Поверхностная инженерия панкреатических островков с гепаринизированным StarPEG Нанопокрытия

Терапевтическая эффективность терапии на базе ячеек ограничивается низкой ячейки хранения и бедными выживания^1,2. Для того чтобы улучшить исход клеточной терапии, клеточная инженерия поверхности через ферментативные манипуляции, спряжение пептида, bioorthogonal химии и физической инкапсуляции с биоматериалов был эксплуатируются^{3,4, 5,6,,78,9,10}. Текущий протокол стремится достичь поверхности инженерных живых клеток с использованием метода «легкий к принять», применяя Нанопокрытия ультратонких гепарин включены starPEG (гепарин PEG) на поверхности клеток. Поверхностная инженерия панкреатических островков был представлен здесь в качестве примера из-за неоднородного характера островков Лангерганса и пренебрежительных результаты текущих клинических островок пересадке.

Действительно в настоящее время клинических островок пересадке производится прямой впрыск изолированных островков в печеночной воротной вены и эта процедура доступна только для селективного пациентов, из-за нехватки донорских материалов и низкой терапевтической эффективности ¹¹. условно, альгинат был наиболее часто используемых биоматериала для инкапсуляции островок и модификации поверхности, хотя это меньше идеал, из-за химической нестабильности альгината и воспалительных связанных с фиброзом^{12, 13}. Кроме того по сравнению с естественный размер островков, который колеблется от 100 до 200 мкм, микрокапсулы островка альгината крупнее, колеблется от 400 до 800 микрон, которые превышают физиологические диффундирующих расстояние кислорода. Конформное островок инкапсуляции, т.е., инкапсулируя островков без существенного изменения объема островок, затем был разработан. Таким образом осаждения nanomembranes состоит из PEG, тетрафторэтилена, силиконовой мембраны или многослойный Нанопокрытия (также известный как «слой за слоем» [LBL] техника) было сообщено, обусловило улучшение в vitro выживания островок^{14 ,,1516,17,18}, хотя LBL подход часто требует обширных островков передачи период для нанесения нескольких слоев, которые могут поставить под угрозу жизнеспособность островок . Кроме того нестабильность nanomembranes, которая опирается на электростатических или ковалентных взаимодействий между биомембранной слои или гидрофобных взаимодействий между nanomembranes и островок поверхности также вызывает обеспокоенность^{9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26}.

Другим сдерживающим фактором, что обременяет терапевтические результаты intraportal островок трансплантации является мгновенное крови опосредованной воспалительной реакции (IBMIR) вызванные прямого контакта имплантированных островков с кровью, что приводит к агрегации тромбоцитов, коагуляции и иммунных негативное или нежелательных Сотовый активации⁹. Для решения этих проблем, ультра-тонкий Нанопокрытия, состоящий из звездных полиэтиленгликоля (starPEG) был подготовлен для ее установленных биосовместимость и универсальность как островок, материал корпуса. Гепарин, высоко сульфатная Гликозаминогликан, также была включена в starPEG Нанопокрытия для его противовоспалительное, анти коагулянта свойства и способность содействовать васкуляризации, привлекая pro ангиогенных факторов роста^{22, 23}.

1. Изготовление гепарин включены Starpeg Нанопокрытия

1. Синтез succinimidyl сукцината гепарина (гепарин-NHS)
   1. Весят, 0,69 г гепарина и растворить в 2.0 мл ледяной деионизованной воды.
   2. Весят, 0.23 g ГСЗ и растворить в 0,5 мл ледяной обессоленной воды в колбу раунд снизу.
   3. Весят, 0,77 g EDC и растворить в 0,5 мл ледяной обессоленной воды в колбу раунд снизу.
   4. Mix ГСЗ и EDC решения в раунд нижней колбе. Комбинированное решение оставьте на скамейке при комнатной температуре в течение 30 мин при комнатной температуре.
   5. Центрифуга для EDC NHS смеси на 5,031 x g 10 мин для удаления избыточных EDC и NHS.
   6. Добавьте 30 мл холодного этанола раствор смеси и центрифуги на 5,031 x g за 10 мин.
      1. Повторите дважды.
2. Подготовка starPEG гепарин Нанопокрытия
   1. Добавьте 1,0 мл 10% (w/v)-starPEG (NH₂)₈ раунд нижней колбе.
   2. Добавьте 0,67 мл 10% (w/v) гепарин NHS же раунд нижней колбе.
   3. Место смешанного решения starPEG-(NH₂)₈ и гепарин NHS в инкубаторе при 25 ° C для 20 минут, чтобы получить четкое решение с вязкостью.
      Примечание: Для экспериментов, в которых требовалось дневно обозначенные гепарина (FAM-гепарин), изготовление процедура такая же, за исключением того, что звезды (NH₂) - PEG -₈ был распущен в деионизированной воде дополнена 5(6)- Карбоксифлуоресцеина N- succinimidyl эфира 0,1% (молярное соотношение) starPEG (NH₂)₈. )
3. Характеристика гепарин PEG Нанопокрытия методом Фурье преобразование инфракрасной спектроскопии (FT-IR)
   1. Перед началом, промойте Агат минометов, пестик и гранулирование устройства (небольшие диски с диаметром 13 мм) с ацетоном и обессоленной воды. Сухие стекла в печи перед использованием.
   2. Mix около 0,1-1% гепарин PEG образец с 200 – 250 мг порошка тонкой компании KBr.
   3. Гепарин КОЛЫШЕК и KBr смесь в ступке агат и мелко распылить в мелких гранул диаметром 2 мкм.
   4. Передача смеси в устройство линии грануляции. Прикладывайте силу (8 Т/см²) высокой степени сжатия в вакууме за 1 – 2 мин сформировать Прозрачные гранулы.
   5. Осторожно потяните образца гранулы от линии грануляции устройства. Будьте осторожны, чтобы не тянуть слишком трудно, чтобы не понести трещин.
   6. Передать образец гранулы очень тщательно преобразования ИК спектроскоп Фурье для определения образца химической структуры.
4. Изучение внутренней пористых структур Нанопокрытия гепарин PEG, отсканированные электронная микроскопия (SEM)
   1. Для выполнения следующих процедур Подготовьте стандартная ячейка 48-ну культуры пластины и пипетки.
   2. Пипетка Раствор сополимера гепарин КОЛЫШЕК в скважины 48-ну культуры пластины.
   3. Замораживанию пластину на-80 ° C в течение 24 ч.
   4. Lypophilize образцов-50 ° C в вакуумной среде (0,1 ПА) за 24 ч.
   5. Образцы распределены липкой поверхности алюминия заглушки.
   6. Покрытия образцы с золотом и наблюдать под электронным микроскопом отсканированные соблюдать внутренние пористой структуры.
5. Изучение поверхности Нанопокрытия гепарин PEG атомно-силовой микроскопии (АСМ)
   1. Очистить силикатного стекла слайды раствором Пиранья (70% H₂т₄, 30% H₂O₂) при 80 ° C 40 мин.
   2. Sonicate слайды в метаноле за 10 мин, а затем в толуоле за 10 мин.
   3. Сухие слайды по вакуумной сушки.
   4. Вымойте слайды с большим 3-аминопропил triethoxysilane решение (2% толуола), осторожно встряхнуть.
   5. Sonicate слайды в метаноле за 10 мин, затем в толуоле за 10 мин.
   6. Место 100 мкл 3% раствора гепарина ПЭГ по всей поверхности слайды с помощью стандартной пипетки.
   7. Изучение поверхности гепарин КОЛЫШЕК под атомно-силового микроскопа (резонансной частотой 50 – 80 кГц, силы постоянной 0,350 м N 21, радиус иглы 600 Нм).

2. мыши островок поверхности инжиниринг с гепарином PEG Нанопокрытия

1. Покрытие поверхности островок мыши с гепарином PEG Нанопокрытия
   1. Извлечь мыши островков коллагеназы пищеварение и histopaque градиент очистки, как ранее сообщалось в JoVE¹⁹.
   2. Handpick 200 островков под микроскопом рассечение в 1,5 мл трубку.
   3. 500 мкл PBS, островки и центрифуги на 503 x g за 1 мин.
   4. Возьмите супернатант и 250 мкл раствора гепарина КОЛЫШЕК и держать смесь на льду на 10 мин пипеткой вверх и вниз, чтобы разрешить островков смешивать с гепарином PEG решение.
   5. Центрифуга на 503 x g за 1 мин.
   6. Удалить супернатант и 500 мкл PBS. Пипетка вверх и вниз, чтобы перемешать.
   7. Центрифуга на 503 x g за 1 мин и удалить супернатант и держать островков для дальнейшего использования. Для изучения мыши островки, покрытые гепарин PEG FAM-гепарин PEG был использован для покрытия островок выполните следующие действия.
2. Экспертиза мыши островки, покрытые FAM-гепарин PEG Нанопокрытия
   1. Добавить 1-2 мл RPMI 1640 дополнена плода бычьим сывороточным 10% покрытием островков и передачи этих островков в блюдо-заряженные стерильные бактериальной культуры.
   2. Наблюдать за морфологией и флуоресценции сигналы FAM-гепарин КОЛЫШЕК с покрытием Нанопокрытия островков под Перевернутый флуоресцентным микроскопом.

3. функция гепарин КОЛЫШЕК с покрытием мыши островков, по сравнению с островки, покрытые оболочкой

1. Жизнеспособность гепарин КОЛЫШЕК с покрытием мыши островков
   1. Handpick 20 островков мыши гепарин КОЛЫШЕК с покрытием и поместите их в один хорошо плиты культуры 96-луночных клеток.
   2. Заполните в общей сложности 10 скважин с 20 островков мыши гепарин КОЛЫШЕК с покрытием для каждой скважины.
   3. Handpick 20 островков noncoated управления и поместите их в один хорошо же пластины культуры 96-луночных клеток.
   4. Заполните в общей сложности 10 скважин с 20 островков noncoated управления для каждой скважины.
   5. Положите 200 мкл RPMI 1640 дополнена плода бычьим сывороточным 10% в каждой скважине 96-луночных пластины, содержащий островков и поддерживать в культуре на 14 дней.
   6. Замените островок культуры СМИ каждые 2 дня.
   7. Лечить островки с жить/мертвые пятнать комплект в конце 14 дней в культуре и отметил под Перевернутый флуоресцентным микроскопом.
   8. Подсчитать ячейки PI⁺ (красный) в пределах каждого островка под Перевернутый флуоресцентным микроскопом.
2. Реваскуляризации гепарин КОЛЫШЕК с покрытием мыши островков в пробирке
   1. Предварительно охладить всех экспериментальных пластмасс, включая культуру пластины и пипетки советы по крайней мере 12 h перед использованием.
   2. Место 24-Ну на охлаждающую подставку. 250 мкл лед холодной фактор роста снижение Matrigel в каждой скважине плиты культуры клеток 24-хорошо. Место пластину с покрытием 24-Ну на 4 ° C для по крайней мере 30 минут.
   3. В то время как Матрица решения является установление в холодильнике, trypsinize поджелудочной островок мыши эндотелиальных клеток Свен 1 миля (MS1).
      1. Удалите все культуры средств массовой информации из колбы культуры ткани. Промойте флакон с 5 мл ФСБ.
      2. Удаление PBS и добавить 3 мл трипсина-ЭДТА. Инкубируйте при 37 ° C 3 мин в стандартной инкубатора.
      3. Слегка постучите нижней части Фляга для отсоединения клетки и добавить 5 мл сыворотки дополнить средства массовой информации.
   4. Соберите клетки в 15 мл центрифуги и центрифуги на 1000 x g за 5 мин.
   5. Возьмите супернатант и добавьте 5 мл ФСБ. Пипетка вверх и вниз, чтобы перемешать.
   6. Центрифуга на 1000 x g 5 минут и снять супернатант.
   7. Добавить сыворотки дополнить DMEM СМИ в трубку и семян 50 000 ячеек в каждой скважине пластины 24-ну матрица решение покрытием.
   8. Добавьте 5 гепарин PEG покрытием островков или noncoated управления островков в каждой скважине.
   9. Добавьте сыворотки дополнить DMEM СМИ в каждой скважине в общей сложности 500 мкл в колодец.
   10. Наблюдать за формирование трубки после 4 ч. и 24 ч инкубации под микроскопом света.
3. Инсулина глюкоза стимулирует секрецию гепарин PEG покрытием островков
   Примечание: Для оценки ли Нанопокрытия будет влиять на функцию мыши островков, оценивали секреции инсулина глюкоза стимулирует гепарин КОЛЫШЕК с покрытием и noncoated островков.
   1. Handpick 30 гепарин PEG покрытием островков или noncoated управления островков в одну трубу 1,5 мл. Подготовьте в общей сложности 10 труб с покрытием островков и noncoated островков.
   2. Добавить 1 мл физиологического раствора соли, дополнена 2 ммоль/Л глюкозы²⁰ и инкубировать при 37 ° C на 2 ч.
      Примечание: Для рецепт физиологический раствор соли, пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Держите крышку трубки свободно во время инкубации в инкубаторе.
   3. Удалите столько решение как можно скорее.
   4. Стимулировать островков, добавив 600 мкл физиологического раствора соли дополнены 20 ммоль/Л глюкозы при 37 ° C за 30 мин.
   5. Соберите 200 мкл супернатант от каждой трубы для инсулина, ELISA количественной оценки с использованием коммерческих инсулина ELISA комплект.

Гепарин PEG Нанопокрытия был синтезирован спряжение-starPEG (NH2)8 и гепарин, используя EDC и NHS как соединения агентов (рис. 1). Химическая структура гепарин PEG Нанопокрытия был осмотрен FT-IR и как показано на рисунке 2, характерные вершины гепарина можно наблюдать на 3300 – 3600 см-1, соответствующий гидроксильных групп гепарина (рис. 2 красный). Снижение амплитуды пик на 3300 – 3600 см-1 (рис. 2 синий) представляет сопряжения между starPEG - (NH2)8 амидными группами и группой карбонильных гепарина. Амплитуда пик 1650 см-1 соответствует Амида карбонильных растяжения вибрации также был сокращен, указывающее достаточно реакции между группами карбоксилат гепарина с succinimidyl сукцината и Амин starPEG-(NH2) 8. Структура поверхности гепарин PEG Нанопокрытия был осмотрен атомно-силовой микроскопии и показано от Лу et al., Нанопокрытия было около 30 Нм в высоту и 2 мкм в ширину с малых пористых функций (темные пятна) начиная от 100 до 200 Нм в диаметре10. Данные, полученные из отсканированных электронной микроскопии также подтверждают весьма взаимосвязанных пористая структура гепарин ПЭГ (рис. 3), предполагая, что это может быть подходящим для выживания клетки во время доставки в естественных условиях.

Покрытие поверхности мыши изолированных островков было рассмотрено и как показано на рисунке 4, тонкий слой Нанопокрытия, показан в зеленой флуоресценцией сдан равномерно по всей поверхности с покрытием островков не вызывая очевидны изменения на островке объем/размер. Во время покрытия, рекомендуется держать островков на льду сохранять их жизнеспособность. Аналогичным образом покрытие период, 10 мин в этом случае, был также оптимизирован для разрешить поддержание жизнеспособности островков. Стоит отметить, что для лучшего наблюдения Нанопокрытия, электронной микроскопии, который исследует сечений с покрытием островки как сообщалось ранее9,16 будет более подходящим, хотя данные будут создаваться от стационарных и встраиваемых островков вместо жизни островков в культуре.

Что касается выживания и функции покрытием островков, островок реваскуляризации и функций в были начисленных в пробирке. Учитывая полезные свойства гепарина гепарин функционализации на островке поверхность может облегчить реваскуляризации островок в культуре и, следовательно, ее выживание. Мы заметили, что гепарин PEG покрытием мыши островков выставлены надежные островок жизнеспособность в культуре (рис. 5). Значительно более продвинутые сосудистые образования был также видно из островок эндотелиальных клеток (MS1), которые были совместно культивируемых с гепарином PEG покрытием островков, обозначается удлиненной microvessel как структуры и сети как сосудистые (Рисунок 6 ).

Процесс Нанопокрытия понесены не эффект инсулина глюкоза стимулирует секреторную способность гепарина PEG покрытием островков. Низкий уровень секреции инсулина было отмечено во всех группах лечения, когда были увлажненную островков с физиологическим солевым раствором, дополнена sub-stimulatory уровень глюкозы (2 ммоль/Л; Рисунок 7). Когда островков были стимулировали с выше физиологическом уровне глюкозы (глюкозы 20 ммоль/Л), во всех группах лечения наблюдалось увеличение секреции инсулина.

Рисунок 1: Химическая структура Hep-PEG Нанопокрытия для поджелудочной островок поверхностная инженерия. Островок покрытие было достигнуто за счет ковалентной сшивки между гепарин NHS и первичных аминов в клеточной мембраны и звезды - PEG - (NH2)8. Каждая молекула гепарин обладает несколько карбоксильных групп, которые были изменены, чтобы иметь группу NHS каждый. ГСЗ активированный карбоксильных групп будет реагировать с первичных аминов белка в форме амидных связей, через которые стабилизируется Нанопокрытия Hep-КОЛЫШЕК и островков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Инфракрасный спектр звезды - PEG - (NH2)8, гепарин и Hep-PEG нанопокрытия в сушеные государства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Отсканированные изображения электронной микроскопии Hep-привязки в сушеные государстве. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Представитель изображения гепарин PEG покрытием островков под флуоресцентным микроскопом.
Гепарин был предварительно помечены с FAM (показано зеленым). Изображения являются представитель 100 островков. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Островков гепарин-PEG покрытием выставлены надежные островок жизнеспособность. (A) данные, представленные как стандартная ошибка mean± средств, n = 50 островков для каждой группы. (B) живые клетки были показаны в зеленый и мертвых клеток в красный. Шкалы бар = 100 µm. образы являются представитель 50 островков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: Гепарина-PEG Нанопокрытия облегчает интра островок реваскуляризации. Matrigel трубки формирование MS1 клетки культивировали совместно с покрытием гепарин PEG островков и noncoated управления островков. Изображения были взяты на 4 и 24 h. шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: Гепарин-PEG Нанопокрытия влечет за собой никаких изменений на островок функции секреции инсулина. Гепарин-PEG покрытием островков и noncoated управления островков (по 30) были подвержены 2 ммоль/Л (белая полоса) или 20 ммоль/Л (черная полоса) глюкозы для 30 min. секреции инсулина в ответ на 20 ммоль/Л глюкозы сопоставима между покрытием и контролировать островков. Данные отображаются в виде среднее ± стандартная ошибка средств, n = 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.