Методическая статья

Моющее бесплатно сверхскоростной воссоздание мембранных белков в липидных бислоев с помощью дополнительных заряженные Proteoliposomes Fusogenic.

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56909

⸱

5 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем два Сверхбыстрые протоколы для мембранных белков в fusogenic proteoliposomes и слияние таких proteoliposomes с целевой липидных бислоев для моющих средств Бесплатная доставка этих мембранных белков в postfusion бислоя. Сочетание этих подходов позволяет быстро и легко управляемой сборки сложных многокомпонентных мембранных систем.

Аннотация

Моющие средства необходимы для доставки мембранных белков в 30-100 Нм мелких однослойных везикул, в то время как более сложный, более крупные модели липидных бислоев менее совместимы с моющими средствами.

Здесь мы описываем стратегию обход это фундаментальное ограничение, с помощью fusogenic противоположно взимается липосомы, принимая Выделительный протеин интереса. Слияние между такими везикулы происходит в течение 5 мин в буфере низкой ионной силы. Положительно заряженные fusogenic липосомах может использоваться как простой Трансфер векторов для моющих средств Бесплатная доставка мембранных белков в biomimetic целевой липидных бислоев, которые отрицательно заряженные. Мы также покажем, как воссоздать мембранных белков в fusogenic proteoliposomes с протоколом быстро 30-мин.

Сочетание этих двух подходов, мы демонстрируем быстрый монтаж электрона транспортной цепи, состоящей из двух мембранных белков от кишечной палочки, первичный протонного насоса Бо3-оксидазы и F1Fo АТФ-синтаза, в мембранах везикулы различных размеров, начиная от 0.1 до > 10 мкм, а также производства АТФ в этой цепи.

Введение

Функционализация искусственных липидных бислоев с мембранных белков является ключевым шагом в Ассамблее мембранных систем модели. Простая модель, proteoliposomes (PL), состоит из небольших (диаметр 30-200 Нм) однослойных везикул (Внедорожник, также называемый липосомы), с белками интегрированы в их мембран. PL традиционно образуются в двух шагах1. Во-первых, предварительно внедорожник смешиваются с мембраной протеина интереса и моющих средств в концентрации выше концентрация его критических мицеллы (CMC). Во-вторых моющее удаляется с различные методы фильтрации диализа, «био бисер» или гель, оставляя белка в мембрану. Последний подход гораздо быстрее (~ 30 мин1) и поэтому предпочтительным для растворения белков хрупкой и чувствительной мембраны, в то время как первые два подхода ограничены моющим средством удаления скорость, которая занимает много времени и может привести к значительные потери активности и потеря структурной целостности белков. Функционализация большие пузырьки (большой однослойных везикул, LUV, до 1 мкм в диаметре), этот подход является более сложным, как везикул размер получает уменьшается после удаления моющего средства, и это не возможно для гигантских однослойных везикул (GUV, > 1 мкм), поскольку они являются дестабилизированы моющие средства (но см. Джонсон и др. 2 для медленных 2D-кристаллизации мембранных белков в больших бислоев). Альтернативные подходы для GUV мембраны функционализации3,,45 существуют, но трудоемкий, много времени и по-прежнему требуют некоторых моющих средств в концентрациях ниже CMC. Более сложные или хрупкие липидные модели (например, капелька гидрогеля бислоев6 и 3D печати на основе капелька интерфейса бислой искусственных тканей7) не может терпеть моющих средств. Быстро возникающих синтетической биологии приложения8,9,10 критически зависит функционализации таких сложных мембранных структур. Таким образом простой и надежный метод, позволяющий быстро и нежный доставки мембранных белков в целевой хрупкие бислоев высоко ценятся в поле.

Альтернативой, метод доставки бесплатный стиральный порошок белка является везикул фьюжн, где взаимодействующих везикулы мембраны объединяются в нетронутыми postfusion бислой, в то время как их intravesicular водный содержимое смешивается, без выхода на внешние окружающей среды. Сплавливание Vesicle включена и инициативе либо конформационные перестановки в течение дополнительных fusogenic агентов (некоторые белки11,12 и пептиды13 или специально модифицированные ДНК14) в обращении бислоев или кулоновских взаимодействий между липидных бислоев образуются дополнительности заряженные катионные и анионными липиды15,16, или катионный бислоев и отрицательно заряженные белки17.

Первый подход требует присутствие fusogenic агентов в взаимодействующих мембраны до фьюжн, сравнительно медленно (~ 30 мин до половины максимум фьюжн12,18), но может применяться как природных, так и искусственные мембраны.

Преимущество подхода, с использованием fusogenic липиды (рис. 1) является, что она позволяет гораздо быстрее мембраны Фьюжн (~ 1 мин до половины максимум и 5-10 мин до конца реакции). Кроме того степень слияния могут быть проконтролированы i) легко сформулировать относительное содержание заряженных липидов в fusogenic бислоев и ii) ионные и, в общем, осмотической прочность реакция среды (соли на выше 50 мм и, например, сахароза15 показываются остановить фьюжн), или комбинация обоих. Чтобы начать слияние, противоположно заряженных fusogenic везикулы смешиваются в среде ионной силы низкий (обычно 10-20 мм соль) 5-10 мин. Относительным недостатком метода является что Катионный липиды могут оказывать негативное воздействие на функциональность мембранных белков в катионной proteoliposomes до фьюжн, особенно в низкой ионной силы, но этот эффект является обратимым и смягчить по естественным липидный состав после слияния мембраны и ее возвращение к нормальной ионной силы среды.

Протокол

1. Подготовка fusogenic SUV и LUV

  1. Подготовка смеси липидов fusogenic
    1. Подготовка запасов решения нейтральных, катионных, анионных и флуоресцентные липидов в хлороформе на 25-50 мг/мл (например, нейтральных DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), Катионный этил PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), анионные Попа (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) и флуоресцентный cholesteryl-Bodipy-FL12, соответственно) весом соответствующее количество сухих липидов и их растворяют в 100% хлороформ (осторожно! Сделать это под зонт), или разбавления коммерчески доступных хлороформ запасы липидов с хлороформом.
      Примечание: Как экстракты натуральных липидов и чистый синтетический липиды могут быть использованы и продемонстрировать аналогичные результаты.
    2. Смешайте 2,5 мг катионные и 2,5 мг нейтральных липидов на складе (1.1.1) хлороформ в стеклянный флакон.
      Примечание: Этот шаг дает 5 мг смеси катионоактивный липид в хлороформе, содержащий 50% вес дроби Катионный липидов. При необходимости, добавьте 0,5% Массовая флуоресцентные липидов в смеси.
    3. Смешайте 1 мг анионных и 4 мг нейтральные липиды в хлороформе запасов (1.1.1) в стеклянный флакон. Это дает 5 мг анионные липидов смеси, содержащие 20% вес дроби анионные липидов.
    4. Испарится хлороформ под струей азота сформировать тонким слоем сухого липидов.
    5. Удаление остаточных хлороформ под вакуумом для 10 мин.
      Примечание: Традиционно этот шаг занимает гораздо больше времени (1-12 ч), но мы обнаружили, что более длительное лечение обеспечивает очевидные улучшения сцепных свойств внедорожник не.
    6. Гидратов сухой липидной пленки, добавив каждый флакон 0,5 мл буфера A (100 мм KCl, 1 мм MgCl2, 50 мм MOPS, рН 7,4) и оставляя их стоять при комнатной температуре за 30 минут, а затем вихря, до тех пор, пока фильм липидов является полностью отделен от поверхности стекла и b ecomes подвеска однородных липидов. Это должно занять около 20-40 s.
  2. Формирование внедорожник и LUV методом экструзии
    1. Соберите систему экструзии (см. Таблицу материалы) с двумя шприцы 1 мл, используя фильтр из поликарбоната с одним из следующих поры размеров: 100 или 200 Нм в форме внедорожник и 400 или 800 Нм в форме LUV.
    2. Передача подвеска липидов в шприц.
    3. Выдавливание подвеска, передав его через фильтр 21 раз, как показано в других странах18,19.
      Примечание: Нечетное количество проходов необходима для сведения к минимуму передачи в пузырек решение больших липидов сгустки, застрял в фильтр стороной оригинальные подвески липидов.
    4. Передача решения везикул в 1,5 мл пробирок microcentrifuge.

2. формирование Fusogenic GUV Перевернутый эмульсии методом

Примечание: Эта процедура показана на рисунке 2.

  1. Приготовление раствора липидов в нефти
    1. Смесь хлороформ запасов (см. шаг 1.1.1) нейтрального липидов (2 мг) и анионные липидов (0,5 мг) в 1 мл гексадекан в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Испарится хлороформ от смеси под постоянным смешивания и отопление при 80 ° C за 30 мин, открытостью и трубки. Закройте трубку и Остудите до комнатной температуры.
  2. Формирование монослоя липидов на интерфейс липидов в масло/водный буфера
    1. Место 200 мкл раствора липидов в масло поверх 0,5 мл буфера B (20 мм KCl, 0,1 мм MgCl2, 10 мм MOPS рН 7,4) в пластиковых пробирок 1.5 мл. Обратите внимание на выпуклой формы границы разделения фазу из-за несоответствия поверхностного натяжения между нефти и водной буфера (рис. 2A).
    2. Подождите, пока фаза границы разделения сплющивает, который свидетельствует о формирование монослоя липидов на нем. Это обычно занимает 30-60 мин при комнатной температуре.
  3. Подготовка эмульсионной воды в нефти
    1. Приготовляют раствор водорастворимых полисахаридов неионных в буфере B, с плотностью выше, чем плотность воды (например , 15% Ficoll-400 (w/v), с плотностью 1,05 г/мл)
      Примечание: При необходимости можно добавить водорастворимые краски люминесцентные, флуоресцентные буфер для лучшей визуализации GUV, и любых других желаемых водный содержимое GUVs.
    2. Передача 0.5 мкл выше смеси отдельные 1,5 мл пластиковых пробирок с 100 мкл раствора липидов в нефти от 2.1.2.
    3. Sonicate (44 кГц 14 W) смесь для 30 s ультразвуковой водяной бане. Затем, энергично Вортекс для 45 мин сформировать эмульсионной воды в нефти, где каждая капелька будет покрыт липидной монослоя (рис. 2B).
  4. Преобразование воды в нефтяной эмульсии в GUV
    1. Место результирующая эмульсии на вершине липидов в масло/водный интерфейс и немедленно центрифуга трубку в центрифугу столешница на 10000 x g на 2 мин. Полученные гранулы GUV должно быть четко видно (рис. 2 c).
    2. Прохладный трубку до 4 ° C в холодильник, чтобы затвердеть смесь липидов в масло (Рисунок 2D, гексадекан затвердевает ниже 18 ° C), тщательно удалить замерзшей нефти и затем вывести водной фазе.
      Примечание: Для облегчения нефти был использован удаления замораживание Проволока изгибается в форме якоря.
    3. Ресуспензируйте GUV Пелле в 50 мкл свежие буфера B, передача свежих трубку и осмотрите под микроскопом флуоресценции, с использованием 100 X нефти погружения цель (Рисунок 2E).

3. Мониторинг Сплавливание Vesicle с кобальт Флуорексон метод

  1. Подготовка геля фильтрации столбца гравитации.
    1. Замочите ~ 10 г геля фильтрации смолы (например сверхтонкого торфов G-50) в 100 мл деионизированной воды и пусть зыбь на ночь.
    2. Пакет 3 мл раствора смолы в столбец потока одноразовые пластиковые гравитации, мыть с ультрачистая вода и сбалансировать с буфера C (100 мм KCl, 10 мм MOPS, рН 7,4) при комнатной температуре.
  2. Подготовка внедорожник+ или внедорожник0 загружен с кобальтом Флуорексон.
    1. Подготовить раствор, содержащий Флуорексон 1 мм, 1 мм CoCl2, 98 мм NaCl, MOPS 10 мм, а затем довести рН 7,4.
      Примечание: Суть метода является что бесплатные флуоресцентные Флуорексон образует комплекс не люминесцентные с Co2 +. Она становится люминесцентные снова после добавления ЭДТА, который имея выше сродство для Co2 +, вытесняет Флуорексон от кобальта Флуорексон комплекса (рис. 3A).
    2. Добавьте сухой пленки Катионный или нейтральные липиды, подготовленных как описано в 1.1 500 мкл этого решения.
    3. Подготовка 100 Нм внедорожник методом экструзии, как описано в 1.2.
    4. Гранулы экструдированного внедорожник на 1000000 g x 20 мин в настольная ультрацентрифуга и Ресуспензируйте в 1 мл буфера C. Повторите для грануляции и ресуспендирования три раза; Используйте 0,6 мл буфера C для последнего ресуспендирования.
      Примечание: Эти шаги удалить большую часть внешней Флуорексон кобальта.
    5. Удалите оставшиеся внешних кобальта Флуорексон, передав внедорожник через столбец одноразовые гравитации потока, загружен с гель фильтрации смолы, достижение равновесного уровня с буфером C, как описано для шага 3.1.2.
      Примечание: Мы обычно отбросить первый миллилитр объем потока через и собирать второй миллилитр, которая содержит внешние кобальта Флуорексон бесплатно внедорожник.
  3. Подготовка внедорожник– загружен с ЭДТА
    1. Готовят раствор 10 мм ЭДТА, 80 мм NaCl, 10 мм MOPS, рН 7,4.
    2. Добавьте 500 мкл этого решения сухой пленки анионные липидов, подготовленный, как описано в 1.1.
    3. Подготовьте внедорожник– , экструзии, как описано в 1.2.
    4. Гранулы и Ресуспензируйте внедорожник– , как описано в 3.2.4.
    5. Удалите оставшиеся ЭДТА, проходя через гель фильтрации столбцов, как описано в 3.2.5 внедорожник– .
  4. Подготовка внедорожник для fusion
    1. Разбавить внедорожник0,+внедорожник и внедорожник– с буфера D (1 мм MOPS, рН 7,4), дополнены 0,2 мм CoCl2 и нужную концентрацию KCl. Использование 5 мкл каждого типа SUV на 1 мл буфера D.
    2. Инкубируйте смесь для по крайней мере 1 час.
      Примечание: Этот шаг позволит свести к минимуму фоновый уровень флюоресценции, блокируя Флуорексон, поверхность привязывается к внедорожник+.
  5. Сплавливание Vesicle
    1. Начала реакции сплавливания, смешивая 1 мл внедорожник+ или внедорожник0 с 1 мл раствора внедорожник− (разводят в буфере D как описано выше) в 2-мл fluorimeter кювет и монитор повышение флуоресценции Флуорексон с использованием 480 Нм возбуждения и 510 нм выбросов (Рис. 3B).
    2. Подождите, пока Реакция идет до конца.
    3. Добавить смесь стиральный порошок X-100 Тритон и ЭДТА (конечной концентрации 0,05% и 7 мм, соответственно) освободить Флуорексон из везикул и получить максимум флюоресценции сигнала.
    4. Определите степень слияния, определяется как процент максимального флуоресценции сигнала после стиральный порошок сложения, как показано на рисунке 3 c.

4. быстрое воссоздание мембранных белков в Fusogenic Proteoliposomes

Примечание: Эта процедура показана на рисунке 4A.

  1. Подготовить столбец потока гравитации с гель фильтрации смолы, как описано в пункте 3.1 и сбалансировать с буфером A при комнатной температуре.
    Примечание: Все дальнейшие манипуляции должны выполняться строго в ≤ 4 ° C, если не указано иное, чтобы свести к минимуму потери активности белков.
  2. Отрегулируйте концентрацию очищенного мембранные белки до 0,7 мг/мл путем разбавления с же извлечения буфер, используемый для изоляции белка.
  3. Mix 140 мкл белка с 300 мкл предварительно внедорожник, 160 A мкл буфера и 60 мкл 10% холат в буфере A; Это дает 1:30 белка: соотношение веса липидов в окончательный объем 660 мкл.
  4. Осторожно встряхните смесь на качающейся платформе за 15 мин.
    Примечание: Следующие шаги может быть сделано при комнатной температуре.
  5. Передайте смесь через гель фильтрации смолы и собирать мутная фракций, содержащих proteoliposomes.
  6. Пелле proteoliposomes с настольная ультрацентрифуга на 400 000 g x 15 мин.
  7. Отменить супернатанта, содержащие белок не восстановлена и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл свежего буфера а.
  8. Определите содержание белка в PL и супернатанта, используя метод АМИДО черный20.
  9. Определите доходность растворения, который обычно составляет около 50-70%.
    Примечание: Шаги 4,6-4,8 могут при необходимости быть заменены передачи PL решение через 1 мл раствора смолы Ni-НТА упакованы в столбец одноразовые гравитации и промывают с буфером A, как описано в 3.1.2. Такая передача будет отдельный-восстановленный белка, который преимущественно будет привязан к смолы, от пл, большинство из которых будет в поток через.

5. функциональные тесты активности белка в Proteoliposomes

Примечание: Оба белки, используемые в данном исследовании являются мощные Протон насосы, которые насоса H+ в proteoliposomes при добавлении их субстратов (кофермент Q1 для Бо3-оксидазы и СПС для F1Fo, соответственно), таким образом строительство Градиент протона через мембрану (ΔpH). В случае успешного сотрудничества воссоздание фьюжн такие подкисления могут наблюдаться как уменьшение флуоресценции зонда рН чувствительных ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, который обычно используется для таких задач ( Рисунок 4B -C). Деятельность дополнительно субстрат специфических белков (кофермент Q1 окисления Бо3-оксидаза22 и гидролиз АТФ F1Fo23,24) могут контролироваться спектрофотометрически с использованием различных методов. Здесь, мы демонстрируем деятельность гидролиз АТФ F1Fo PL с помощью АТФ, восстанавливающий пробирного (рис. 4 d), где два ферменты (пируваткиназой (PK) и Лактатдегидрогеназа (LDH) поддерживать постоянной концентрации ATP следующим образом. PK перерабатывает СПС путем преобразования ADP, производимые F1Fo обратно в СПС за счет ее субстрат phosphoenolpyruvate (ОПТОСОЗ). Пируват, который является продуктом этой реакции, превращается в лактат, ЛДГ за счет NADH, окисление которого может контролироваться как снижение оптической плотности на 340 Нм.

  1. Подготовка химических веществ
    1. Подготовка 1 мм ACMA складе в этиловом спирте.
    2. Подготовьте запас 1 мм nigericin (или любой другой uncoupler) в этаноле.
    3. Подготовка 25 мм кофермент Q1 фондовой в этаноле и 1 М складе DTT в буфере A.
    4. Подготовить запас 100 мм АТФ в буфере A и скорректировать ее рН 7,4.
    5. Подготовка запасов АТФ, восстанавливающий компоненты системы в буфер A: 100 мм ОПТОСОЗ, 1 мм NADH и решения PK и ЛДГ в концентрации ~ 500-1000 единиц/мл.
  2. Кофермент Q1 окисления driven Протон накачки Бо3-оксидаза PL
    1. 20 мкл PL для fluorimeter кювет с 2 мл буфера A в присутствии 0,5 мкм ACMA и ждать, пока стабильный сигнал с помощью 430 Нм возбуждения и 515 нм выбросов.
    2. Добавьте 40 мкм кофермент Q1 в кювет.
    3. Инициируйте, Протон накачки, добавив 2 мм DTT PL (рис. 4В).
      Примечание: DTT уменьшает окисленных кофермент Q1 и делает его доступным для Бо3-оксидазы.
    4. Рассеять сформированных ΔpH путем добавления 2 мкм uncoupler (например nigericin). Сигнал ACMA флюоресценции должен быстро вернуться к почти первоначального уровня.
      Примечание: Там должна быть не ACMA закалка на добавления субстрата, если uncoupler присутствует в реакционной смеси изначально.
  3. ATP гидролиз driven Протон накачки F1FoPL
    1. Добавьте 40 мкл PL fluorimeter кювет, как описано в пункте 5.2.
    2. Инициируйте, Протон накачки путем добавления 0,2 мм СПС PL (рис. 4 c).
    3. Рассеять ΔpH, как описано в 5.2.4.
  4. Гидролиз АТФ F1FoPL, и ее стимуляции, uncoupler
    1. Добавьте 40 мкл PL на спектрофотометре кювета с 2 мл буфера A, содержащий АТФ 1 мм, 0,2 мм NADH, 2 мм ОПТОСОЗ и 15 мкл PK и ЛДГ.
    2. Следуйте реакции путем измерения оптической плотности снижение NADH на 340 Нм. 3-4 минут позже, добавить 2 мкм uncoupler в кювет выпустить противодавлением ΔpH на гидролиз АТФ. Немедленно следует увеличить скорость реакции.
      Примечание: PL, прошли через Ni-НТА смолы, как описано в 4.10 продемонстрируют сильной стимуляции, uncoupler (рис. 4 d, красный след), в то время как элюата будет едва стимулировали (синий след).

6. Тестирование влияния среды липидов и ионной силы на функциональность мембранных белков в Fusogenic Proteoliposomes

  1. Оценить, Протон накачки 40 мкл PL+, PL– и PL0 с ACMA тушения assay в 2 мл буфера дополнена 1 MgCl2 и 20 (Рисунок 5, Группа A) или 100 мм KCl (Группа B), как описано в 5.2 и 5.3 (рис. 5 D красный, черный и синий следы).
  2. Предохранитель 40 мкл PL+ с же объем LUV– в 2 мл буфера D 20 мм KCl и тест для тушения ACMA (зеленый след).
  3. Запуск управления эксперименты как в шаге 2, смешивая, например, PL и внедорожник же заряда (серый трассировки).
    Примечание: Протон накачки следует улучшить путем postfusion пл.

7. Доставка мембранных белков в LUV и GUV по Fusogenic Proteoliposomes

  1. Предохранитель 50 мкл PL+ с 50 мкл 800 Нм LUV– в 1 мл буфера D дополнить с 1 мм MgCl2и 20 мм KCl на 5 мин.
  2. Пелле везикулы на 6000 x g 5 минут и отбросить супернатанта содержащий непрореагировавшего PL+. Ресуспензируйте гранулы в 1 мл буфера D дополнить 1 MgCl2 и 100 мм KCl и повторять грануляции и resuspending вдвое больше.
  3. Запустите ACMA закалки пробирного, как описано в 5.2 и 5.4.
  4. Запуск управления экспериментов, как и шаги 1-3, с помощью сочетания взаимодополняющих заряженных везикулы в высокой соли (200 мм KCl), не fusogenic везикулы и просто пустой LUV– без PL+.
    Примечание: Протон накачки postfusion LUV должна быть обнаружена только при дополнительности заряженных пузырьки были использованы, как показано на рисунке 6.

8. Ассамблея цепи переноса электронов из отдельных компонентов в мембранах LUV и GUV и производства АТФ в этой цепи.

Примечание: Схема эта процедура показана на рис. 7A. АТФ производится в этом эксперименте будет зарегистрирован в системе люциферин Люцифераза, где преобразование синтезированных АТФ в пирофосфата и AMP, Люцифераза следуют светового излучения, зарегистрированных с Люминометр. Мы рекомендуем использовать однотрубные Люминометр, вместо менее чувствительных luminometers Гонав.

  1. Mix 3 мкл Бо3-оксидаза PL+ и 5 мкл F1Fo PL+ формируется как описано в разделе 4.
  2. Предохранитель их с 3 мкл LUV или GUV– (формируется как описано в разделе 2) в 800 мкл буфера D 20 мм KCl и 1 мм MgCl2 для 5 мин.
  3. С помощью высокой концентрации запасов, добавьте KCl и швабры 100 мм и 50 мм конечная концентрация postfusion мембраны.
    Примечание: В случае после слияния LUV, этот шаг позволит предотвратить их набухания благодаря осмотического смещение между внешней (буфер A) и intravesicular (буфер D) концентрации солей.
    1. При необходимости Пелле postfusion мембраны, как описано в 7.2 отделить непрореагировавшего внедорожник+и Ресуспензируйте гранулы в 800 мкл буфера а.
  4. Подготовка 200 мкл люциферин Люцифераза адаптация адаптация коктейль содержащий 400 мкм, 50 мкм люциферин и 2,5 мкг Люцифераза в буфере A
  5. Добавьте коктейль в postfusion смесь с Step8.3.
  6. Добавьте 40 мкм из окисленных кофермент Q1и вызвать активизацию postfusion мембран, Бо3-оксидазы, добавив 2 мм DTT. Подождите 1 мин.
  7. Инициировать синтез АТФ, добавив 5 мм фосфат калия (КП,я, рН 7,4) напряжением везикулы и обнаружить производства АТФ с Люминометр (рис. 7B). Запуск реакции для ~ 3 мин.
    Примечание: Реакция синтеза АТФ продолжается 5-7 мин до истощения кислорода, потребляемого Бо3-оксидазы и Люцифераза.
  8. Добавьте СПС эталон (0.5 нмоль ATP) в реакционную смесь дважды. Мера АТФ производится.
  9. Получите фактическое количество АТФ производится в реакции, разделив сигнал от реакции синтеза АТФ, стандартный сигнал справочник СПС. Изменить это значение на общую сумму1F Fo используется в реакции и наконец выразить скорость синтеза АТФ в мкмоль СПС / (mg F1Fo* мин).

Результаты

Использование fusogenic дополнительных заряженных proteoliposomes для быстро моющих средств Бесплатная доставка мембранных белков в целевой бислоя мембраны включает три этапа (рис. 1): A, формирование fusogenic внедорожник от смеси липидов с высоким содержание заряженных липидов; Эти внедорожник может при необходимости нести intravesicular нагрузки; B, преобразование fusogenic внедорожник в PL, используя наш растворения белков быстро мембраны; C, слияние fusogenic PL с целевой бислоев в среде низким содержанием соли, следуют добавлением высокой соли для остановки реакции сплавливания. В случае крупных пузырьков (D), предпочтительной стратегией является доставить мембранные белки в анионной целевой бислой, которая обеспечивает лучшую липидов среду для деятельности мембранных белков (обсуждается далее в тексте).

GUV формирование протокола с Перевернутый эмульсии методом выделяется в деталях на рисунке 2. Мы предпочитаем использовать гексадекан в смесь липидов масла из-за его относительно высокой температуры замерзания (18 ° C), которая позволяет легко удалять затвердевшее масло после GUV грануляции.

Рисунок 3 показывает везикул фьюжн с помощью метода кобальта Флуорексон ЭДТА. Фьюжн видно, когда дополнительные заряженных везикулы используются только в низкой соли буферов, а более высокие концентрации соли (> 50 мм14) или использование не fusogenic везикулы продемонстрировать не фьюжн.

Этот быстрый протокол воссоздание мембранных белков в fusogenic SUV проиллюстрирован на рисунке 4A. Используя этот протокол, мы демонстрируем быстрое восстановление первичной протонного насоса Бо3-оксидазы и F1Fo АТФ синтетазы в PL и оценки их удельной активности в этих оболочек. Важно отметить, что доходность растворения белков не зависит от заряда липидов используется15 и составляет около 50-75%25,12, и что после растворения в PL, белка могут храниться в течение по крайней мере три дней, даже при комнатной температуре без очевидных потеря активности белков. Эта процедура также предоставляет однонаправленный ориентации АТФ-синтазы, где более чем 95% имеет ее гидрофильные группу F1 ориентированные наружу15,26.

Рисунок 5 показывает, что Протон, насосные деятельность F1Fo (Группа A) и Бо3-оксидазы (Группа B) в катионной липидов является снижение и чувствительны к низкой ионной силы, по сравнению с окружающей среды анионных и нейтральных липидов, но Этот эффект снижается после сплавления PL+ с анионными LUV–в postfusion мембраны.

Рисунок 6 иллюстрирует доставки F1Fo АТФ-синтазы в мембранах большие пузырьки. В этом эксперименте, PL+ и 800 Нм, LUV– были слиты в 20 мм KCl на 5 мин и продукт реакции был гранулированных удалить неконденсированное PL+, высокомобильна и assayed для перекачки протонов. Управления эксперименты показали не Протон накачки, когда LUV0 вместо LUV– были использованы в реакции синтеза (черный след), или пустой LUV– только были Оксиметрический анализ (синий след).

Быстрая сборка функционирующей цепи переноса электронов в мембранах большие пузырьки с помощью fusogenic PL показано на рисунке 7. Мы использовали F1Fo внедорожник+ и Бо3 внедорожник+ для fusion с 800 Нм LUV-и подтверждается эта цепь в postfusion везикулы производства АТФ, последовательно добавляя кофермент Q1 и DTT подпитать мембраны и затем Добавление фосфат вызвать синтез АТФ, F1Fo.

figure-results-1
Рисунок 1: концепция сверхбыстрого моющих средств бесплатная доставки мембранных белков в целевой липидных бислоев через слияние однослойных везикул формируется из взаимодополняющих заряженных липиды. (A) формирование катионные и анионными fusogenic мелких однослойных везикул (+внедорожник, джип–) при необходимости загружается с intravesicular грузов. (B) преобразование fusogenic внедорожник в fusogenic proteoliposomes (PL), воссоздание мембранных белков. (C) моющих средств Бесплатная доставка мембранных белков в postfusion мембраны с fusogenic PL. (D) предпочтительной стратегией для доставки мембранных белков в мембранах большие пузырьки, иллюстрируется сплавливание между 100 Нм PL+ и 800 Нм LUV–. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: GUV формирование протокола с помощью метода Перевернутый эмульсии. (A) формирование монослоя липидов на границе между смесь нефти липидов и воды. (B) формирование Перевернутый эмульсии (воды в нефти). (C) GUV формирования, передав эмульсии через границу нефть вода с помощью центрифугирования. (D) охлаждение ниже трубки < 18 ° C до затвердеть и удалению нефти. (E) A флуоресцентной микроскопии изображение GUV, содержащие флуоресцентные липидов (1% Вес дроби cholesteryl-Bodipy-FL12) в ее мембраны (зеленый) и Полярный Флюорофор (1 мм Sulforhodamine 101) в пузырек в просвете (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: синтез липидов везикулы учился с методом кобальта Флуорексон ЭДТА. (A) схема метода, где бесплатно Флуорексон освобождается от не люминесцентные кобальта Флуорексон комплекс ЭДТА. (B) слияние внедорожник в различных концентрациях KCl. (C) релиз intravesicular Флуорексон добавлением ЭДТА и Тритон X-100 моющего средства postfusion везикулы, показано в B , как описано в тексте. Степени Фьюжн (%), для красный след рассчитывается путем деления максимального фьюжн, скорректированные по фону сигнал (1 - 2), скорректированные по фону максимального сигнала после выпуска инкапсулированные Флуорексон (3-2) и умножения на 100. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Сверхскоростной воссоздание Бо3-оксидазы и F1Fo в fusogenic proteoliposomes и измерения активности белка в таких proteoliposomes. (A) схема протокола растворения. (B) кофермент Q1 окисления инициативе Протон накачки Бо3-оксидаза в PL измеряется с ACMA закалки (описано в тексте). (C) СПС гидролиз driven Протон накачки F1Fo в PL измеряется с ACMA закалки (описано в тексте). (D) СПС гидролиз от F1Fo в PL измеряется с системой регенерации АТФ (описано в тексте) и ее стимуляции, uncoupler. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: влияние окружающей среды липидов и ионной силы на активность мембранных белков. Протон, накачки F1Fo (A) и Бо3-оксидазы (B) в катионной PL (красный след), анионные PL (синий след), нейтральных PL (черный след) и катионные PL сливается с анионными LUV (зеленый след) в 20 и 100 мм (трассировки) KCl. контроль серый) показывает никаких изменений в Протон, накачки F1Fo PL– по смешивания с внедорожник–. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Поставка F1Fo АТФ синтетазы в мембранах 800 Нм LUV– через слияние с PL+. (A) схема эксперимента: PL+ и 800 Нм, LUV– были слиты в 1 мм МОПЫ (рН 7,4), 1 мм2MgCl 20 KCl на 5 мин, гранулированных удалить неконденсированное PL и высокомобильна в тот же буфер. (B) Протон накачки postfusion LUV (красный след). Управления эксперименты показали не ACMA закалки, когда PL0 были смешаны с LUV– (черный след), или пустой LUV– только были Оксиметрический анализ (синий след). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7: 5-мин бесплатный стиральный порошок Ассамблея цепи переноса электронов в мембранах 800 Нм LUV– через слияние с PL+. (A) схема эксперимента: 100 Нм F1Fo PL+ и 100 Нм Бо3-оксидаза PL+ были слиты с LUV-, как описано на рисунке 6. Сплавливание было остановлено путем добавления KCl и швабры 100 и 50 мм, соответственно. Мембраны были смешаны с АДФ люциферин Люцифераза коктейль и напряжением путем добавления DTT и Q1, как описано в тексте. Производство СПС был инициирован добавлением фосфат 1 мм (Pi) и мониторинг в реальном времени с Люцифераза люциферин системы, как описано в тексте. (B) СПС синтеза postfusion везикулы (красный след). Управления эксперименты показали не производства АТФ, когда PL+ были смешаны с LUV– в высокой соли (серый), или PL0 были смешаны с LUV– (черный). Скорость синтеза ATP была рассчитана как описано в тексте (шаги 8.8-8,9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Следующие несколько вопросов должны рассматриваться для успеха этого экспериментального подхода:

Выбор бесплатно липидов в proteoliposomes и целевых бислоев: Катионный липиды не встречаются в природе, в то время как анионные липиды являются обильные в биологических мембран, достижения, например, ~ 25, 35 и 20% в внутренняя мембрана E. coli, плазматическую мембрану дрожжей S. cerevisiaeи внутренней митохондриальной мембраны Многие виды, соответственно27,,2829. Было бы разумно ожидать, что функциональность мембранных белков в PL+ могут быть затронуты сила положительный заряд бислоя, который в свою очередь, будет зависеть от относительное содержание Катионный липидов в бислой и внешних ионные сила. Таким образом важно для решения экспериментально, в какой степени функциональность мембранных белков интерес будет зависеть от заряда катионоактивный липид окружающей среды. Здесь, мы показывают, что оба F1Fo СПС синтазы и Бо3-оксидаза чувствительны к окружающей среде катионоактивный липид, но нам удалось модулировать и обратить вспять этот эффект первого размещения белки в PL+ и доставлять их в анионные, принимая бислоев и затем увеличивая ионной силы среды реакции после сплавливания закончена.

Выбор конкретной Катионный липидов: Большинство коммерчески доступных Катионный липиды являются не triacylglyceride характер; Поэтому потенциальный кандидат липидов необходимо быть протестированы на совместимость с мембранных белков интерес. Мы нашли ранее15 , АТФ-синтазы, используемые в данном исследовании показали, что его лучший спектакль в PL+ сформировал этил-ПК, который имеет наивысший структурное сходство к естественной triacylglyceride липидов, в то время как в DOTAP (не triacylglyceride липидов) PL+ этот белок был менее активны.

Анализов сплавливание vesicle: Истинный везикул Фьюжн (когда intravesicular жидкое содержимое смешать) должен быть продифференцированным от промежуточных hemi фьюжн государств, когда везикулы придерживаться друг друга без смешивания их водной содержание, но легко смешать содержимое их внешних или оба липидов листочки30. В случае субоптимального липидов смеси или определенных условий везикулы также продемонстрировать произносится утечки жидкого содержимого во время слияния31. Минимальные концентрации заряженных липидов в fusogenic смеси, позволяя истинный Фьюжн должны быть найдены экспериментально для каждого вида липидов, но в целом, выяснилось, что мембраны с менее чем 10% заряженные липиды визуализируются не fusogenic 32.

При формировании fusogenic внедорожник в присутствии ионов multi Валент, важно не смешивать противоположно заряженных компонентов, как это может привести к немедленной слипания и агрегирование липидов этими ионами. Например при подготовке Внедорожников для метода кобальта Флуорексон ЭДТА, важно избежать смешивания смесь катионоактивный липид с ЭДТА для предотвращения засорения фильтра поликарбоната скомканным компонентами.

Важно также отметить, что метод кобальта Флуорексон ЭДТА, будучи очень чувствительны и удобным для мониторинга в реальном времени фьюжн, могут по-прежнему заниженные фьюжн из-за 1) самостоятельного тушения флуоресценции бесплатные Флуорексон внутри postfusion пузырьки, которые, как ожидается, добраться до 1 мм, в то время как самостоятельной тушения порог, как сообщается, около 20 мкм33, и 2) поверхность прыгните кобальта Флуорексон, который остается привязанным к внедорожник+ даже после прохождения через гель фильтрации смолы и цвета пузырьки до ярко-оранжевого цвета, в то время как внедорожник0 имеют бледно-оранжевого цвета. Также, обратите внимание, что релиз привязанного кобальта Флуорексон после добавления моющих средств Тритон X-100 присутствии ЭДТА создает гораздо сильнее сигналов для Внедорожников+ (рис. 3 c, красный след), чем внедорожник0 (серый трассировки).

Перспективы: мы ожидаем, что быстро подходов, описанных здесь может значительно облегчить и ускорить Ассамблеи сложных мембран для нужд новых приложений синтетической биологии. Наш мембранных белков воссоздание протокол занимает всего полчаса для растворения хрупкие большой мембранных белков известный быть чувствительным к длительной основе диализа воссоздание методы, в то время как этот подход fusogenic занимает всего 5-10 мин для доставки такие белки в большой липидов бислоев. Здесь мы продемонстрировать преимущества этих подходов, манипулируя E. coli F1Fo АТФ-синтазы, который является примером хрупкие белка. Он состоит из 23 подразделения и как известно, легко потерять свою целостность, если неоптимальных условиях (например, тепло) во время/после солюбилизация, но используются в этих процедурах, белок демонстрирует можно воспроизвести высокой активности в Протон накачки.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарны Роберт Gennis из университета Иллинойса и Кристоф фон Бальмос от Бернского университета для предоставления плазмида и напрягаться, чтобы выразить Бо3-оксидазы. Проект был поддержан СИББН предоставить р.и. и р.б. BB/L01985X/1

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DOPC нейтральные липидыAvanti Lipids850375
POPA анионные липидыAvanti Lipids840857
E-PC катионные липидыAvanti Lipids890704
холестерил-Bodipy-FL12ThermofisherC3927MP
Sephadex G-50, Super FineSigmaG5050
Ficoll 400, тип 400-DLSigmaF8016
ACMASigmaA5806
НигерицинSigmaN7143
ATPSigmaA26209
Q1SigmaC7956
DTT DTTSigmaD0632
PEPSigma860077
NADHSigmaN8129
PKSigmaP9136-1KU
LDHSigmaL1254-1KU
ЛюциферинSigmaL6882
ЛюциферазаSigma/Roche10411523001
CalceinInsight Biotechnologysc-202090
CoCl2SigmaC8661
EDTASigmaE6758
Sulforhodamine 101SigmaS7635
Экструзионная системаAvanti Extruder
Однотрубный люминометр, модель Sirius LTitertek Berthold
Поликарбонатный фильтр, D19 ммSigma, Whatman NucleporeTrack-Etched мембраныWHA800309, WHA800284100 или 200 нм для формирования SUV, и 400 или 800 нм для LUV
NameCompany<Номер >в каталоге>Комментарии
Буферы, использованные в статье
Буфер A100 мМ KCl, 50 мМ MOPS pH 7,4, 1 мМ MgCl<суб>2
Буфер B20 мМ KCl, 10 мМ MOPS pH 7,4, 0,1 мМ MgCl2
Buffer C100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4
Buffer D1 mM MOPS pH 7,4
Различные концентрации KCl

Ссылки

  1. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
  2. Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31(2013).
  3. Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  4. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).
  5. Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
  6. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  7. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  8. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).
  9. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  10. Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).
  11. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  12. Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303(2014).
  13. Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).
  14. Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).
  15. Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025(2016).
  16. Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).
  17. Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).
  18. Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).
  19. Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304(2013).
  20. Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894(2014).
  21. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).
  22. Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).
  23. Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).
  24. Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).
  25. Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).
  26. Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).
  27. Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).
  28. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  29. Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).
  30. Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).
  31. Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).
  32. Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).
  33. Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).

Перепечатки и разрешения

Теги

Реконституция без использования детергентовфузогенные протеолипосомылипосомы с противоположным зарядомгель-фильтрацияфлуоресцентная микроскопияанализ тушения ACMAсинтез АТФэлектрон-транспортная цепь
Моющее бесплатно сверхскоростной воссоздание мембранных белков в липидных бислоев с помощью дополнительных заряженные Proteoliposomes Fusogenic.
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.