Методическая статья

Доклинические мыши модель остеосаркома определить внеклеточного везикул опосредованной коммуникации между опухоли и мезенхимальных стволовых клеток

DOI:

10.3791/56932

⸱

6 мая 2018 г.

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прямого впрыска рака производные внеклеточного везикулы (EVs) приводит к перепрограммирования костного поддержки прогрессии опухоли; Однако какие клетки посредником этот эффект является неясным. Здесь мы опишем пошаговое протокол расследовать EV-опосредованной опухоли мезенхимальных стволовых клеток (МСК) взаимодействия в естественных условиях, раскрывая решающую роль для EV-образованных MSCs метастаз в.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В рамках микроокружения опухоли резидент или набранных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способствовать злокачественные прогрессии в нескольких типов рака. Под влиянием конкретных экологических сигналов эти стволовые клетки могут выпустить паракринными посредников ведет к ускоренному опухолевого роста и метастазирования. Определение перекрестных помех между опухолью и MSCs имеет первостепенное значение, чтобы понять механизмы, лежащие в основе прогрессии рака и определить новые цели для терапевтического вмешательства.

Раковые клетки производят большое количество внеклеточного везикулы (EVs), которые может глубоко повлиять на поведение клеток-мишеней в микроокружения опухоли или на удаленных объектах. Опухоль EVs заключите функциональных биомолекул, включая воспалительных молекул РНК и белков (онко), которые могут обучать стромальные клетки для повышения метастатического поведение раковых клеток или участвовать в формировании предварительно метастатического нишу. В этой статье мы опишем разработки модели мыши доклинических рака, которая позволяет конкретной оценки EV-опосредованной перекрестных помех между опухолью и мезенхимальных стволовых клеток. Во-первых мы описываем, очистки и характеристика опухоли выделяется EVs и оценки EV интернализации поддерживается MSCs. Мы затем сделать использования мультиплексной иммуноферментного анализа на основе бисера для оценки изменения профиля выражение cytokine MSC вызванных раком EVs. Наконец мы иллюстрируют поколения модели мыши ксенотрансплантата биолюминесцентных ортотопическая остеосаркома, резюмирует опухоль MSC взаимодействия и показать вклад EV-образованных MSCs для формирования роста и метастазирования опухоли.

Наша модель предоставляет возможность определить, как рак EVs сформировать опухоль поддержка окружающей среды и оценить ли блокады EV-опосредованной коммуникации между опухолью и MSCs предотвращает прогрессирование рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроокружения опухоли активно участвует в большинстве, если не все, аспекты опухолей и рака прогрессии, в том числе метастаз формирование и развитие резистентности к терапии1. Это подчеркивает необходимость доклинические ортотопическая рака мыши модели, которые позволяют рассечение взаимодействия сложных опухоли стромы, происходящих в нише опухоли.

Среди многих клеточных компонентов микроокружения опухоли мезенхимальных стволовых клеток (МСК) сильно способствуют прогрессии рака в нескольких типов рака, таких как рак молочной железы, рак простаты, опухоли мозга, множественной миеломы и остеосаркома2 ,3,4,5,6,7. MSCs, Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые находятся в различных тканях взрослого и плода, включая костный мозг, жировой ткани, плаценты, пуповинной крови и другие8,9. В ответ на воспалительные сигналы, генерируемые рака MSCs миграции к местам опухоль, включить в микроокружения опухоли и в конечном дифференцируются в поддержку рак клеток10. Эти рака связанные MSCs обеспечивают существенные факторы (например, факторы роста, chemokines, цитокинов и иммуносупрессивные посредников) для прогрессии опухоли, действуя как на опухолевые клетки, так и на окружающих стромы2, 3 , 11 , 12 , 13. Хотя опухоль повышая влияния связанных рака MSCs исследованы в многочисленных рака моделей, механизмов, которыми опухолевых клеток перепрограммировать MSCs сформировать рак содействия нишу плохо понимают. Здесь мы описываем поколения модели ксенотрансплантата ортотопическая, которая конкретно позволяет исследование про онкогенной взаимодействия между кости раковые клетки и MSCs через внеклеточного везикулы (EVs).

EVs это решающее посредники межклеточные связи между опухолью и стромальных клеток14. EVs нести функциональные биомолекул ячейки происхождения, включая белки, липиды и регулирования РНК. Попав в внеклеточного пространства, эти пузырьки могут приниматься окружающие клетки или в отдаленные участки через кровь или лимфатическую циркуляцию и может глубоко повлиять на поведение целевой ячейки. 15 , 16 , 17 например, поглощение рака EVs фибробласты стромы может привести к Миофибробласт дифференциации поддержки ангиогенеза и ускорения опухолевого роста в vivo18,19, интернализации, эндотелиальных клетки могут стимулировать ангиогенез опухоли и повышение сосудистой проницаемости16,20, и взаимодействие с клетки иммунной системы может привести к подавлению противоопухолевый иммунный ответ21.

Мы недавно отмечали, используя модель мыши ксенотрансплантата биолюминесцентных ортотопическая остеосаркома, что опухолевые клетки освободить большое количество EVs, запрашивающие MSCs приобрести онкогенной pro и pro метастатическим фенотип. Этот эффект обусловлен драматические изменения в профиле выражение cytokine MSC (упоминаемые как «MSC образование») и могут быть предотвращены путем отправления антитела терапевтических рецептор интерлейкина-6 (IL-6R)7. Наша работа показали, что рак EVs решающую модуляторы MSC поведения, обеспечивая тем самым обоснование микроокружения ориентированных подходов к прекращению прогрессии остеосаркома. Здесь мы опишем пошаговое протокол расследовать EV-опосредованной опухоли MSC взаимодействия в естественных условиях. Эта модель предназначена для: 1) конкретно определить EV-индуцированных изменений рака MSC поведения микроокружения опухоли, 2) оценить, как это взаимодействие способствует рост опухоли костей и образование метастазов и 3) исследования ли вмешиваться EV-опосредованной перекрестных помех в vivo предотвращает прогрессирование рака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жировых тканях человека для изоляции мезенхимальных стволовых клеток были получены от Департамента пластической хирургии госпиталя Tergooi (Хилверсюм, Нидерланды) после утверждения институциональной этическим Комитетом и письменного информированного согласия. Жировой MSCs GFP-позитивные были получены от департамента медицинских и хирургических наук для детей и взрослых (Университет Модены и Реджо-Эмилия).

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с законодательством Нидерландов о экспериментов на животных, и протокол был утвержден Комитетом по экспериментов на животных медицинского центра университета VU, Амстердам, Нидерланды.

1. изоляция опухоль выделяется внеклеточного везикулы.

  1. Подготовить EV-истощены плода Bovine сыворотки (FBS) центрифугированием FBS в 70000 x g на ночь (16 часов), не тормоз, на 4 ° C, с использованием ультра-качающиеся ведро ротора (ожидать 1 ч для замедления). Тщательно Соберите супернатант (EV-истощены FBS) не нарушая гранулы. Фильтр с 0,22 мкм фильтром FBS EV-истощены.
  2. Подготовить EV-истощены питательной среды, дополняя Iscove на изменение Дульбекко среднего (IMDM) с 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, глютамин 2 мм (1 x P/S/G) и 5% EV-истощены FBS.
  3. Семян 3 х 106 143B клеток в колбах2 175 см и их культуры в EV-истощены культурной среде в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2. Когда клетки 80-90% притока (обычно после 36 часов до 48 ч), соберите супернатант от 8 x 175 см2 фляги (28 мл/колба) для EV-изоляции.
  4. Предварительно снимите супернатант ячейки для удаления клеток и клеток мусора, дифференциального центрифугирования (центрифугирования супернатант предыдущий спин каждый раз) согласно следующий протокол:
    1. Центрифуга супернатант дважды на 500 g x 10 мин.
    2. Центрифуга супернатант дважды на 2000 g x 15 мин.
    3. Центрифуга супернатант дважды на 10000 x г за 30 мин.
    4. Выполните все centrifugations на 4 ° C с максимальное ускорение и замедление скорости. После каждого шага тщательно Соберите EV-содержащих супернатанта, оставив около 1 мл. Переходите сразу к шагу 1.5 или хранилище предварительно отобранных кондиционером средне-80 ° c до EV изоляции.
  5. Изолировать EVs центрифугированием предварительно отобранных кондиционером среднего раз в 70000 x g за 1 ч, медленно тормоз, на 4 ° C в ультра-пробирок (конечный объем 38,5/мл) с использованием ультра-качающиеся ведро ротора.
  6. Тщательно удалить супернатант, оставив около 1 мл позади, Ресуспензируйте EV-содержащие гранул в остальные тома, объединить их все в одной трубке ультрацентрифугирования и добавить фосфат амортизированное saline (PBS) до полной трубка наполнения (конечный объем 38,5 мл).
  7. Центрифуга еще раз на 70000 x g за 1 час при температуре 4 ° C, без тормоза (ожидать 1 ч для замедления). Тщательно удалить супернатант не нарушая гранулы и оставить 100-200 мкл.
  8. Ресуспензируйте EV-гранулы и окончательного громкость до 200 мкл с PBS (стандартизованы для всех EV-изоляции). Используйте EV подготовки сразу или хранить при температуре-80 ° C до использования22.
    Примечание: EVs могут храниться до 6 месяцев при температуре-80 ° C.

2. EV характеристика.

Очищенный EVs могут быть визуализированы путем передачи электронной микроскопии (ТЕА)23.

  1. Готовые смеси EV с равным объемом параформальдегида 4% в фосфатного буфера.
  2. Слой 200 сетка Formvar углерод покрытием никелем ТЕА сетки с 5 мкл суспензии EV для 20 мин при комнатной температуре.
  3. Фиксировать образцы EV на ТЕА сетки с 1% глютаральдегид в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0), контраст с уранила оксалат (рН 7,0) и внедрить в смесь 4% уранила ацетат и 2% метил целлюлозы в соотношении 1:9 на льду.
  4. Удаление сетки с петли из нержавеющей стали и Помарки избыток жидкости с фильтровальной бумаги для обеспечения соответствующей толщины пленки метил целлюлозы.
  5. После высыхания, изучить сетки с просвечивающий электронный микроскоп и захвата изображения с цифровой камеры, в сочетании с соответствующего образа программного обеспечения.

3. образование MSCs, опухоль производные EVs.

  1. Подготовьте MSC питательной среды, дополняющего альфа минимум основных средних (альфа MEM) с 4% EV-истощены человека Lysate тромбоцитов (hPL)24, гепарин (10 ед/мл) и 1 x P/S/G.
    Примечание: EV-истощены hPL получается после процедуры, описанной в разделе 1.1.
  2. Семя 1.4 x 106 жировой производные MSCs за флакон2 75 см и культура их в среде EV-истощены MSC-культура в инкубаторе при 37 ° C и 5% СО2.
  3. Когда клетки достигают 70% слияния, добавить 143B остеосаркомы - или контроль фибробластов (hf)-EVs, 10 мкл EV подготовки/см2 культуры колбы. Инкубировать в течение 24 часов и добавить такое же количество EVs для дополнительных 6 часов. Примечание: Фибробластов культивируемых в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) 10% FBS и EVs изолированы, как описано в разделе 1.
  4. Собирать MSC супернатанта, центрифуга 1 x 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C (с максимальное ускорение и замедление скорости), передача новой трубки и хранить очищенные супернатант в-80 ° C для включения анализа будущих цитокинов (раздел 5).
  5. В естественных условиях экспериментов (раздел 6), воспитывать GFP-позитивных МСК25 , как описано в разделах 3.1 – 3.3, собирать клетки и Ресуспензируйте их в PBS в конечной концентрации 106 клеток / 100 мкл. Держите клетки на льду до инъекции.

4. EV интернализации Assay.

Чтобы визуализировать EV поглощение MSCs, этикетка EVs с компоновщик зеленый люминесцентной краской (GFLD) (коммерчески доступных) после производителя протокол:

  1. Вкратце добавьте 180 мкл растворителя prep EV 200 мкл. Разбавьте 1 мкл GFLD красителя в 50 мкл растворителя и добавить 20 мкл разбавленного красителя в разреженных prep EV.
  2. Аккуратно перемешать, закупорить и Инкубируйте 3 мин при комнатной температуре в темноте.
  3. Добавьте 5 мл 0,1% BSA в PBS, передача ультра-пробирок и заполнить трубу с PBS (конечный объем 38,5/мл).
  4. Центрифуга 1 x на 70000 x g за 1 час при температуре 4 ° C, без тормоза (ожидать 1 ч для замедления). Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте помечены EV-Пелле в окончательном объеме 200 мкл (регулировка громкости с PBS).
  5. Добавьте обозначенные EVs MSC культуры или хранить их в-80 ° C. После ночи инкубации оценить везикул интернализации микроскопии флуоресцирования и потока цитометрии7.

5. Оценка MSC цитокинового профиля выражение.

  1. Мультиплекс количественного определения интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерлейкина 1β (IL-1β), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкин-10 (IL-10), фактор некроза опухоли (ФНО) и интерлейкина - 12p 70 (IL - 12p 70) уровни белка в MSC кондиционером среднего (см. шаг 3.4), используйте коммерчески доступные гранулярных бисера массив (ЦБА) для человека воспалительных цитокинов следуя инструкциям производителя.
  2. Кратко смешать конъюгированных антител захвата бусины и добавить их все пробирного трубы. Добавьте стандартные разведений цитокинов или кондиционером средних образцов труб.
  3. Добавьте обнаружения реагента и Инкубируйте 3 часа на RT.
  4. Вымойте бусины с предоставленным моющий раствор. Измерения с помощью проточный цитометр образцы и анализировать данные в соответствии с инструкциями производителя.

6. поколение модели мыши ортотопическая гранулы ксенотрансплантата остеосаркома.

  1. Разрешить 6 week-old, женщина, Athymic ню-Foxn1nu мышей, чтобы акклиматизироваться на по крайней мере за одну неделю до начала экспериментальной процедуры.
  2. Один день до хирургической процедуры и как периоперационную анальгезии добавить парацетамол в питьевой воде. Разбавить «парацетамол раствор для детей» (см. Таблицу материалы) с водой, чтобы получить окончательный концентрация 2 мг/мл. Основываясь на среднем водозабора 150 мл/кг/день, и средний вес тела 20 g, эта доза достаточно, чтобы достичь дозе 6 мг/мыши/день (300 мг/кг/день).
  3. Продолжить болеутоляющее лечение до 24 часов после операции, или дольше, если животных показывают признаки боли.
  4. В день хирургической процедуры собирать культивировали Люцифераза положительных клеток 143B (флуктуации) (ранее созданный лентивирусные трансдукция) центрифугированием при 300 g x 10 мин и Ресуспензируйте клетки в концентрации 2 x 105 клеток/мкл в PBS. Храните суспензию клеток на льду до 6 часов.
  5. Автоклав хирургическое оборудование. Подготовить и очистить рабочую область и место стерилизованные ножницы и щипчики на стерильную листах. 20 мин до хирургической процедуры (шаг 6.8), придать животным подкожно с бупренорфин (0,05 мг/кг, разводят в 0,9% физиологического раствора) как болеутоляющее, используя 0,5 мл-шприцы (29-иглы).
  6. Как раз перед обезболивающим каждого животного, заполните шприц 10 мкл с по крайней мере 1 мкл концентрированного суспензию клеток (флуктуации) 143B (см. шаг 6.4).
  7. Анестезировать животное с изофлюрановая ингаляционной анестезии (2-3% кислорода). Проверьте уровень анестезии на мыс ущемление животного. Когда животное не реагирует щипать, т.е., что он глубоко под наркозом, нанесите мазь на глаза, чтобы избежать сухости во время анестезии.
  8. Поместите животное на спине с головой в маске анестезии и с ноги в сторону оператора. Flex левого колена. Протрите кожу с 70% этанола и применять лидокаина (2%) с наконечником хлопок 3 раза как местным обезболивающим.
  9. Используйте стерильные хирургические нож, чтобы сделать небольшой надрез (около 5 мм) на кожу чуть ниже колена подвергать голени. Просверлите отверстие в tibia, примерно 2 мм ниже колена с помощью микро сверло 0,8 мм. Будьте осторожны, чтобы не сверлить через обе голени коре.
  10. Inject 1 мкл суспензии клеток (приблизительно 2 x 105 клеток) медленно (в течение примерно 5 секунд) в отверстие с помощью 26-иглы. Закройте отверстие с капельку клея ткани для предотвращения обратного потока подвески.
  11. Закройте кожи с Мононить швы и одной капли клея ткани. Пусть животных восстановить в хорошо нагретом среде (использование тепла лампы). Не оставляйте животных без присмотра, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency. Только после того, как животные полностью оправился от наркоза, вернуть их в свои собственные клетки.
  12. Через два дня после прививки опухолевых, придать EV образование или наивно GFP-положительных MSCs (106 клеток в 100 мкл PBS, см. шаг 3.5) внутривенно с 0,5 мл шприц инсулина в хвост духе мышей.
  13. Следить за рост опухоли, биолюминесценцию изображений26 два раза в неделю. С этой целью придать и.п. мышей с 150 мкл D-Люциферин (30 мг/мл) с шприц инсулина. 10 мин после инъекции, поместите животных в биолюминесценции изображений системы и измерить поток фотонов, порожденных опухолевых клеток.
  14. Кроме того Измерьте диаметр первичной опухоли кости с суппортом. Ширина x длина2 x 0.5 оценивается объем опухоли (в3мм).
  15. Примечание: Гуманные конечные точки определяются как диаметр опухоли > 15 мм или потеря веса > 15%.

7. Оценка числа конкреций легких

  1. Когда один из животных достигает гуманного конечной точки, определенные в шаге 6.14 (в приблизительно 3-4 недели), прекратить эксперимент и собирать и анализировать все соответствующие ткани.
  2. 10 мин до euthanization, придать 150 мкл D-Люциферин (30 мг/мл) с 0,5 мл шприц инсулина.
  3. Анестезировать животных с изофлюрановая ингаляционной анестезии (см. шаг 6.7). Подтвердите глубины анестезии, отсутствие реакции мыши на мыс щипать. Усыпить мышей шейки матки дислокации27.
  4. Собирайте, легких, печени, селезенки и почек, с использованием стерилизованные ножницы и щипчики. Вымойте органы в PBS удалить следы крови и положил их на чашку Петри.
  5. Место на Петри блюдо с органами в биолюминесценции изображений системы. Измерения биолюминесценции сигнал на обе стороны органов. Сразу же после измерения, ввергнуть органов в формалин 4% для фиксировать их (24-72 часов, на RT) для будущих гистологический анализ.
  6. Процесс ручного Бинаризация полученные фотографии с соответствующим программным обеспечением обработки изображений. Подсчитать количество легких узелки на каждой картинке. Подсчитать общее количество легких конкреций по обе стороны легких.

8. гистологический анализ

  1. Для гистологического анализа легких тканей:
    1. Внедрить формалин Исправлена органов парафин и подготовить 6 мкм ткани слайды.
    2. Deparaffinate легочной ткани слайды и выполнять поиск антигена путем кипячения их за 15 мин в 0,01 М цитрат буфере (рН 6).
    3. Инкубируйте слайды по горизонтали при комнатной температуре с антинародным виментин антитела (200 мкг/мл) разводят 1: 150 в антитела растворителя (коммерчески доступных) и впоследствии среднего, ПХ обозначенного антитела (0.5 мг/мл, разведение 1: 500). Пятно тканей с 3'-диаминобензидин (DAB) и гематоксилином счетчика окрашивания.
    4. Соблюдайте окрашенных тканей слайды с помощью оптического микроскопа, в сочетании с соответствующей камеры и изображений программное обеспечение.
  2. Оценить наличие GFP-позитивных MSCs в tibias мыши:
    1. Известь tibias в Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 0,24 М, рН 7,2-7,4. Обновление буфера ЭДТА каждый день до кости становятся гибкими (примерно 1 неделя).
    2. Обезвоживанию tibias и проникновения их с парафином. Внедрите tibias (включая остеосаркома ткани) в парафиновых блоков.
    3. Приготовить микротом 6 мкм парафиновых срезах. Место разделы парафина на стеклянных вставках. После высыхания, храните слайды на ночь при комнатной температуре.
    4. Выполнения извлечения тепла опосредованной антигена с использованием буфера цитрата (см. 8.1.2) и пятно тканей с анти GFP антитела (весь антисыворотка) в 1:900 разрежения в антитела разбавителя. Counterstain ткани с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    5. Наблюдать за слайды ткани с флуоресцентным микроскопом в сочетании с соответствующей обработки изображений программное обеспечение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы исследовали способность выделяется остеосаркома EVs воспитывать MSCs к про онкогенной и про метастатическим фенотип. Мы покажем, что остеосаркома клетки релиз exosome как EVs, которые являются внутренним MSCs. Мы измерить изменения профиля выражение cytokine MSC, вызванных раком EVs и оценить влияние EV-образованных MSCs на рост опухоли и метастазов формирования. Общее представление дизайна исследования показано на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опухоль выделяется внеклеточного везикулы (EVs) могут изменить физиологии местного и дальнего мезенхимальных клеток сформировать опухоль благоприятных условий. Здесь мы описываем поколения доклинических мыши модель остеосаркома, что позволяет рассечение EV-опосредованного взаимодействия между опухолевых клеток и мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в естественных условиях. Мы покажем, что системных инъекции человеческого опухоли EV-образованных MSCs в мышей, принимая остеосаркома ксенотрасплантатов сильно спосо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Baglio с.р. была поддержана стипендии по Associazione Italiana за Ла Ricerca Сул Cancro (АКПО) финансируется Европейским союзом. Кроме того этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 программы исследований и инноваций под Марии Склодовской-Кюри грантовое соглашение не 660200 (в Baglio с.р.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Оборудование
Ультра центрифугаBeckmanOptima L-90K
Ротор SW32TiBeckman369650Упоминается в рукописи как ультра-качающийся ковшовый ротор
Пропускающий электронный микроскопZeissEM109или аналогичный
TEM Digital cameraNikonDMX 1200FИли аналогичная камера
Программное обеспечение для обработки изображений TEM NikonACT-1
Флуоресцентный микроскопZeissImager.D2Или аналогичный Флуоресцентный микроскоп
Программное обеспечение для визуализации FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
ЦентрифугаHettickROTANTA 460R-80
Морозильная камераThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScaliburили аналогичный проточный цитометр
СверлоFermFCT-300Со сверлом 0,8 мм
Микроспиральные сверла HSS, 0,8 ммProxxon28 852Сверло 0,8 мм
Камера IVISКсеногенIvis LuminaУпоминается в рукописи как биолюминесцентная камера. Xenogen теперь входит в
состав программного обеспечения для работы с изображениями Perkin Elmer Living2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen теперь входит в состав Perkin Elmer
10 µ L ШприцHamiltonNeuros Model 1701 RN
Игла: Hamilton RN Игла для шприца, 26 калибр, Pointstyle AS, нестандартная длина 2 смHamiltonn.a.Caliper
MitutoyoG08004463
автоклавAstelln.a.Heat
LampPhilipsn.a.
Culture media
Фетальная бычья сывороткаHycloneRYG35912
Тромбоцитарный лизатn.a.n.a.IMDM
mediumLonzaBE12-722F
alpha-MEM mediumLonzaBE02-002F
DMEM mediumLonzaBE12-614F
pen/strep/glutamineGIBCO10378-016
гепаринLEO012866-08
Трипсин/ЭДТА (10x)GIBCO15400-054
Cells
adipose deriverd MSCs
MSCsn.a.n.a.human
fibroblastsn.a.n.a.
143B клеткиATCCCRL-8303
FLUC-143B клеткиATCCCRL-8303Трансдуцированные
<сильно>Одноразовые
Культуральные колбы 175 см2CELLSTAR660175
50 мл ПробиркиGreiner bio-one210261
Freeze TubesThermoscientific377224
Ультрапрозрачные пробиркиБекмана344058упоминаются в рукописи как ультрацентрифужные пробирки
0,22 & микро; m фильтрMillexSLGV033RS
200 меш Формвар с углеродным покрытием никелевые сеткиEMS (Electron Microscopy Sciences)
0,5 мл инсулиновые шприцы с иглой 29GTerumoU-100 
Чашка ПетриSigma - AldrichP7612
Фильтровальная бумага Thermo fisher Scientific50363215
Reagents / наборы
параформальдегидAlfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
глутаральдегидEMS (Electron Microscopy Sciences)16300
уранилоксалатEMS (Электронная микроскопия) Sciences)22510
urany acetateEMS (Electron Microscopy Sciences)22400
метилцеллюлозаEMS (Electron Microscopy Sciences)1560
PKH67Sigmamini67-1ktУпоминается в рукописи как GFLD
BSASigmaA8412
CBA - набор для воспалительных цитокинов человекаBD551811
Формальдегид 37%VWR104003100
Углеродистая сталь хирургические лезвияSwann-Morton206Упоминается в рукописи как хирургический нож
против человеческого антитела к виментинуSanta Cruzsc-6260Клон V9
Антитело разбавительDAKOS0809
HRP-меченый антимышиный IgG антителаLife Technologies32230
DAB-kitDAKO K500711
гематоксиллиномSigmaGHS232
EDTA-буферn.a.n.a.Citrate
buffern.a.n.a.rabbit
поликлональные анти-GFP антителаAbcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
Парацетамол, 120 мг / 5 мл сиропBayern.a.Sinaspril, раствор парацетамола для детей
Isoflurane 1000 мг/гVumc аптекаn.a.buprenofine
hydrochloride, 0,3 мг/млIndivior UK Limited
2%Vumc аптекаn.a.70
% этанолVWR93003.1006
Клей для тканейDerma+Flex, разработанный медицинский цианоакрилатVygonLB604060
Глазные капли: Vidisec Carbogel, 2 мг/млBausch+Lombn.a.D-люциферин
, калийная сольGold BiotechnologyLUCK-1
Стеклянные стеклаThermo scientific630-0954
Петли из нержавеющей стали n.a.n.a.
Mice experiments
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,  самка, 6 недель на момент прибытия, бактериальный статус соответствует FELASAENVIGOn.a.Paper-pulp
умный дом (обогащение клетки)Bio Servicesn.a.Alpha-dri
материал для постельного бельяShepperd Speciality Papersn.a.
Корм для мышей: Teklad global 18% белка рацион для грызуновENVIGO2918-11416M
Шовные материалыEthiconV926H
НожницыSigma-AldrichS3146-1EA(или аналогичные)
ПинцетSigma-AldrichF4142-1EA(или аналогичные)
n.a.n.a.GFP-positive n.a.lidocaine-HCL

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи