Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Нейрон макрофагального Сопредседатель культур для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с Neurite результатом деятельности

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56920

⸱

30 марта 2018 г.

 ,  , 
1Department of Brain Science, Ajou University School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, Department of Biomedical Sciences, Ajou University School of Medicine, 3Department of Neurology, Ajou University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Текущий протокол представляет экспериментальные процедуры для стимулирования культивировали макрофаги быть наделен способность освободить молекулярные факторы, которые способствуют neurite нарост. Лечение лагеря нейрон макрофагального Сопредседатель культур индуцирует макрофаги производить кондиционером среда, которая обладает сильным neurite результатом деятельности.

Аннотация

Существует убедительные доказательства того, что макрофаги могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы. Здесь мы описываем протокол, в котором макрофаги вынуждены производят кондиционером среднего (см), что способствует neurite нарост. Взрослый Спинной корень нейроны ганглии (DRG) остро в отрыве и покрытием. После того, как нейроны стабильно прикреплены, перитонеальных макрофагов совместно культивируемых на вставке культуры клеток, накладывается на то же хорошо. Иммунобиологический циклических AMP (db лагерь) применяется для совместного культур за 24 ч, после чего содержащий макрофаги вставить культуры клеток перемещается в другой хорошо для сбора см за 72 ч. СМ от совместного культур, относились с db лагерь, когда применяется к культуре, нейрон отдельный взрослый DRG, экспонаты надежные neurite результатом деятельности. СМ, полученные из db лагерь лечение культур, состоящий из одной ячейки типа только, DRG нейрон или перитонеальных макрофагов, не проявляют neurite активность нарост. Это означает, что взаимодействия между нейронами и макрофагами незаменима для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с neurite результатом деятельности см. Таким образом наш парадигмы сотрудничества культуры также будет полезным для изучения межклеточной сигнализации в нейрон макрофагального взаимодействия стимулировать макрофаги быть наделен про восстановительной фенотип.

Введение

Целый ряд исследований стремились к повышению регенерации аксона ЦНС после травмы спинного или головного мозга. Воспалительные реакции, неизбежно сопутствующих травм нервной системы, традиционно считаются участвовать в вторичной патологических процессов, ведущих к пагубным результатам1,2. Действительно метилпреднизолон, который может подавить воспалительные реакции является только утвержденные терапия острого спинного мозга травмы3. Однако более поздние исследования представили доказательства того, что макрофаги, представитель воспалительных клеток типа, могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы4,5,6. Например проникнув макрофаги после про восстановительной молекул объектив травмы производят регенерации сетчатки ганглия нейронов7,8. Кроме того пересаженные нейроны DRG увеличение роста аксона до региона, где были активированы макрофаги, zymosan9. Кроме того макрофаги в месте поражения можно создать роста разрешительной окружение для10раненых периферических нервов.

Наша работа также представил сильные доказательства того, что макрофаги могут способствовать способности регенерации аксона в соседних нейронов. Мы показали, что активация макрофагов в спинной корень ганглиев (DRG) были в расширенной регенеративной способностью DRG сенсорных нейронов после предварительной подготовки периферической нерв травмы11. Подобные исследования сообщили независимо от другой лаборатории12. Мы также показали, что intraganglionic инъекции иммунобиологический ЦАМФ (db лагерь), который является известным молекулы для повышения способности регенерации аксона13, индуцированной активации макрофагов. Деактивация макрофаги отменил эффекты db лагерь на neurite нарост активность. Последующие работы определены травмы индуцированной выражение CCL2 в нейронах как сигнал для стимулирования макрофагов с про восстановительной фенотип14,15.

На основании выше экспериментальные результаты, мы создали модель в пробирке , напоминающие молекулярные события, которые происходят в ДРГ после предварительной травмы модель11,14. В этой модели db лагерь применяется к нейрон макрофагального Сопредседатель культур, вызывая межклеточной сигнализации, что приводит к активации макрофагов с про восстановительной фенотип. Здесь мы описываем подробные протоколы, по которым мы можем генерировать макрофаги, которые выделяют молекулярные факторы, содействующие нарост neurite (рис. 1). Эта экспериментальная модель иллюстрирует концепцию, что макрофаги могут быть стимулировали или индуцированной поддержать регенерации аксона после травмы нервной системы. Наша модель будет также полезно в изучении механизмов в межклеточной сигнализации, что приводит к активации про восстановительной макрофагов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с участием животных были одобрены институциональные животное уход и использование Комитета из АДЖУ школы медицины университета.

1. Культура подготовка диссоциированных взрослых DRG нейрона

  1. Перед настройкой культуры, предварительно Покройте 6-ну пластины с поли D-лизин и Ламинин. Инкубируйте 6-ну плита с 0,01% поли D-лизин при 37° C на 2 ч или при температуре 4° C на ночь. Затем промойте пластины дважды с дистиллированной водой.
  2. Инкубировать пластины с Ламинин решения в концентрации 3 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем вымыть пластину дважды с дистиллированной водой. Сухие пластины при комнатной температуре по крайней мере за 1 час.
  3. Усыпить мышь в прозрачной CO2 камеры подключены к сжатого баллончика CO2 . Надрезать кожу вышележащих позвоночника с хирургическое лезвие и вскрыть паравертебральные мышцы на двусторонней основе подвергать позвоночной кости. Удаление позвоночных костей, тщательно с использованием УЗК накренилась хирургического rongeur до тех пор, пока полностью подвергаются ГДК.
    Примечание: Взрослый ДРГ нейронов получаются из взрослых C57BL6 мышей-самцов в возрасте 8 недель до 12 недель.
  4. Удалите ДРГ на двусторонней основе с S1 до уровня C1, используя ножницы иридэктомия и штраф наконечником щипцы под микроскопом рассечения. Попробуйте вырезать корни полностью от ГДК для того, чтобы свести к минимуму загрязнение Шванновские клетки или фибробластов.
  5. Храните расчлененных ДРГ в 60 мм Петри, содержащий 5 мл из холодной Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) на льду пока все собранные ГДК.
    Примечание: Очень важно как можно быстрее вскрыть ГДК. Коллекция всех КЗГ из одной мыши не следует занять больше чем 30 min. 30 мин после эвтаназии, остановить сбор ДРГ и переходите к следующему шагу, даже если все еще оставшиеся ГДК.
  6. Передать ДРГ 1,5 мл трубки Эппендорф, используя кончик синей пипетки (1000 мкл) с концом отключения. Удаление DMEM после быстрого спин на несколько секунд, с использованием Мини центрифуги. Добавьте 1 mL DMEM, содержащих 125 ед/мл тип XI коллагеназы и инкубировать трубки для 90 мин с нежным вращения (35-40 мин) с помощью шейкера Торнадо в инкубаторе 37 ° C. Иммобилизации трубку на этаже шейкер, с помощью ленты.
  7. Отменить коллагеназы содержащих DMEM и добавьте 1 mL свежих DMEM. Подождите, пока Плавающая ДРГ полностью опуститься на дно, а затем удалить DMEM с мусором ткани. Повторите этот шаг стирки по крайней мере шесть раз.
    Примечание: Не пытайтесь удалить супернатант полностью. Будьте осторожны, чтобы не удалить любой ДРГ с супернатанта DMEM.
  8. Передать ДРГ 15 мл Конические трубки, используя кончик синей пипетки (1000 мкл) с концом отключения. Затем аккуратно Пипетка вверх и вниз по крайней мере 15 раз используя кончик синей (1000 мкл) чтобы сделать суспензию однородных клеток. Избежать пузырей и старайтесь не касаться нижней конической трубки с кончиком пипетки.
  9. Центрифуга трубки на 239 x g 3 мин и тщательно удалить супернатант с плавающей мусора. Добавьте 1 mL Neurobasal среды, дополнена B27 (2,0% v/v) и Ресуспензируйте клетки Пелле, мягко закупорить вверх и вниз 5-10 раз.
  10. Передайте суспензию клеток через стрейнер ячейки 70 мкм, накладывается на верхней части 50 мл Конические трубки. Подождите 2 минуты, а затем налить среднего Neurobasal/B-27 на сито с помощью пипетки контроллера.
  11. Пластина все собранные DRG нейронов (в общей сложности приблизительно 2 x 106 DRG нейронов из одной мыши) на двух скважинах 6-ну пластины. DRG нейроны от одной взрослой мыши охватывают две скважины в пластине 6-хорошо. Затем поместите пластины в инкубатор CO2 при 37 ° C, до тех пор, пока макрофага совместно культур.

2. Сопредседатель культура P rimary перитонеальных макрофагов на культуры клеток вставить

Примечание: Установить совместно культур 4 h после первоначального покрытия диссоциированных нейронов DRG

  1. Основная перитонеальных макрофагов готовятся из взрослых C57BL6 мышей-самцов в возрасте 8 недель до 12 недель. Усыпить животных в камере CO2 . Деликатно надрезать кожу живота, разоблачить брюшины и Избегайте резки брюшины во избежание утечки жидкости промывания.
  2. Прокол брюшины, с помощью шприца с иглой 22G и залить 10 мл ледяной фосфат амортизированное Салин (PBS) в брюшной полости. Мягко массаж брюшины для 1-2 мин. Затем вытащить иглу и выдавить PBS через сайт прокола иглой и собирать жидкость лаважа в 50 мл Конические трубки.
    Примечание: Перед использованием, положил шприц на льду для поддержания холодность PBS.
  3. Центрифуга промывание жидкости в 239 x g 10 мин при 4 ° C для пеллет клеточных компонентов. Ресуспензируйте лепешка с 3 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) 3 мин при комнатной температуре. Затем центрифуга суспензию клеток снова на 239 x g 10 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте лепешка с 3 мл PBS и центрифуги суспензию клеток снова, чтобы удалить любые оставшиеся буфера lysis РБК.
    Примечание: Убедитесь, что РБК литического буфера удаляется полностью. В противном случае оставшиеся буфера lysis РБК могут быть токсичными для искусственного макрофаги.
  4. Ресуспензируйте гранулированных клеток в 1 мл Neurobasal/B-27 среды. Плита, половина всех собранных макрофагов (в общей сложности 3 × 106 -6 х 106 клеток) на культуре клеток вставить с эффективной площадью 4,2 см2, который находится на вершине хорошо диссоциированных DRG.
    Примечание: В период совместного культуры, макрофаги, выращенных в Neurobasal/B-27 нейрон питательной среды. Адекватные выживания макрофагов под это условие было подтверждено.

3. Лечение Db лагерь и сбор макрофагов см

Примечание: Начало лечения 4 h db лагерь после совместного культур нейрон макрофагов.

  1. Добавьте 2 мкл раствора 100 мкм db лагерь в нейрон макрофагального Сопредседатель культур. Добавьте такой же объем PBS для управления эксперимента.
  2. После 24 часов Заполните пустой колодец с 1 мл питательной среды макрофагов в пластину же 6-хорошо. Вставка культуры клеток в нейрон макрофагального Сопредседатель культур передать пустой колодец с макрофагов питательной среды. Держите клетки при том же условии за 72 ч без изменения среды.
    Примечание: Мы добавляем только 1 мл макрофагов питательной среды во время сбора см сделать сосредоточены см. Во время сбора см при необходимости, мы добавили больше, чтобы полностью покрыть макрофаги в insert.
  3. После 72 ч центрифуга макрофага см на 239 x g 5 мин для удаления клеточных компонентов. Супернатант проходят через 0,2 мкм фильтр, чтобы удалить любые оставшиеся сотовой мусора. Храните собранные см-70 ° c до использования.

4. Neurite нарост Assay с собранных см

  1. Прежде чем настраивать отдельный взрослый DRG нейрон культуры, предварительно покройте слайд 8-Ну палата следуя той же процедуре, описанной в 1.1 и 1.2.
  2. Получения диссоциированных взрослых DRG нейронов в Neurobasal среде с B27 используя те же методы, описанные от 1,3 до 1,10. Клемная 5 x 104 клетки на хорошо на предварительно покрытых камеры 8-Ну слайд.
  3. Место в камере слайд инкубатора 37 ° C 2 h, позволяя клетки, чтобы прикрепить к нижней. Затем замените питательной среды с талой см, который подогревается в 37 ° C.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не прикасайтесь к нижней части камеры 8-Ну слайд при удалении питательной среды и добавление собранных см.
  4. 15 ч после первоначального покрытия, удалите среды и вымыть клетки с PBS раз. Затем добавьте 200 мкл раствора ледяной параформальдегида 4% к скважинам и инкубировать клетки с параформальдегида решение для 20 минут при температуре 4 ° C
    Примечание: DRG нейрон культуры для neurite нарост assay должна ограничиваться именно 15 h. При этом условии существует без заметных neurite нарост.
  5. Вымойте три раза с ледяной PBS и затем выполнить блокирование с 10% нормальной козьего сыворотки (НГС) с 0.1% тритон-X на 30 мин инкубировать фиксированные ячейки с основного антитела (анти Tuj-1) раствор, разбавленный с 10% NGS (в концентрации 1 мкг/мл) за 4 ч в номер температуре или на ночь при 4 ° C.
  6. Вымойте три раза с PBS и затем инкубации клеток с вторичное антитело (коза анти мышь) решение для 2 ч при комнатной температуре. Затем мыть дважды с PBS и смонтировать культуры слайд с coverslip (24 × 50 мм) с помощью установки решения.
  7. Возьмите изображения с помощью микроскопа флуоресценции для визуализации neurite нарост.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы описываем протокол, который может генерировать Макрофаги способны секреции молекулярные факторы с neurite результатом деятельности. Макрофага см, полученные из совместного культур, относились с db лагерь в результате нарост надежные neurite при применении к отдельной культуре нейрон DRG (рисунок 2A). В сравнении см, полученные от PBS-лечение Сопредседатель культур не вызывает neurite нарост в нашей культуре 15-h продолжительности (рис....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует несколько важных шагов для создания этой системы совместного культуры. Это важно обеспечить что мыши DRG нейронов и перитонеальные макрофаги готовятся свежие и здоровые. Мы испытали снижение neurite активности нарост см, когда вскрытие всех ДРГ приняла более 30 мин. Кроме того загрязнения компонентов крови в перитонеальные макрофаги также привело к снижению активности нарост neurite см. Для того, чтобы заручиться надежной нейрон макрофагального взаимодействия db-лагерь, тщательного мытья также будет важным шаг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот протокол поддерживается грантом СР 2015R1A2A1A01003410 из министерства науки, ИКТ и будущего планирования, Республика Корея.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вставка для клеточных культур прозрачная ПЭТ мембрана 0,4&мкм; m размер порCorning,Falcon353090Прозрачная ПЭТ-мембрана с 0,4-μ m размер пор, для 6-луночного планшета
70-μ m нейлоновый клеточный фильтрCorning, Falcon352350
8-луночный культуральный слайдBiocoat354632с равномерным нанесением Poly-D-лизина
Буфер для лизиса эритроцитовQiagen158904
Коллагеназы из Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9407-100MG
Нейробазальная средаThermo Fisher Scientific, Gibco21103-049Содержит 1% глутамакса и 1% пенициллин-стрептомицина
добавку B-27, без сывороткиThermo Fisher Scientific, Gibco17504-044внеклеточный раствор
ГлутамаксThermo Fisher Scientific, Gibco35050-061
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific, Gibco15140-122
Поли-D-лизин ГидробромидSigma-AldrichP6407-5MG
ЛамининThermo Fisher Scientific, Invitrogen23017-015
Аденозин 3', 5'-циклический монофосфат, N6,O2'-дибутирил-, натриевая сольMerck Millipore Corporation, Calbiochem28745
10% Нормальная козья сывороткаThermo Fisher Scientific16210072
Triton-X-100Daejung Chemical and Metal Co8566-4405
Anti & beta; III тубулин (Tuj-1)Promega CorporationG7121Мышиное моноклональное антитело
Козье антимышиное IgG (H+L) вторичное антителоThermo Fisher Scientific, InvitrogenA11005
ГемацитометрMarienfeld-SuperiorN/A
Клеточная культура CO2 инкубаторPanasonicN/A
Препарирующий стереомикроскопCarl ZeissStemi DV4
Шейкер TwistFINEPCRTw3t
Настольная центрифугаSorvallN/A Конфокальный
микроскопOlympus America IncIX71
FBS (фетальная бычья сыворотка)VWR International, HycloneSH30919.03
Friedman Pearson RongeursFST (Fine Science Tools)16021-14Нержавеющая сталь, 14 см, изогнутые, односуставные
ножницы тонкого действия - карбид вольфрама и ToughCutFST (Инструменты для науки)14558-11острый, зубчатый
щипцы Dumont #7 FST(Инструменты для науки)11272-30Думоксель, 0,07 x 0,04 мм, изогнутые
пружинные ножницы VannasFST (Инструменты для тонкой науки)15000-00прямой, 3 мм режущий, острый
Qualitron DW-41 МикроцентрифугаArtisan Technology GroupDW-41Входное напряжение: 115 В переменного тока

Ссылки

  1. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  2. Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
  3. Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
  4. Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
  5. DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
  6. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
  7. Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
  8. Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
  9. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  10. Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
  11. Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
  12. Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
  13. Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
  14. Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
  15. Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
  16. Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
  17. Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
  18. Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Кокультивирование нейронов и макрофаговактивация макрофаговизоляция нейронов спинномозговых ганглиевполучение перитонеальных макрофаговобработка циклическим АМФсбор кондиционированной средыфлуоресцентная микроскопиявставка для клеточных культурпрорегенеративный фенотип
Нейрон макрофагального Сопредседатель культур для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с Neurite результатом деятельности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.