Мы описать шаги, которые позволяют быстро в situ выборки небольшой части отдельной ячейки с высокой точностью и минимальным вторжением, используя капиллярно основе микро выборки, для облегчения химических характеристик снимка метаболической активности в живой эмбрионов, с помощью заказных одноклеточного капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии платформы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Рентгенофлуоресцентного капиллярного электрофореза масс-спектрометрии для метаболомики одноклеточных в жить лягушки (Xenopus laevis) эмбрионов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Количественная оценка малых молекул в одиночных клетках порождает новые возможности для лучшего понимания основных процессов, которые лежат в основе развития эмбриона. Чтобы включить одноклеточных расследований непосредственно в жить эмбрионов, новые аналитические подходы необходимы, особенно те, которые чувствительны, селективный, количественных, надежных и масштабируемых размеров различных клеток. Здесь мы представляем протокол, который позволяет проводить анализ в situ метаболизма в одиночных клетках в свободно развивающихся эмбрионов Южной Африки когтистые лягушки (Xenopus laevis), мощная модель в клетке и биологии развития. Этот подход использует капиллярную рентгенофлуоресцентного аспирационная определенную часть от одного выявленных клеток эмбриона, оставляя нетронутыми для последующего анализа соседние клетки. Содержимое ячейки собранных анализируемой микромасштабной капиллярного электрофореза электроспрей ионизации (CE-ESI) интерфейса в сочетании с высоким разрешением тандемные масс-спектрометр. Этот подход является масштабируемой для различных размеров ячеек и совместимы с сложной трехмерной структуры развивающихся эмбрионов. В качестве примера мы показываем, что рентгенофлуоресцентного одноклеточных CE-ЭСИ-MS позволяет разяснения метаболизм клеток неоднородность, которая разворачивается как прогениторных клеток приводит к потомкам во время развития эмбриона. Помимо клеток и биологии развития анализ одноклеточных протоколы, описанные здесь поддаются других размеров ячеек, типов клеток или Животные модели.
Введение
Полное понимание эмбрионального развития требует характеристика всех молекулярных изменений, которые разворачиваются в каждой клетке организма развивающихся. Во время следующего поколения виртуализации с молекулярной усиления позволяет глубокое измерение1 одной ячейки transcriptomes в разработке систем2,3, значительно меньше известно о набор мелких молекул производится в одном эмбриональных клеток, включая белки и, особенно, метаболитов (молекулярная масса < да ~ 1500). Быстрый и динамичный ответ на внутренние и внешние события метаболом служит мощным дескрипторов молекулярной состо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы, связанные с поддержанием и обработки Xenopus laevis были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом в университете Джорджа Вашингтона (IACUC нет. A311).
1. подготовка проб инструменты, средства массовой информации, растворители и блюда
- Подготовить 1 x Стейнберга решение (СС), растворяя следующие соли в ультрачистая вода (~18.2 MΩ.cm при 25 ° C) в следующем порядке и в указанных концентрациях, после стандартного протокола33: натрия хлорид (58.2 мм), хлорид калия ( 0,67 мм), нитрат кальция (0,34 мм), сульфат магния (0,83 мм), трис гидрохлорида (4.19 мм) и Tr....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы недавно занятых рентгенофлуоресцентного одноклеточных CE-ЭСИ-МС для характеристики метаболитов в отдельных определенных ячеек в свободно развивающиеся зародыши Xenopus laevis 29,30. Рентгенофлуоресцентного позволяет быстро (~ 5 сек/cell), на месте стремление ~ 10 nL от отдельной ячейки, несколько чаяний ту же ячейку или несколько разных ячеек в пределах же или более поздних стадиях развития живой зародыш (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Рентгенофлуоресцентного CE-ЭСИ-MS позволяет прямой характеристика метаболитов в одиночных клетках в прямом эфире, свободно развивающихся эмбрионов. В центре подхода находятся два технических подкомпонентов, а именно в situ капиллярного microsampling и высок чувствительности CE-ЭСИ-г-жа по сравнению с поклеточного рассечение, капиллярный microsampling имеет преимущество быстрой операции (несколько секунд против 5 мин / cell, рассечение), совместимость с сложных трехмерных морфология эмбрионов и масштабируемость д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов GM114854 (чтобы п.н.) и CA211635 (для п.н.), Арнольд и Мейбл Бекман фонд Бекман молодой следователь предоставить (п.н.), премия DuPont молодой профессор (чтобы п.н.), Американское общество для массы Спектрометрия исследований премии (п.н.) и космос клуб фонд стипендий (R.M.O. и E.P.P.). Мнения и выводы, содержащиеся в настоящей публикации являются исключительно мнениями авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения источников финансирования.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты для культур эмбрионов Среды | |||
| Потазиум хлорид | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Сульфат магния | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Нитрат кальция | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Цистеин | MP Biomedicals | 101444 | |
| Тризма гидрохлорид | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Основание Тризма | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| >Metabolite Экстракционные растворители | |||
| Ацетонитрил (класс LC-MS) | Метанол Fisher Scientific | A955 | |
| (класс LC-MS) | Вода Fisher Scientific | A456 | |
| (класс LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Комментарии< |
| >Растворители и стандарты для CE-ESI-MS | |||
| Муравьиная кислота (класс LC-MS) | Метанол Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| (класс LC-MS) | Вода Fisher Scientific | A456-4 | |
| (класс LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Ацетилхолина хлорид | Acros Organics | 159170050 | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| >Настройка производства микрозондов | |||
| Съемник микропипетов | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Боросиликатные капилляры | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Тонкие острые щипцы: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (США) Inc | 11252-30 | Антикоррозионный и автоклавируемый. |
| Name< | strong>Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| Настройка для отбора проб микрозонда | |||
| Микроманипулятор | Eppendorf, Hauppauge, NY | Стереомикроскоп TransferMan 4r | |
| Nikon | SMZ18 | Должен быть виброизолирован. | |
| Осветитель, например, гусиные шеи | Nikon | C-FLED2 | |
| Микроинъектор | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Трансферные пипетки (Пластиковые, одноразовые) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Чашка Петри 60 мм и 80 мм | Fisher Scientific | S08184 | |
| Стеклянные пипетки Пастера (боросиликатные, одноразовые) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Центрифуга | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| CE-ESI-MS Настройка | |||
| Высоковольтный источник питания | Spellman | CZE1000R | HVPS может управляться дистанционно с помощью низковольтной программы, генерируемой персональным компьютером. Внимание: Высокое напряжение представляет опасность поражения электрическим током; Все соединительные детали должны быть заземлены или тщательно экранированы, чтобы предотвратить случайное воздействие на пользователя. |
| Шприцевые насосы (2) | Гарвардский аппарат | 704506 | |
| стереомикроскоп | Amscope | SM-3BZZ | Стереомикроскоп с возможностью увеличения в 4,5 раза, оснащенный осветителем для контроля режима распыления интерфейса CE-ESI. |
| Ступень для трансляции XYZ | Thorlabs | PT3 | |
| Ступень для трансляции XYZ | Изготовленная по индивидуальному заказу | Эта платформа способна загружать нанолитровые объемы образца в разделительный капилляр с помощью гидродинамического впрыска и подавать BGE для CE. Оба интерфейса, описанные в этой работе, были способны внедрять 6– 10 нл образца в течение 1 минуты в капилляр с разделением 1 м | |
| Флаконы для образцов из нержавеющей стали | Изготовленный | ||
| флакон из нержавеющей стали BGE | Изготовленный на заказ | ||
| капилляр из плавленого диоксида кремния (40 & микро; m/105 &микро; m ID/OD; 100 см) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| капилляры из плавленого диоксида кремния (75 &; m/360 µ m ID/OD; 100 см) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Излучатель из нержавеющей стали с тупыми наконечниками (130/260 &; m ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | Для повышения производительности расщепите лазером и отполируйте наконечник излучателя. |
| Шприцы (газонепроницаемые): 500 - 1000 L | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Цифровой мультиметр | Fluke | Fluke 117 | |
| Масс-спектрометр высокого разрешения | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | Тандемный масс-спектрометр высокого разрешения, оснащенный интерфейсом атмосферного давления, сконфигурированный для ESI |
| Настройка смеси для калибровки масс-спектрометра | Agilent технологии | ESI-L G1969-85000 | |
| Анализ данных версия 4.3 программное обеспечение | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | >Каталожный номер | Comments |
| >Вспомогательное оборудование | |||
| Вакуумный концентратор, способный работать на 4– 10° C | Labconco | 7310022 | |
| Аналитические микровесы (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| морозильная камера (-20 °; C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Морозильная камера (-80 &d; C) | Холодильный инкубатор Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Вихревой смеситель | Fisher | ||
Ссылки
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assem....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
