Методическая статья

Количественная оценка эндогенного ауксинов и цитокининов во время Internode культуры Ipecac

DOI:

10.3791/56902

⸱

15 марта 2018 г.

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Случайного побегов может быть наведено на интермодального сегменты ipecac без лечения фитогормона. Для оценки динамики фитогормона во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного ауксинов и цитокининов интермодального сегментов, LC-MS/MS.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Формирование случайного стрелять является важным методом распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов. Ли случайного побеги могут быть наведено определяется баланс между ауксинов и цитокининов (CK) уровнях. Много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов в каждой ткани, используется в качестве эксплантов и каждого вида растений. В ipecac однако, случайного побегов может быть наведено на интермодального сегментов в культурной среде без лечения фитогормона. Это позволяет присущие пластичности ipecac для дифференцировки клеток оцениваться. Чтобы побудить случайного стреляет в ipecac, мы культивировали интермодального сегментов при 24 ° C под 15 мкмоль m−2 s−1 света в цикле Темный свет/10-h 14-h на свободных фитогормона B5 средних затвердевших с 0,2% gellan резинки на 5 недель. Расследовать фитогормона динамика во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного индол-3-уксусной кислоты и CKs в сегментах по жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии LC-MS/MS. Этот метод позволяет анализа эндогенных индол-3-уксусной кислоты и уровни CKs в простой форме. Он может применяться для изучения динамики эндогенного ауксинов и CK период органогенеза в других видов растений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Готлиб Иоганн Фридрих Хаберландт (1854-1945) предложил концепцию «тотипотентность», по которой завод клетки можно разделить, дифференцировать и регенерации целых заводов даже после их предварительного дифференциации в типы конкретных клеток в зрелых растений1. В культуре ткани ли регенерации растений может быть наведено или не определяется сочетание и концентрации экзогенно прикладной фитогормонов в среднего роста. Скуг и Миллер обнаружил, что случайного побеги могут быть вызваны из табака каллуса на питательной среды, содержащие высокий коэффициент CKs в ауксины, тогда как придаточных корней может быть наведено на носителе, содержащих низкий коэффициент2. После этого вывода, тканевой культуры широко используется для распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений3. Случайного побегов может быть вызван из тканей помимо стрелять апикальной Меристемы, например, листья, корни и междоузлий. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов растений. Однако оптимальной концентрации и комбинации отличаются по видам и среди тканей, используемых в качестве эксплантов. Таким образом много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов для экспериментов.

Ипекакуана (Brot.) L. Андерссон (ipecac) это лекарственное растение, содержит алкалоиды, как эметин и cephaeline, главным образом в корни4. Экстракты корня используются как отхаркивающее, рвотное и amoebicide5. Хотя ipecac Естественно произрастает в тропических лесах Бразилии, он неохотно установить семена в культуре, и всхожесть снижается во время хранения семян в Японии, с ее холоднее климат6. Вместо этого он распространяется на культуре ткани, в которой случайного стрелять формирование на междоузлий является наиболее эффективным методом7,8. Интересно, что в этот вид без фитогормона лечения8может быть наведено случайного побегов.

Случайного побеги образуются на эпидермис в регионе апикальной интермодального сегментов без callusing, но не в базальной области9. Эта разница указывает ткани полярности в интермодального сегментов, который, вероятно, под фитогормональный регулирования. Ipecac культуры система позволяет уникальная возможность анализировать изменения уровня эндогенного фитогормона во время формирования случайного стрелять. Здесь мы представляем наш метод для анализа эндогенными уровнями одного ауксинов (индол-3-уксусной кислоты (IAA)) и четыре CKs (изопентенил аденин (iP), изопентенил riboside аденин (ПИС), транс-Зеатин (tZ) и транс-Зеатин riboside (ТЗР)) в интермодального сегментов с помощью LC-MS/MS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Ipecac (C. Ипекакуана) был использован в этом исследовании, потому что он облегчает анализ эндогенного фитогормонов.

1. рост условия чтобы побудить случайного побеги Ipecac

  1. Подготовка бесплатно фитогормона B5 среднего скорректирована с рН 5,710и добавить 0,2% gellan резинка. Стерилизация автоклавированием.
  2. Залейте 25 мл среды, газобетона в стерильных Петри (90 мм × 20 мм).
  3. Вырезать 8-мм интермодального сегментов ipecac Саженцы с помощью хирургического скальпеля с лезвием № 22 на стерильную Акриловые плиты и место на носителе (рис. 1).
  4. Культура на свободных фитогормона B5 носителе при 24 ° C под 15 мкмоль m−2 s−1 света в цикле Темный свет/10-h 14-h 5 недель.
  5. Определить регионы я (верхушечно) – IV (базальный) в каждом сегменте (рис. 1Б). Подсчитать количество случайного побеги > 0,3 мм длиной в каждом регионе под микроскопом один раз в неделю.

2. Извлечение и очистка фитогормоны

  1. Поставьте 5-мм циркония шарик в каждом из четырех 2-мл пробоотборные трубки.
  2. Вырезать сегменты в регионах I-IV (каждый 2 мм в длину) с помощью хирургического скальпеля на стерильную акриловые пластины.
  3. Сбор восемь сегментов каждого региона в отдельный образец трубки (10-30 мг свежего веса).
  4. Взвесить, а затем заморозить образцы в жидком азоте.
  5. Раздавить замороженных образцов с помощью гомогенизатор, основанные на шарик.
  6. Приостановить щебень образцы в ацетонитриле 1 мл, содержащих 500 pg каждого внутреннего стандарта ауксинов и CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- ТЗР, d6- iP, d6- ПИС) с помощью вихревой смеситель.
  7. Держите на 4 ° C для 1 h, а затем центрифуги на 3500 × g 5 мин при комнатной температуре.
  8. Помыть лепешка в ацетонитриле 80% (v/v), содержащей 1% (v/v) уксусная кислота. Центрифуга снова на 3500 × g 5 мин при комнатной температуре. Объединить supernatants (от шагов, 2.7 и 2.8) в одноразовых стеклянной трубки.
  9. Добавить 600 мкл воды содержащие уксусной кислоты 1% (v/v) для каждого комбинированных супернатанта и испаряются ацетонитриле, с помощью вакуума концентратор.
  10. Сбалансировать гидрофильно липофильного сбалансированный картриджи столбца (HLB), применяя 1 мл ацетонитриле, метанола и воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
  11. Применить один пример решения в уравновешенной HLB картриджа.
  12. Вымойте картриджи с 1 мл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
  13. Элюировать все гормоны с Ацетонитрил 80% (v/v) 2 мл, содержащих 1% (v/v) уксусной кислоты в стеклянной трубки.
  14. Испарится Ацетонитрил в элюата для получения экстракта в воде, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты с помощью вакуумного концентратор.
    Примечание: Не это полностью высохнуть.
  15. Сбалансировать смешанного режима, сильный катионообмен (MCX) столбец картриджи, применяя Ацетонитрил 1 мл, 1 мл метанола, 0,5 мл 0,1 М HCl и 1 мл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
  16. Применить один пример решения в уравновешенной MCX картриджа.
  17. Вымойте картриджи с 1 мл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
  18. Элюировать IAA с 2 мл 30% (v/v) ацетонитриле, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты в стеклянной трубки.
  19. Вымойте картриджи с Ацетонитрил 80% (v/v) 2 мл, содержащих уксусной кислоты 1% (v/v).
  20. Вымойте картриджи с 2 мл и 1 мл воды, содержащей 5% водного раствора аммиака.
  21. Элюировать CKs с Ацетонитрил 60% (v/v) 2 мл, содержащих 5% водного раствора аммиака в стеклянной трубки.
  22. Испарения растворителя каждой фракции гормон, с помощью вакуума концентратор и хранить при −30 ° C до анализа LC-MS/MS.

3. LC-MS/MS анализ МАА и CKs

  1. Распустить каждый гормон экстракт в трубку с 600 мкл метанола и передавать решение для полного восстановления флакон винт шеи. Испарения растворителя, с помощью вакуума концентратор.
  2. Растворите IAA фракция в 20 мкл ацетонитриле 30% (v/v) и CK фракций в 20 мкл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты в винт шеи полного восстановления флаконов.
  3. Анализ образцов в режиме положительных ионов на тройной квадрупольного MS системы с системой ВЭЖХ.
    Примечание: Мы устанавливаем ВЭЖХ условия, перечисленные в таблице 1.
    1. Для элюции IAA использовать двоичный градиент 5% - 50% растворителей B свыше 7 мин, затем увеличить на 98% растворителем B за 1 мин и удерживайте затем сбалансировать 2 мин на 5% растворителем B гнездо инъекции.
    2. Для элюции CK, использовать двоичный градиента 2% - 40% растворителей B более 5 мин, 40% - 70% растворителем B в 7 мин, а затем увеличить на 95% растворителем B за 1 мин и удерживайте затем сбалансировать 2 мин на 2% растворителем B, гнездятся инъекций.
    3. Установите электроспрей ионизации (ESI)-MS параметры источника ионов, перечисленные в таблице 2.
  4. Используйте несколько реакции, мониторинг (MRM) переход для количественной оценки каждого аналита, перечисленных в таблице 3.
  5. Количественно эндогенного МАА и CK уровнях против стандартной кривой соотношения немеченого дейтерия меченых стандартам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В 1 неделеst сформировали не случайного побегов. На 2-й неделе появились небольшие побегов. 3rd и 4-й недели, количество побегов увеличение главным образом в апикальной регионах (I и II)(Рисунок 2). На 5-й недели число побегов приблизительно 7 в регионе я был и 5 в регионе II (рис. 2B). В противоположность этому в регионов III и IV были сформ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы определить распределение фитогормонов участвующих в органогенез, важно использовать растительные материалы, в которых органогенеза можно наблюдать на фитогормона свободной среде, потому что когда фитогормонов экзогенно применяются к эксплантов для стимулирования побеги и корни, они влияют на весь экспланта, что делает его трудно оценить присущие пластику растений в дифференцировки клеток и органогенеза. Случайного побегов может быть наведено на фитогормона свободной культуры средств массовой информации в других вид...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны г-н Акира Мураками кафедры прикладной Biosciences, Университета Тойо и г-н Koudai Танигути Гумма центра сельскохозяйственной технологии для их технической помощи. Мы признательны также профессором Shosaku Kashiwada и доктор Uma Елена Раджагопалан, Университетом Тойо за их предложения. Это исследование было поддержано в части научно-исследовательский центр для жизни и экологических наук, Университет Тойо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
[2H5]индол-3-уксусная кислотаOlchemlm Ltd031 1531Внутренний стандарт для LC-MS/MS
[2H5]транс-зеатинOlchemlm Ltd030 0301Внутренний стандарт для LC-MS/MS
[2H5]транс-зеатин рибозидOlchemlm Ltd030 0311Внутренний стандарт для LC-MS/MS
[2H6]N6-изопентениладенинOlchemlm Ltd030 0161Внутренний стандарт для LC-MS/MS
[2H6]N6-изопентениладенозинOlchemlm Ltd030 0171Внутренний стандарт для ЖХ-МС/МС
индол-3-уксусная кислотаWako098 00181стандарт для ЖХ-МС/МС
транс-зеатинSIGMA-ALDRICHZ0876 5MGстандарт для ЖХ-МС/МС
транс-зеатин рибозидWako262 01081стандарт для ЖХ-МС/МС
N6-изопентенил аденинSIGMA-ALDRICHD7674 1Gстандарт для ЖХ-МС/МС
N6-изопентениладенозинACROS ORGANICS22648 1000стандарт для ЖХ-МС/МС
ацетонитрил гиперград для ЖХ-МС LiChrosolvMERCK1.00029.1000растворитель для ЖХ-МС/МС
Вода для хроматографии LiChrosolvMERCK1.15333.1000растворитель для ЖХ-МС/МС
ВЭЖХSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 мг/1 куб. смВодаWAT094225картриджная колонка
Oasis MCX 30 мг/1 куб.см Вода186000252картриджная колонка
винтовая горловина для полного восстановленияВода186002805
синяя, 12 x 32 мм крышка с винтовой горловиной и перегородка из ПТФЭ/силиконаВоды
Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 ммВода186002350колонка UPLC
Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 ммAgilent699775-902Колонка UPLC
Цифровой микроскопLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
Хирургическое лезвиеFeatherNo22
Ручка скальпеляПероNo 4
Savant SpeedVac/Улавливатель паровThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104вакуумный концентратор
Одноразовый стеклянный тобе (13x100 мм)IWAKI9832-1310
Стерильная чашка ПетриINA OPTICAI-90-20
186000274

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи