Сложность систем в естественных условиях делает его трудно отличить активации и торможения рецептора Notch транс- и СНГ-лигандов, соответственно. Здесь мы представляем протокол, основанный на в пробирке клеток агрегации анализов для качественного и полуколичественного оценки привязки дрозофилы Notch транс-лигандов против СНГ-лигандами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вырезка сигнализации является эволюционно сохранены ячеек системы связи, широко используется в развития животных и взрослых обслуживания. Взаимодействие рецептора Notch с лигандами из соседних клеток вызывает активацию сигнальный путь (транс-активации), в то время как взаимодействие с лигандами из той же клетке подавляет сигнализации (СНГ-торможение). Надлежащий баланс между транс-Активация и СНГ-ингибирование помогает создавать оптимальные уровни Notch сигнализации в некоторых контекстах во время развития животных. Из-за перекрывающихся выражений домены Notch и его лигандов во многих типах клеток и существование механизмов обратной связи, изучению влияния данного столб-поступательные изменения на транс- против СНГ-взаимодействий выемки и его лигандов в естественных условиях трудно. Здесь мы описываем протокол для использования дрозофилы S2 клеток в клетки агрегации анализов для оценки последствий стучать вниз паз путь модификатор в привязке паз для каждого лиганда в транс и в СНГ. S2 клетки стабильно или временно transfected с Notch выражая вектора смешиваются с клетками, выражая каждый паз лиганда (S2-Дельта или зазубренными S2). Транс-связывание рецептора и лигандами приводит к образованию агрегатов гетеротипичной клеток и измеряется количество агрегатов на мл, состоящий из > 6 клеток. Для изучения тормозящий эффект СНГ-лигандов, S2 клетки совместно выражая Notch и каждого лиганда смешиваются с S2-Дельта или S2-зазубренными клеток и количество агрегатов количественно как описано выше. Относительное сокращение числа агрегатов благодаря наличию СНГ-лигандов представляет собой меру СНГ-лиганд-опосредованной ингибирование транс-привязки. Эти просто анализов может обеспечить полу количественные данные о воздействии генетических или фармакологических манипуляций в привязке выемки его лигандов и может помочь расшифровка молекулярные механизмы, лежащие в основе в естественных условиях эффекты Подобные манипуляции на выемку сигнализации.
Введение
Канонические Notch сигнализации является механизм ближней связи к ячейке, который требует физический контакт соседних клеток для облегчения взаимодействия между Notch рецепторов и их лиганды1. Взаимодействие с лигандами рецептора Notch (присутствует на поверхности клеток приема сигнала) (на поверхности отправки сигнала клетки) инициирует Notch сигнализации и известен как транс-активации2. С другой стороны, взаимодействие между Notch и его лигандов в той же ячейке приводит к ингибированию Notch путь и известен как СНГ-ингибирование3. Баланс между транс- и СНГ-вза....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка двойной мель РНК (dsRNA) Шамс нокдаун
- Амплификации PCR продукции
- Используйте одичал тип Желтый Белый (y w) геномной ДНК и pAc5.1-EGFP как шаблон и следующие пары праймера для того чтобы усилить фрагментов ДНК используется в синтезе двуцепочечной ДНК. Используйте следующие ПЦР теплового профиля: денатурация (95 ° C, 30 s), отжига (58 ° C, 30 s) и расширения (72 ° C, 1 мин).
Более Зеленый флуоресцирующий белок Праймеры двуцепочечной ДНК (EGFP) (5' - 3')-
Форвард грунт GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
Обратный грунт GAAATTAATACGACTCACTATAGG....
- Используйте одичал тип Желтый Белый (y w) геномной ДНК и pAc5.1-EGFP как шаблон и следующие пары праймера для того чтобы усилить фрагментов ДНК используется в синтезе двуцепочечной ДНК. Используйте следующие ПЦР теплового профиля: денатурация (95 ° C, 30 s), отжига (58 ° C, 30 s) и расширения (72 ° C, 1 мин).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наши замечания в естественных условиях предложил увеличить потерю результатов Шамс гена xylosyltransferase в прирост Notch сигнализации Дельта опосредованной транс-активация паз не затрагивая СНГ-ингибирование Паз на лигандов8. Чтобы проверить это понятие, были исполнены в пробирке клеток статистических анализов. Во-первых Шамс выражение в клетках S2 был сбит с помощью Шамс двуцепочечной ДНК. EGFP
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Канонические Notch сигнализации зависит от взаимодействия между рецептора Notch и его лигандов5. Хотя большинство исследований на пути Notch прежде всего рассмотреть связывание Notch и лигандами в соседних клетках (транс), паз и же элементная лиганды взаимодействуют и эти так называемые СНГ-взаимодействия может играть роль ингибирующее в паз сигнализации3,4. Соответственно чтобы расшифровать механизмы, лежащие в основе во.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы имеют никакого конфликта интересов.
Благодарности
Авторы признают поддержки от NIH/NIGMS (R01GM084135 HJN) и Фонд Мидзутани Glycoscience (Грант #110071 HJN) и благодарны том V. ли для обсуждения и предложения на анализы и Spyros Artavanis-Tsakonas, Хьюго Беллен, Роберт Флеминг, Кен Ирвин и центр ресурсов дрозофилы геномики (НАУЧНЫМ) для плазмидов и клеточных линий.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| БиографияУиттакер Шнайдер s Среда дрозофилы, модифицированный | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Пенициллин-стрептомицин 100X раствор | GE Здравоохранение lifescience | ||
| CELLSTAR 6-луночный планшет | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24-луночный планшет | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR мини-шейкер | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| гемоцитометр | Fisher Sceintific | 267110 | |
| Реагент для трансфекции FuGENE HD | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Набор для транскрипции | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (набор для очистки РНК) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Инвертированный микроскоп | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Микроскоп Цифровая камера + Расширенное программное обеспечение | AmScope | MU-900 | Получение изображений с помощью программного обеспечения ToupView |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | GenDepot | F0600-050 | |
| Метотрексат | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Гигромицин B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Медный купорос | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2-клетки | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Подарок от R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta клетки | DGRC | 152 | |
| S2-Notch клетки | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta вектор | DGRC | 1021 | Подарок от S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Прикладная биосистема | Dm02144576_g1 | с красителем FAM-MGB |
| TaqMan Анализ экспрессии генов для CG7939 (RpL32) | Прикладная биосистема | Dm02151827_g1 | с красителем FAM-MGB |
| Прикладная биосистема 7900HT Быстрая система ПЦР в реальном времени | Прикладная биосистема | 4351405 | 96-луночным блок-модулем |
Ссылки
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
