Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56943

⸱

21 марта 2018 г.

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

В этой статье

Краткое содержание

Получение высококачественных геномной ДНК опухолевых тканей является важным первым шагом для анализа генетических изменений, с помощью следующего поколения последовательности. В этой статье мы представляем простой и быстрый способ обогатить опухолевых клеток и получить нетронутыми ДНК от прикосновения отпечаток цитологии образцов.

Аннотация

Важно, чтобы определить мутационного статуса в рак до администрации и лечения конкретных молекулярной целевых препаратов для больных раком. В клинических условиях, формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE) широко используются для генетического тестирования. Однако FFPE ДНК как правило повреждено и фрагментарный характер во время процесса фиксации с формалином. Таким образом FFPE ДНК иногда не достаточно для генетического тестирования из-за низкого качества и количества ДНК. Здесь мы представляем метод касания отпечаток цитологии (ИТК) для получения геномной ДНК от раковых клеток, которые можно наблюдать под микроскопом. Морфология и рак клеток числа клеток может оцениваться с помощью образцов TIC. Кроме того добыча геномной ДНК из TIC образцов может быть завершена в течение двух дней. Общее количество и качество TIC ДНК, полученные с помощью этого метода была выше, чем FFPE ДНК. Это быстрый и простой метод позволяет исследователям для получения высокого качества ДНК генетического тестирования (например, следующего поколения последовательности анализа, цифровой ПЦР и Количественная ПЦР в реальном времени) и сократить сроки для представления результатов.

Введение

Следующее поколение технологии виртуализации предоставил исследователи значительных достижений в анализе генома информации в генетических вариаций и Менделевское болезни, наследственная предрасположенность, рака 1,2,3 . Атлас генома рака (TCGA) и международного консорциума рака генома (ICGC) проводил выявление генетических изменений в нескольких типов общих рака4. Сотни основных Рак генов драйвера были успешно выявлены, и некоторые из этих молекул предназначены для наркотиков развития1,5,6.

В клинических условиях, образцы FFPE часто используются для диагностики патологических и молекулярных тестирования для различных заболеваний, включая рак. Однако во время процесса фиксации с формалином, ДНК белковых или ДНК-ДНК cross-linking возникает и фрагментацию ДНК индуцируется. Таким образом образцы ДНК FFPE не всегда подходит для генетического анализа из-за низкого качества и количества ДНК7,8,9. Кроме того она занимает несколько дней, чтобы подготовить FFPE образцы, и технические навыки необходимо подготовить точно в разделах. Таким образом желательно разработать простой и быстрый метод для получения высокого качества нетронутыми ДНК.

Цитология является альтернативный метод для диагностики патологии. Цитологические пробоподготовки является более простой, менее дорогим и более быстрый подход по сравнению с FFPE подготовка10. ТИЦ техника была выполнена на дозорных лимфатические узлы и маргинальных тканей от больных раком молочной железы для интраоперационного быстрой диагностики для11,несколько лет12. Однако есть несколько докладов, которые изучили ли высокое качество геномной ДНК могут быть извлечены из образцов ТИЦ и используется для последующего генетического анализа. Цитологические образцов обычно окрашивали Папаниколау (Пап) или окрашивание Гимза, и мы ранее сообщали, что количество и качество ДНК, извлеченные из образцов TIC (особенно пятнами Гимза образцы) превосходят образцы, полученные из FFPE 13тканей. По сравнению с Pap окрашивание, Гимзы окрашивание имеет преимущество в требующих менее окрашивание процедур. В Пап окрашивание, после того, как образцы были исправлены и витражи, они должны устанавливаться с монтажными среднего (например, Malinol) для разграничения содержимое образца, например клетки тумора, нормальные клетки и воспалительных клеток под микроскопом. Если ППА образец подготовлен без монтажа шаг, это почти невозможно наблюдать клетки под микроскопом, потому что высушенный образец. В сравнении Гимзы окрашивания можно наблюдать в состояние сушеных, поэтому монтаж шаг не является необходимым для быстрой сотовой оценки. Для microdissection Гимзы окрашивание является более подходящим, потому что он требует сухих образцов.

В настоящем докладе мы представляем простой и быстрый метод для подготовки TIC образцов с Гимза окрашивание и продемонстрировать, что ТИЦ является лучшим источником для ДНК, по сравнению с FFPE образцами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. TIC подготовка быстро микроскопических оценки с использованием обычных стекла слайды

  1. Выполните TIC подготовки как можно скорее после клинической патологической ткани материалы доступны. Если невозможно немедленно подготовить образцы TIC, держите ткани материалы, покрытые солевой раствор смачивают стерильную марлю и хранить в холодильнике для предотвращения высыхания тканей.
  2. Подготовьте 5 мм3 ткани материалы таких солидных опухолей (например, печени, легких и ткани груди) клинически полученные хирургии и эндоскопии.
    1. Аккуратно протрите ткани с покрытием с физиологического раствора стерильную марлю и удалить кровь, если поверхность ткани имеет много крови.
    2. Для микроскопических образцов, таких как биопсийного материала Держите образец, смоченным стерильной марли, пропитанной физиологического раствора.
  3. Вырезать и обрезать нормальной ткани с ножом обрезки и предоставлять на поверхности опухолевых поражений, если опухоль массы не видимы грубо.
  4. Коснитесь поверхности опухоли резецированный образцов на нормальное стекло слайд несколько раз в перчатках. Визуально убедитесь, что коснулся области составляет более 80% нормальное стеклянное скольжение.
  5. Слегка нажмите на нормальное стекло слайд против полиэтилен naphthalate (PEN) мембраны слайд и мягко руб 2 - 3 раза в перчатках. Визуально убедитесь, что клетки передаются от обычных стекла слайд слайд мембраны пера.
  6. Просушите стекла и перо мембраны слайды 5 мин при комнатной температуре.
  7. Пятно нормальное стеклянное скольжение для прямого цитологического исследования. Окуните стеклянных скольжениях фиксирующие раствором для 5 s, а затем пятно с Гимзы, окрашивание раствора для 15 s.
  8. Оценить и экран содержимое опухоли и клеточности на слайде нормальное стекло полностью с помощью микроскопа для быстрой оценки. Оценивать опухолевых клеток, основываясь на нескольких критериях; ядерные расширения, Аномальный кариотип, обильные хроматина, неравное распределение клеток, соотношение ядерного компонента/цитоплазматических компонента, размер ячейки и ячейки полярности.

2. Подготовка слайд фильма перо мембраны для генетического тестирования

  1. Если в примере клеточности опухоли более 60% быстрый микроскопических оценки (шаг 1.8), вырезать опухоль коснулся фильм перо мембраны слайды для экстракции ДНК с ножом и перчатках руки. Передать отрезока фильм стерильных microcentrifuge трубка с pincette и перчатках.
  2. Если опухоль клеточности определяется как низкий (менее 60% содержания опухоли) быстро микроскопических оценки (шаг 1.8), использование лазерной захватить microdissection и получить образцы опухоли.
    1. Выполняют Гимзы, окрашивание оценить опухолевых клеток с помощью стандартных протоколов.
    2. Вырежьте фильм слайд соответствующий лазерный захвата microdissection PEM мембраны.
    3. Передать отрезока фильм стерильных microcentrifuge трубка с pincette и перчатках.
    4. Храните пленкосодержащие пробки microcentrifuge на 4 ° C до экстракции ДНК (протокол может быть приостановлена здесь).

3. ДНК добыча

  1. Выполнения извлечения ДНК из ТИЦ или FFPE образцов тканей, с использованием комплекта экстракции ДНК FFPE согласно инструкциям производителя с незначительными изменениями. Эквивалент комплект доступен для извлечения шаг FFPE ДНК.
  2. 180 мкл буфера lysis ткани (рН = 8,3) фильм содержащих microcentrifuge пробирку с ручной 200 мкл пипетки. 20 мкл протеиназы K с ручной 20 мкл пипетки и микс на vortexing с вихревой смеситель на максимальной скорости (примерно 2500 об/мин) для 5 s.
  3. Проинкубируйте образцы на 56 ° C ночь с воздуха инкубатора.
  4. Проинкубируйте образцы FFPE и ТИЦ на 90 ° C в блоке тепла за 1 час и 10 минут, соответственно. Кратко вращаться вниз пробки microcentrifuge на 1500 g x 5 s при комнатной температуре с мини центрифуги.
  5. Добавить 200 мкл буфера lysis образца с 200 мкл пипетки и перемешать тщательно, vortexing на максимальной скорости, для 5 s.
  6. Добавить 200 мкл этанола (96-100%) с 200 мкл пипетки и тщательно перемешать, vortexing на максимальной скорости, для 5 s. кратко спин вниз пробки microcentrifuge на 1500 g x 5 s при комнатной температуре с мини центрифуга.
  7. Тщательно передать весь lysate столбце спин с 1000 мкл пипетки и центрифуги на 6000 x g 1 мин при 25 ° C.
  8. Разместите спин столбца в коллекции чистый 2-мл пробирку в перчатках и отбросить коллекции трубка, содержащая потока через в коробку пластиковых утилизации.
  9. Добавить 500 мкл буфера мытья в столбце спин с 1000 мкл пипетки и центрифуги на 6000 x g 1 мин при 25 ° C.
  10. Разместите спин столбца в коллекции чистый 2-мл пробирку в перчатках и отбросить коллекции трубка, содержащая потока через в коробку пластиковых утилизации.
  11. Добавить 500 мкл буфера мытья в столбце спин с 1000 мкл пипетки и центрифуги на 6000 x g 1 мин при 25 ° C.
  12. Удалить коллекцию трубка, содержащая потока через в коробку пластиковых утилизации. Столбце спина в чистой 1,5 мл microcentrifuge трубку в перчатках и центрифуги на 20000 x g 3 мин при 25 ° C для просушки мембраны.
  13. Место столбце спина в трубу связывания ДНК Лоу в перчатках.
    1. Добавьте 40-50 мкл буфера в центре мембраны с 100 мкл пипетки.
    2. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифуги на 20000 x g 1 мин при 25 ° C.
    3. Храните образцы ДНК при-20 ° C до следующего шага (протокол может быть приостановлена здесь).

4. Оценка качества ДНК путем количественной ПЦР в реальном времени

  1. Подготовить основной микс в стерильных microcentrifuge трубка с пипеткой, следующим образом: 10 мкл 2 x режиме реального времени PCR Мастер микс, 1 мкл 20 x РНКазы P праймер-зонд Mix (ампликон размер: 87 bp) и 8 мкл стерильной воды, свободной от нуклеиназы.
  2. Подготовить второй мастер смеси в одной трубке стерильные microcentrifuge следующим образом: 10 мкл 2 x режиме реального времени PCR Мастер микс, 1 мкл 20 x РНКазы P праймер-зонд Mix (ампликонами размер: 268 bp) и 8 мкл стерильной воды, свободной от нуклеиназы.
  3. Выполните серийных разведений геномной ДНК человеческого контроля (поставляется в комплекте) 4 раза для пяти пунктов калибровочной кривой и определения абсолютной концентрации ДНК13.
  4. Мкл 19 двух подготовленных мастер смесей (подготовленных на шаге 4.1 и 4.2) в отдельной скважины оптических 96-луночных реакции пластины с 20 мкл пипетки.
  5. 1 мкл FFPE ДНК или TIC ДНК для отдельных скважин, содержащие смесь реакции с пипетки 2 мкл. 1 мкл нуклеиназы свободной воды, в отдельную скважину, содержащие смесь реакции не шаблон элемента управления.
  6. Держите стороне не клей оптической клейкой пленки и отогните защитный бэк от центра фильма. Аккуратно перетащите аппликатор над фильмом и печать фильм над 96-луночных пластины.
  7. Аккуратно перемешать 96-луночных пластину с помощью пластины 96-луночных смеситель для 10 s при комнатной температуре при 2000 об/мин. Центрифуга пластину кратко на 1000 g x 3 мин при комнатной температуре.
  8. Мощность на реальном времени PCR документа и вставьте пластину 96-луночных. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 95 ° C 20 s, а затем 45 циклов 95 ° c для 1 s и 60 ° C для 20 s. Использование «стандартной кривой» и «быстрый режим».
  9. Оценить фрагментацию ДНК с соотношением ДНК (относительная количественной оценки; RQ) получены для долгого ампликон (268 bp) для коротких ампликон (87 bp). RQ-это среднее значение долго ампликон / среднее значение короткий ампликон13.

5. подготовка следующего поколения последовательности библиотеки

  1. Подготовьте библиотеку последовательности для следующего поколения последовательности согласно инструкциям производителя.
  2. Приготовляют следующим образом мультиплексной ПЦР мастер смесь в стерильных microcentrifuge трубку на сэмпл: 4 мкл 5 x мультиплексной ПЦР реакции раствора, 4 мкл 5 x грунтовка бассейн, ≤6 мкл ТИЦ или FFPE ДНК (1-100 нг) и добавить нуклеиназы свободной воды до 20 мкл.
    1. Добавьте мультиплексной ПЦР мастер смесь ПЦР-пробирку и смешайте нежно путем касания трубку.
    2. Кратко вращаться вниз пробки microcentrifuge на 1500 g x 5 s при комнатной температуре с мини центрифуги.
  3. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 99 ° C в течение 2 мин, после чего 20 циклов 99 ° C 15 s и 60 ° C для 4 мин и проведение шаг 10 ° C. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
    Примечание: Определите количество циклов, основанный на количество пар грунт.
  4. Откройте крышку ПЦР-пробирку и 2 мкл энзима ограничения с пипетки 2 мкл. Аккуратно закройте крышку ПЦР-пробирку и перемешать путем выстукивать ПЦР-пробирку. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
  5. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 50 ° C за 10 мин, 55 ° C за 10 мин, 60 ° C в течение 20 минут, и проведение шаг 10 ° C. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
  6. Добавить адаптер лигирование мастер смесь в каждой хорошо содержащие переваривается ампликонов ПЦР с пипеткой следующим: 4 мкл раствора перешнуровка переходник, 0.5 мкл штрих, 0.5 мкл адаптер, 2 мкл нуклеиназы свободной воды и 2 мкл ДНК лигаза. Аккуратно закройте крышку ПЦР-пробирку и перемешать путем выстукивать. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
  7. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 22 ° C в течение 30 мин, 68 ° C за 5 мин., 72 ° C за 5 мин, и проведение шаг 10 ° C.
  8. Очищайте библиотеки виртуализации с магнитной бусины согласно инструкциям производителя.
  9. Перевод адаптер лигируют библиотека решение на низкий связывания ДНК 1,5-мл. Мкл 45 магнитных шариков в ДНК низкой привязки трубку для очистки 1st . Осторожно перемешать путем касания трубку и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  10. Поместите трубки связывания ДНК Лоу в магнитной стойке, а затем проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Тщательно отбросить супернатант с 200 мкл пипетки не нарушая магнитные бусы.
  11. 150 мкл свежеприготовленные 70% этанола с пипеткой 200 мкл, затем переместите трубку--бокового магнита мыть бисер. Тщательно удалить супернатант не нарушая магнитные бусы.
  12. Повторите шаг 5.11 для второй мыть.
  13. Кратко вращаться вниз по трубе с мини-центрифуга для 5 на 1500 x g s при комнатной температуре. ДНК низкой привязка трубки в магнитной стойке и тщательно отмены этанола капельки с 10-мкл пипетки.
  14. 50 мкл низкой TE в трубу низким привязки ДНК, магнитные бусы Пелле разойтись бусы содержащих. Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
  15. ДНК низкой привязка трубки в магнитные стойки и инкубации при комнатной температуре на 2 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
  16. Передача 50 мкл супернатант в новой трубки низкого привязки ДНК и 75 мкл магнитной бусины с 100 мкл пипетки для очистки 2nd . Осторожно перемешать путем касания трубку и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  17. Поместите трубки низкого привязки ДНК в магнитной стойке, а затем проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Тщательно отбросить супернатант с 200 мкл пипетки не нарушая магнитные бусы.
  18. 150 мкл свежеприготовленные 70% этанола с пипеткой 200 мкл, затем переместите трубку--бокового магнита мыть бисер. Тщательно удалить супернатант не нарушая магнитные бусы.
  19. Повторите шаг 5.18 для второй мыть.
  20. Кратко вращаться вниз по трубе с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре. ДНК низкой привязка трубки в магнитной стойке и тщательно отмены этанола капельки с 10-мкл пипетки.
  21. 50 мкл низкой TE, в пробирку низким привязки ДНК, магнитные бусы Пелле разойтись бусы содержащих. Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
  22. ДНК низкой привязка трубки в магнитные стойки и инкубации при комнатной температуре на 2 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
  23. Перевести 45 мкл супернатанта, содержащих чистые библиотеки в новой низким привязки трубку ДНК с пипетки 100 мкл.

6. количественную оценку концентрации библиотеки по количественной ПЦР в реальном времени

  1. Определите концентрацию каждой библиотеки согласно инструкции производителя13.
    1. Приготовляют раствор кратной разрежения следующим: смешать 2 мкл очищенный библиотеки и 38 мкл нуклеиназы свободной воды в трубке низким связывания ДНК с 2-мкл и 100 мкл пипетки.
    2. Храните неразбавленном библиотек при-20 ° C до шага 7.3.
  2. Приготовляют раствор 200-fold разрежения следующим: смешать 5 мкл кратной разреженных очищенный библиотеки (подготовленных на шаге 6.1) и 45 мкл нуклеиназы свободной воды в трубе низкого привязки ДНК.
  3. Приготовляют раствор 2,000-fold разрежения следующим: смешать 5 мкл 200-fold разбавленным очищенный библиотеки (подготовленных на шаге 6.2) и 45 мкл нуклеиназы свободной воды в трубе низкого привязки ДНК.
  4. Приготовляют следующим образом реакция мастер смеси: смесь 10 мкл 2 x мастер смесь решение и 1 мкл 20 x праймер зонд пробирного решение в стерильных microcentrifuge трубки с пипеткой, а затем перемешать путем касания трубку. 11 мкл реакция мастер смеси в скважины оптических 96-луночных реакции.
  5. Добавьте 9 мкл разбавленного библиотеки 2,000-fold, 9 мкл каждого стандартного элемента управления или 9 мкл нуклеиназы свободной воды в каждой скважины с дозатор 10-мкл.
  6. Держите стороне не клей оптических самоклеющаяся пленка и отогните защитный бэк от центра фильма.
    1. Аккуратно перетащите аппликатор над фильмом и печать фильм над 96-луночных пластины.
    2. Аккуратно перемешать 96-луночных пластину с помощью пластины 96-луночных смеситель для 10 s при комнатной температуре.
    3. Центрифуга пластину кратко на 1000 g x 3 мин при комнатной температуре.
  7. Мощность на реальном времени PCR документа и вставьте пластину 96-луночных. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 50 ° C на 2 мин., 95 ° C 20 s, а затем 40 циклов 95 ° c для 1 s и 60 ° C для 20 s. Использование «стандартной кривой» и «быстрый режим».
  8. Рассчитайте концентрацию неразбавленном библиотеки путем умножения концентрация определяется 2000 с ПЦР.

7. следующее поколение последовательности

  1. План выполнения условие и установите для параметра запуска программного обеспечения.
    1. Нажмите кнопку [вкладку план] и [шаблон] и выберите соответствующий метод run.
    2. Выберите приложение и технику типа и нажмите кнопку [далее].
    3. Выберите инструмент, образца подготовка комплекта (опционально), Комплект тип библиотеки, шаблон комплект, Комплект последовательности, базовый режим калибровки, чип типа, последовательности (опционально) и штрих-кодов набора элементов управления и нажмите кнопку [далее].
    4. Выберите плагины и нажмите [Next].
    5. Выберите проект и нажмите кнопку [далее].
    6. Выберите ссылку по умолчанию и кровати файлы целевого региона.
    7. Введите имя образца, выберите штрих-код и нажмите кнопку [план выполнения].
  2. Выполните подготовку шаблона и чип, погрузка в автоматизированный инструмент согласно инструкциям производителя. Оттепель картридж реагента при комнатной температуре 45 мин перед использованием.
  3. Разбавить неразбавленном библиотека с нуклеиназы свободной воды по концентрации Библиотека, рассчитанные на шаге 6,8 и сделать 20 pM библиотек.
    1. Подготовьте Объединенный библиотека для секвенирования и магазин на льду.
    2. 25 мкл пуле библиотеки с 100 мкл пипеткой, в нижней части образца трубки. Используйте библиотеку пуле в течение 48 ч.
  4. Питания и откройте крышку автоматизированного инструмента.
    1. Место последовательности чип, чип адаптер, обогащения картриджа, наконечник картриджа, ПЦР пластины, ПЦР кадр печать, восстановления трубки, решение картриджа и реагента картридж для соответствующей позиции автоматизированного инструмента.
    2. Нажмите [Настройка запуска] и [шаг за шагом] на экране.
    3. Закройте крышку и нажмите [начать проверить] на экране.
    4. После палубе процесс сканирования, нажмите [Next] на экране.
    5. Проверьте содержимое дисплея (тип комплект, чип, чип ID, ID образца, планы), установить время и нажмите [OK] на экране.
  5. После окончания загрузки чип:
    1. Нажмите [Next] на экране и откройте крышку.
    2. Выгрузка последовательности чип от микросхема адаптер в перчатках.
    3. Поместите фишку в контейнер чип, rap парафина и хранить при 4 ° C до sequencing реакции.
    4. Удален обогащения картридж, ПЦР-планшете, ПЦР кадр печать, восстановления трубки, решение картриджа и реагента картридж из соответствующей позиции автоматизированного инструмента в перчатках.
    5. Передача пустой наконечник картриджа отходов Совет положение автоматизированного инструмента в перчатках.
    6. Нажмите [Next] и закройте крышку.
    7. Touch [Пуск] и очистите автоматизированный инструмент ультрафиолетовых лучей на 4 мин.
  6. Растворите таблетки хлорита натрия в 1000 мл ультрачистая вода и фильтр раствор с блоком фильтра фильтр потока 0,22 мкм.
    1. Включите инструмент виртуализации.
    2. Нажмите [Очистить] и [далее] на экране последовательности документа.
    3. Очищайте инструмент виртуализации с 250 мл раствора стерилизованное фильтр натрий хлорита и впоследствии 250 мл ультрачистая вода.
  7. Нажмите [Initialize] и выберите набор соответствующей последовательности на экране.
    1. Установите серый грузоотправителя в соответствующее место в перчатках.
    2. Инициализируйте инструмент виртуализации с промывочный раствор (поставляется в комплекте), регулировка рН раствора, (содержащий 350 мкл рабочего раствора натрия гидроксида 100 мм) и pH стандартного раствора (поставляется в комплекте).
  8. 20 мкл dATP, dGTP, дЦТФ и dTTP нуклеотидов (поставляется в комплекте), в 50-мл тюбиках (поставляется в комплекте), с 100 мкл пипетки.
    1. Установите серый грузоотправителя в соответствующее место в перчатках.
    2. Загрузите 50 мл трубки и винт на последовательности документа.
    3. Нажмите [Next] на экране, чтобы начать шаг инициализации, который занимает примерно 25 минут.
  9. После завершения этапа инициализации:
    1. Touch [Run] на экране и выберите инструмент подготовки соответствующей библиотекой.
    2. Сканировать двумерный штрих-код чипа.
    3. Вставьте последовательности чип на соответствующей позиции.
    4. Закройте дверцу чип зажим и инструмента.
    5. Touch [чип проверить], [далее] и [OK] на экране, чтобы начать запуск последовательности.
  10. После реакции, последовательности передачи данных и выполнения анализа данных конвейера на виртуализации сервера13,17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 показывает весь процесс от подготовки образцов ТИЦ до экстракции ДНК. В частности процедура занимает только два дня, чтобы получить геномной ДНК образцов TIC. Мы оценивали любые последствия опухоли хранения перед обработкой слайд. Мы обнаружили, что опухолевые клетки были прикреплены на стекло слайд, когда образцы ткани сразу же были затронуты на слайд, и когда тканей хранились в солевой смоченной-марлевый стерильный за 1 ч (рис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы представили альтернативный метод для получения опухоли ДНК от клинических патологических образцов, используя TIC. ТИЦ подготовка очень проста и требует меньше времени по сравнению с FFPE методами, без требования для специальных инструментов10. Все процедуры, от подготовки КРЕСТИКИ для экстракции ДНК может быть завершена в течение двух дней (рис. 1). Этот метод таким образом сокращает время обработки для выполнения генетического тестирования. В ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим всех медицинских и вспомогательных сотрудников больницы и пациентов за согласие участвовать. Мы благодарим Габриэль белый волк, PhD, Edanz группы (www.edanzediting.com/ac) для редактирования проекта настоящего доклада. Это исследование было поддержано субсидий для исследовательского проекта генома из префектуры Яманаси (Y.H. и М.О) и Грант от ЯСУДА медицинский фонд (Y.H.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ФАЙН ФРОСТ белый20 микро стекляMatsunami Glass ind, LtdSFF-011
Arcturus PEN мембранный стеклянный слайдThermo Fisher ScientificLCM0522
Cyto Quick A solutionMuto Pure Chemicals20571
Cyto Quick B растворMuto Pure Chemicals20581
May-Grunwald SolutionMuto Pure Chemicals15053
Giemsa solutionMuto Pure Chemicals15002
QIAamp DNA FFPE набор тканейQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
TaqMan набор реагентов для обнаружения РНКазы PThermo Fisher Scientific4316831
TaqMan Assay от FFPE DNA QC Assay v2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Fast Optical 96-луночный реакционный планшет Thermo Fisher Scientific4346907
Оптическая адгезивная пленкаMicroAmp Thermo Fisher Scientific4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 Система ПЦР в реальном времениThermo Fisher ScientificVIIA7-03
Himac CF16RXIIHitachi-kokiCF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation KitThermo Fisher Scientific4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress Адаптеры штрих-кода 1-16 Thermo FisherScientific4471250
Ion PGM Hi-Q View Секвенирование Комплект (200 основание)Thermo Fisher ScientificA30044
Система Ion ChefThermo Fisher Scientific4484177
Veriti 96-луночный термоамплификаторThermo Fisher ScientificVeriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
Ion PGM SystemThermo Fisher ScientificPGM11-001
Ion PGM Wash 2 Комплект бутылокThermo Fisher ScientificA25591
Agencourt™ AMPure™ XP KitBeckman CoulterA63881
16-позиционная магнитная подставкаThermo Fisher Scientific4457858
антипригарные, без РНКазы пробирки Microfuge, 1,5 мл (пробирка с низким связыванием)Thermo Fisher ScientificAM12450
вода без нуклеазыThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp™ Оптические 96-луночные реакционные планшетыThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp™ Прозрачная клейкая пленкаThermo Fisher Scientific4306311
Agencourt™ AMPure™ XP KitBeckman CoulterA63881
Этанол (99.5)Nacalai Tesque08948-25
Гидроксид натрия (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LПипетка
L-2XLS+МЕТТЛЕР ТОЛЕДО17014393
Пипет-Лайт LTS Пипетка L-10XLS+МЕТТЛЕР ТОЛЕДО17014388
Пипетка Pipet-Lite LTS L-20XLS+МЕТТЛЕР ТОЛЕДО17014392
Пипетка Pipet-Lite LTS L-100XLS+МЕТТЛЕР ТОЛЕДО17014384
Пипетка Pipet-Lite LTS L-200XLS+МЕТТЛЕР ТОЛЕДО17014391
Пипет-пипетка Pipet-Lite LTS L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
пети-менWAKENMODEL8864Мини-центрифуга
петит-инкубаторWAKENWKN-2290Воздушный инкубатор
SensiCare Неопудренные нитриловые смотровые перчаткиMEDLINESEM486802
Стерильная марляOsaki11138
Холодильник MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
СТРИЖКА ПЕРЬЕВ BLADFEATHER FeatherNo130
FEATHER TRIMMING BLADFEATHERNo.260
FEATHER SFEATHERFA-10
Vortex Genius 3IKA41-0458Vortex миксер
PincetteNATSUMEA-5
1,5 мл микропробиркаБИОБИКRC-0150
Pipet-Lite LTS 704354

Ссылки

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3(2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493(2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Экстракция опухолевой ДНКсравнение ДНК из FFPE-образцовPEN-мембранный слайдоценка качества ДНКсеквенирование следующего поколенияцифровая ПЦРколичественная ПЦР в реальном времениобнаружение соматических мутацийавтоматизированное секвенирование
Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.