшое напряжение на черепных нервов. Тщательно обрежьте и удалить обонятельные луковицы и головного мозга с Изогнутый пинцет.
    4. Используйте microscissors чтобы аккуратно вставьте мозга к срединной подвергать черепных нервов; НИИИ, около 0,6 мм, можно увидеть перед nIV, и диаметр Нив будет немного меньше, чем НИИИ. Вырезать НИИИ и Нив где они придают мозга (см. рис. 1B). Повторите это на другой стороне.
    5. Вырежьте левый и правый зрительный нерв (НИИ) с microscissors. Затем наклон ствола мозга в одну сторону. Соблюдать НвИ, возникающие от брюшной поверхности возле пересечения моста и продолговатого мозга (см. рис. 1 c); Диаметр НвИ небольшой и приблизительно 0.3 мм. сократить как левая и правая НвИ.
    6. Удалите оставшиеся части ствола мозга из черепаха с тонкой щипцы и microscissors. После того, как черепа пуст, осматриваем Пол полость черепа. Идентифицировать НИИИ, Нив и НвИ.
  5. Удалите верхние и нижние веки с тонкой щипцы и microscissors.

4. Калибровка движений глаз

  1. Использование жесткой таблицы (см. Таблицу материалы), для поддержки размещения карданного и других инструментов. Место голову черепахи в патрон карданов подвес, так что спинной поверхности головы параллельно горизонт, с помощью небольшой пузырь уровень отдыха через череп. Примерно позиции одного из глаз в центре вращений карданного горизонтальные и вертикальные.
  2. Место инфракрасные камеры, оснащен инфракрасной Светоиспускающий диод (LED), которая является частью системы отслеживания глаз видео на основе (см. Таблицу материалы), на расстоянии около 12 см от глаз черепаха просмотра.
    1. Угол камеры 45 градусов выше линии визирования глаза. LED должен быть в положении 11 часов при взгляде на объектив камеры. Центр LED вдоль оптической оси глаза. Камера будет немного от оси (как показано сверху глаз).
    2. Отрегулируйте расстояние от камеры от глаз, таким образом, чтобы максимально зрения камеры заполняется глазного яблока. Убедитесь, что уголках глаз (canthi) находятся на краях горизонтального представления.
  3. Подключите камеру к видео на основе глаз слежения системы обработки данных. Разделите сигнал на DVD-рекордер для захвата raw видео. Фокусируем камеру чтобы получить четкое изображение глаз. Позаботьтесь, чтобы штраф положение глаз в центре поля зрения камеры с помощью трех степеней линейного перестройки (x, y, z) обеспечены карданного.
  4. Обнаружить темный зрачок, установив порог и контраст, надлежащим образом используя программу, поставляемую с видео на основе глаз, системы слежения.
    1. С помощью мыши, щелкните на меню «Видео» и в разделе «Режим» выберите «Высокой точности» для захвата изображений в дискретизации 30 Гц (резолюция 640 пикселей x 480 линий). Также под «Видео», выберите «Темный ученик» для «Ученик типа» и «Эллипс (повернутый эллипс)» для «Метод сегментации ученик».
    2. В окне «EyeCamera» нажмите на значок «Ученик Поиск области перестройки» (небольшой вертикальный прямоугольник с точкой в центре). Используйте мышь, чтобы перетащить прямоугольник, ограничивающий область вокруг ученика. Избегайте темных областей, которые могут быть спутаны с учеником.
    3. В окне «Элементы управления» подтверждают, что для «Auto Image» и «позитивных-Lock порог-отслеживание» установлены флажки. Нажмите на «Auto-порог» для оптимизации плотности сканирования, который покажет как зеленые точки на темный зрачок.
  5. Калибровка видео отображения видео на основе айтрекинга программы для вращений карданного 12,5 ° (+/-) вокруг горизонтальной оси и 10 ° (+/-) вокруг своей вертикальной оси.
    1. В окне «Элементы управления» щелкните «Отображение». Установите флажки под «Взгляд» и «СТИМ» для «Взглядом точка», «Calib региона» и «Геометрическая сетка». После проверки поля в группе «Геометрическая сетка», окно будет всплывающее и сказать, «стимул отображения геометрии должен измеряться до геометрии сетки могут отображаться. Вы хотите сделать это сейчас?» Выберите «Y» для да.
    2. С помощью мыши, щелкните на меню «Окна» и выберите «Стимул». Пересечение вертикальной и горизонтальной линии в центре дисплея откроется окно «Стимул». Измерение длины линии к ближайшей мм. Нажмите клавишу «Esc» на клавиатуре, чтобы закрыть окно «Стимул».
    3. С помощью мыши, щелкните на меню «Стимул» и выберите пункт «геометрия». Введите длину линий, которые только что были измерены. Отрегулируйте расстояние просмотра, так что линии градуса равна 25 ° для горизонтальной линии и 20 ° для вертикальной линии. Нажмите на кнопку «Store» и закрыть окно.
    4. В окне «EyeSpace» выберите количество калибровочных «Точки данных» быть «9». С глаз turtle's расположен в центре нажмите на центр данных точки и нажмите кнопку «Вновь представить».
      Примечание: Откроется окно «Стимул», и «Get Ready» появится в центре экрана. Коробка появится на участке и затем исчезнет. О его исчезновении «Стимул» окно будет закрыто. Центральное положение теперь должен быть откалиброван.
    5. Повторите процедуру, вращая карданного вправо/влево, + 12,5 ° / -12.5 ° и вверх/вниз + 10 /-10 ° для калибровки оставшихся точек данных.
  6. Для калибровки при кручении вращение, используйте шаблон фитинг алгоритм с видео на основе глаз слежения программы. Алгоритм устанавливает нулевой позиции, основанной на маркировку радужки и вычисляет угол поворота, когда маркировка стали смещение от центроида ученика.
    1. С помощью указателя мыши, щелкните на меню «Окна» и выберите «Скручивание». Нажмите кнопку «Пуск» в окне «Скручивание». В окне «EyeCamera» дуга будет отображаться над изображением глаза.
    2. Отрегулируйте радиус, угол и длина дуги с помощью ползунков в месте, где присутствуют неправильные маркировки в радужной оболочке. Установите флажки для «Графики реального времени» и «Auto-набор после настройки». При необходимости отрегулируйте яркость и контрастность в элементы управления окна и ре порог темный зрачок (см. шаг 4). Нажмите кнопку «Задать шаблон».
  7. Разместите линейку в одной фокальной плоскости как ученик и записывать ширину полный камеры обзора. Значение будет использоваться позднее для определения фактической ширины зрачка.

5. позиционирование электрода всасывания на черепно-мозгового нерва вызывает движения глаз

  1. Осторожно поместите электрод сравнения ПИН в соединительной или мышечной ткани, оставшиеся на голове.
  2. Место всасывания электрода (см. Таблицу материалы) на черепных нервов с использованием микроманипулятор и рассечение области установлен на бум. Используйте источник света оптического волокна для просмотра и указания размещения.
    1. Совпадает с размером нерва на кончике капиллярные стеклянные. Методом проб и ошибок необходима для получения наилучшего вокруг диаметр нерва (см. шаг 1.2 размер рекомендаций). Поместите кончик стекла на всасывания электрода. Залейте раствор Рингера всасывания электрода и отрегулировать громкость внутри шприца примерно половину своих возможностей.
    2. Осторожно переместите кончик стекла электрод, используя микроманипулятор для позиции выше вырезать конец выбранного нерва. Убедитесь, что раствор Рингера заполняет черепной коробки и кончик ниже его поверхности. При необходимости, используйте глина моделирования для дам до места, где раствор Рингера протекает из черепной коробки.
    3. Тяните обратно на поршень шприца.
      Примечание: Вакуум привлечет нерва в конце кончика капилляров. Хорошо подходят обозначается нерва, оставаясь в рамках кончик с мало или вообще не дополнительных вакуум применяется.

6. стимуляция черепных нервов и анализа движения глаз

  1. Использование общего назначения нерва/мышцы стимулятор с текущего устройства изоляции (см. Таблицу материалы) для стимулирования черепных нервов через всасывающий электрода.
    1. Подключите всасывания электрода к текущему устройству изоляции с помощью кабеля. Подключите провод от электрод сравнения штырь заземления устройства изоляции.
    2. Выберите параметры течений, используя циферблатов и переключателей на устройстве изоляции и стимулятор. Используйте диапазон токов от 1 до 100 мкА, с частотой от 10 до 400 Гц. Использование 1 - или 2-ms импульсов в поездах прочного 100, 500 или 1000 мс.
  2. Запись времени стимуляцию.
    Примечание: Транзистор транзистор логика (ТТЛ) импульсы синхронизированы с поставки токи от стимулятор и общаться в режиме реального времени через кабель для входных каналов видео на основе глаза, системы слежения. Программный модуль обеспечены на основе видео глаз отслеживания программы управления коммуникационных.
    1. Для визуализации времени текущих приложений и их влияние на движения глаз, щелкните на меню «PenPlots». Выберите «X взгляд позиция», «Позиция Y взглядом», «Скручивание» и «Ученик ширина» Показать реального времени необработанных данных участков для X и Y глаз позиции, кручения и ширина зрачка. Также выберите «Маркеры & секунд» из меню «PenPlots», чтобы показать время участок с делениями, которые появляются промежутки 1 s.
      Примечание: Большой буквы «T» появится маркировки начала TTL импульсов, происходящих одновременно с текущим приложением.
    2. Для хранения данных движений глаз, вызванных токами, щелкните на меню «Файл» и выберите «Новый файл данных» в разделе «Данные». Введите имя файла и нажмите кнопку «Enter». Сохранение данных может быть приостановлена и затем заново, используя комбинацию клавиш «Ctrl» + «p». Когда экспериментальная сессия завершится, выберите «Закрыть файл данных» меню «Файл» в разделе «Данные».
    3. Помогает отслеживать типа токов применяется, щелкните на меню «Окна» и выберите «Панель данных». Появится окно «Клавиатура/DataMarker». Нажмите на букву или цифру для определения параметров текущего стимуляцию, доставляются на нерв.
      Примечание: например, «X» может стоять для 10 µA. нажав на «X» хранит его вступления в файл данных в режиме реального времени для пост Специального анализа. Он также появляется на «PenPlot» на «Секунд & маркеры» для постоянного наблюдения.
  3. Анализировать данные из системы отслеживания глаз.
    1. Откройте файл сохраненных данных, который находится в формате текста с разделителями, в программу распространения листа выбора для того чтобы организовать данные и провести статистический анализ.
      1. Преобразование значения ширины зрачка, хранящиеся в файле реальные размеры в мм.
      2. Преобразование значений X и Y глаз позиции и скручиваний единиц степени и использовать конвенций для описания движения глаз; Таким образом положительные направления вращений: intorsion, высота и отведения; и отрицательного направления вращений: похищения, вымогательство и депрессии.
    2. Скопируйте данные заголовка на новый лист. Это будет включать значения для размера экрана (ширина и высота) и дистанции просмотра. Восемь столбцов данных, собранных в размере 30 Гц будет следовать ниже информации заголовка.
    3. Вернуться на лист, содержащий необработанные данные. Сделайте «Найти» для «X» в последней колонке под названием «Маркер», чтобы найти где стимуляции была применена с 10 µA. найти число «T», положив начало текущего стимуляции. Копирование 15 строк (0.5 s) данных, происходящих перед «T» и 90 кадров после «T» (3.0 s); то есть, всего 3,5 s. Вставьте данные в новый лист ниже информации заголовка.
    4. Вставьте пустой столбец после «PupilWidth». В пустой столбец преобразуйте в калиброванных размеры в мм:
      Диаметр зрачка горизонтальных = × измерения ширины камеры вид «PupilWidth»
    5. Вставка 2 пустые столбцы после «X_Gaze» и «Y_Gaze». Нормализовать позиции в размеры экрана просмотра: координаты (0, 0) в верхней левой части расширения экрана в (1, 1) в правом нижнем углу. В первом пустом столбце, перевод позиции к наличию системы координат (0, 0) в центре экрана. Включите преобразование в размеры экрана в мм:
      X = (0.5 × ширина) – («X_Gaze» × ширина); Y = (0.5 × высота) – («Y_Gaze» × высота)
      Примечание: Последовательность операции является для левого глаза. Последовательности должны быть отменено для правого глаза для того, чтобы следовать Конвенции негатива для похищения и позитивность для отведения.
    6. В втором столбцах используйте тригонометрические функции для преобразования углов поворота (°):
      Горизонтальное вращение = arctan (X/viewing расстояние); вертикальное вращение = arctan (расстояниеY/viewing)
    7. Кручения уже отображается в единицах градусов, но чтобы соответствовать Конвенции позитивность для intorsion, если измерение производится на левый глаз, умножить на -1. Для правого глаза не умножение является необходимым. Программа коды вращение по часовой стрелке как позитивные.
    8. Участок диаметром зрачка и ротации как функцию от времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 показывает кадры изображения взяты из видео, описывающих рассечение. Изображения обеспечивают типичные места нервов до резки от мозга.

figure-results-1
Рисунок 1: кадры изображения, снятые на видео вскрытие Показать места зрительного нерва (НИИ), глазодвигательного нерва (НИИИ), Блоковый нерв (nIV) и отводящего нерв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важнейшие шаги:

Важнейшие шаги в рамках этого протокола являются следующие: 1) вскрытие и бережно сохранить жизнеспособность пересекал нервов; 2) соответствие размеров путем всасывания электродов черепных нервов для обеспечения последовательного реагирования; и 3) размещение в голову в карданного предоставлять адекватные калибровки вращений глаза.

Устранение неполадок:

Вскрытие может быть сложным, но после его завершения в несколько раз, шаги д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят г-жи Полетт Мак-Кенна и Лиза Pezzino в этом исследовании для секретариатской поддержки и г-н Фил Ауэрбах для технической поддержки. Авторы также поблагодарить Drs. Майкл Ариэль и Майкл S. Джонс (Сент-Луиса школа медицины при университете) за представление нам подготовить в vitro изолированные головы. Финансирование для поддержки этого сотрудничества было предоставлено кафедра биологии (Роберт S. Чейз фонд), академический научно-исследовательского комитета и программе нейробиологии в Лафайет колледже. Наконец эта работа посвящена г-н Фил Auerbach, который скончался 28 сентября 2016 гг.; он выведен сканирующий электронный микроскоп и признала полезность его стадии 5-оси для использования в настоящем Протоколе. Значительно будет недоставать его дружбе и находчивость.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Красноухие черепахи-ползуныKons ScientificTrachemys scripta elegansLarge size (длина панциря 15-20 см)
Sodium chlorideSigma-Aldrich Co., LLC.S5886
Хлорид калияSigma-Aldrich Co. LLC.P5405
Хорид магнияSigma-Aldrich Co. LLC.M7304
Бикарбонат натрияSigma-Aldrich Co. LLC.S5761
ДекстрозаСигма-Олдрич Ко. ООО.C5767
Концентрированная соляная кислотаSigma-Aldrich Co. LLC.H7020
Хлорид кальцияSigma-Aldrich Co. LLC.C7902
pH-метрOaktonpH 6 +
электрод для стимуляции всасыванияA-M Systems573000Биполярный аспиратор. Обратите внимание, что 573000 был заменен на 573050.
Капиллярное стеклоA-M Systems626000Однокамерное боросиликатное капиллярное стекло без микроволокна, длина 10 см, наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,50 мм
Альтернативный электрод для стимуляции всасыванияA-M Systems573050Биполярный аспиратор. Требуется капиллярное стекло большего диаметра: 627000, внешний диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,68 мм
СтереоскопLiecaGZ7Диапазон увеличения, 10x – 70x
Волоконно-оптический источник светаAmscopeHL250-A150 Вт Волоконно-оптический микроскоп осветитель световой короб
RongeursCarolina Biological Supply Company625654нержавеющая сталь, прямая пружина, 5,25"
Тупой зонд для препарированияCarolina Biological Supply Company627405Huber mall зонд, двусторонний зонд и искатель, 6-дюймовые
микроножницыCarolina Biological Supply Company623555ножницы для микропрепарирования Iris, нержавеющая сталь, лезвия 0,5 дюйма, тонкие щипцы длиной 4,75 дюйма
Sigma-Aldrich Co. LLC.F6521Щипцы Jewelers, дюмонт No5, сплав из нержавеющей стали, 4,25"
Изогнутые щипцыSigma-Aldrich Co. LLC.Z168696Средний наконечник, изогнутые щипцы, нержавеющая сталь, 4-дюймовая
ручка скальпеляSigma-Aldrich Co. LLC.S2896Рукоятки скальпеля, No 3,
лезвие скальпеляSigma-Aldrich Co. LLC.S2771Лезвия скальпеля, No 11, стальная
гильотинаHarvard Apparatus73-1918Kleine гильотина типа 7575
ШпательSigmaZ648299Micro ложка и шпатель для взвешивания. Используйте небольшой шпатель: 5,9 дюйма Длина x 0,07 дюйма Диаметр ручки с квадратным концом: 0,17 дюйма х 1,3" длинный, другой конец круглый: 0,17" х 1,27 дюйма
длинный крючокAutozone98069Набор крючков и отмычек SureBilt. Используйте болгарку для затупления острых кончиков крючка, чтобы предотвратить травмирование рта животного.
95/5% O2/CO2Airgas, Inc.X02OX95C20031025% баланса углекислого газа сертифицированная кислородная стандартная газовая смесь, размер баллона 200, регулятор CGA-296
Airgas, Inc.Y11244D296-AGОдноступенчатый латунный аналитический цилиндрический регулятор 0-100 фунтов на квадратный дюйм CGA-296 с игольчатым выходом. Используйте латунный регулируемый клапан воздушной трубы, чтобы перейти от внутреннего диаметра 3/8 дюйма, виниловой трубки, подключенной к регулятору, до внутреннего диаметра 3/16 дюйма, с соединением воздухопровода, идущим к воздушному камню или стеклянной пипетке Пастера.
Регулируемый клапан воздушной трубыDoctors Foster and SmithCD-12061Латунный клапан
Жесткий столНеизвестныйНеизвестныйАвтоклавная дверь уложена на прочный стол. Девять теннисных мячей диаметром 5 дюймов изолируют вибрации от верхней поверхности стола.
5-дюймовый теннисный мячPetco Animal Supplies, Inc.712868Petco Jumbo Pet Tennis Ball: мячи не разрезаются и удерживаются во встроенной раме на нижней стороне дверцы автоклава.
Альтернативный виброизоляционный столNewport CorporationINT1-36-6-NЖесткая система контроля вибрации, целостность 1: Размеры поверхности, 3' x 6'Gimbal
ISI, International Scientific Instruments, Inc.Столик от SUPER III-A Scanning EM5-осевой эуцентрический столик: линейные движения X, Y и Z, ± 20 мм, точность 0,1 мм; Вращения, вертикальные, ± 10°, и горизонтальный, ± 12,5°, с 1,25°; точность. Примечание: из документа о списании.
Патрон для карданаНеизвестныйНеизвестныйПатрон из старого микротома неизвестного производства был обработан по размеру вала держателя образца сканирующего ЭМ-столика
Альтернативный карданThorLabs, Inc.GN2/M сдвухосевым угломером MBT602/M (GN2/M), установленным на 3-осевом микроблочном столике с регуляторами винтов с накатанной головкой (MBT602/M): конструкция патрона для удержания головы черепахи с глазом на высоте 12,7 мм над верхней поверхностью гониометра (расстояние до точки вращения)
Видеосистема слежения за движением глазArrington Research, Inc.ViewPoint EyeTracker, PC-60Метод слежения: инфракрасное видео по темному зрачку; Черно-белая камера (артикул BC02): 30 Гц, 640 x 480; Системные требования: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Визуальный диапазон: Горизонтальный +/- 44°;; по вертикали +/- 20°°; Точность ~0,5°; Пространственное разрешение ~0.15°; Разрешение по размеру зрачка ~0,03 мм; Данные глаз: X, Y-положение взгляда, высота и ширина зрачка, кручение, дельта-время, общее время и области интереса (ROI); Связь в режиме реального времени (артикул 0022): 4-канальный аналоговый выход с восемью входными каналами TTL для маркировки кодов в файле данных
Многопозиционное магнитное основаниеHarbor Freight ToolsPittsburg, артикул #5645Магнитный держатель достигает 12 дюймов и создает магнитное притяжение 45 фунтов. Используйте для позиционирования камеры. Прорежьте отверстия на конце стержня для крепления камер.
МикроманипуляторKopf9005-осевая манипуляция для крепления аспираторного электрода: X, Y, Z линейный ход, 2 оси вращения
Область диссекции на стрелеLiecaGZ6Диапазон увеличения, 6,7x – 40x
Стимулятор нервов/мышцAstro-Med Grass TelefactorGrass S88Двойной импульсный стимулятор напряжения: два выходных канала, которые могут работать независимо или синхронизироваться для генерации неизолированных импульсов постоянного напряжения (от 10 мВ до 150 В). Импульсы могут быть одиночными (10 и мкм; с до 10 с), повторяющиеся (от 0,01 Гц до 1 кГц) и поезда (от 1 мс до 10 с) и синхронизированные с входами и выходами TTL. Отправляйте выходы TTL по выходным каналам разъема DB25 во входные каналы TTL ViewPoint EyeTracker. Примечание: Astro-Med Grass Telefactor больше не работает.
Устройство для изоляции токаAstro-Med Grass TelefactorPSIU6Блок изоляции токо-стимула: обеспечивает безопасную подачу постоянного тока с помощью S88 к препарату. PSIU6 подключается с помощью кабеля BNC к одному из выходных каналов S88. Переключатели умножителя на PSIU6 позволяют S88 генерировать широкий спектр амплитуд тока в диапазоне от 0,1 и микро; От А до 15 мА.
Альтернативный стимулятор нервов/мышц с изоляциейA-M Systems2100Изолированный импульсный стимулятор: Блок имеет встроенный изолятор для производства постоянных токов.
из нержавеющей стали

Ссылки

  1. Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
  2. Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
  3. Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
  4. Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
  5. Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
  6. Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
  7. Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
  8. McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
  9. Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
  10. Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
  11. Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
  12. Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
  13. Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
  14. Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
  15. Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
  16. Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
  17. Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
  18. Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
  19. Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
  20. Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
  21. Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
  22. Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
  23. Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
  24. Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
  25. Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
  26. Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
  27. Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
  28. Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
  29. Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
  30. Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
  31. Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
  32. Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
  33. Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
  34. Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
  35. Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
  36. Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
  37. Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
  38. Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
  39. Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
  40. Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
  41. Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
  42. AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
  43. Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
  44. Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
  45. Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitro
Глазной кинематики, измеряется в Vitro стимуляции черепных нервов в черепаха
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.