Методическая статья

Автоматизированное измерение криптококковой видов полисахаридной капсулы и клетки тела

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56957

⸱

11 января 2018 г.

 , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

В этой статье

Краткое содержание

Этот метод описывает процессор обработки изображений автоматизированный пакет предназначен для измерения полисахаридной капсулы и тело радиусов. Хотя первоначально предназначен для Cryptococcus neoformans капсула измерений процессор автоматизированных изображения также могут применяться для обнаружения других контраста на основе круговой объектов.

Аннотация

Этот метод призван обеспечить последовательную, точной и управляемым процесс для большого числа полисахаридной капсулы измерений.

Во-первых порог изображение формируется на основании значений интенсивности, однозначно рассчитывается для каждого изображения. Затем круги обнаруживаются, основанные на контраст между объектом и фоном, с использованием алгоритма устоявшихся преобразование Хафа круг (CHT). Наконец капсулы обнаруженных клетки и органы подобраны согласно Координаты центра и размер радиуса и экспортируются данные для пользователя в таблицу управляемым.

Простой, но значительные преимущества этой методики. Во-первых, потому, что эти расчеты выполняются на алгоритм, вместо того, чтобы человека увеличивается точность и надежность. Существует не снижение точности или надежности независимо от того, сколько пробы анализируются. Во-вторых этот подход устанавливает потенциальных Стандартная операционная процедура для поля Cryptococcus вместо нынешней ситуации, когда капсула измерения зависит от лаборатории. В-третьих учитывая, что ручной капсула измерения медленно и однообразной, Автоматизация позволяет быстрого измерения на большое количество дрожжевых клеток, которые в свою очередь облегчает анализ данных высокой пропускной способности и все более мощные статистики.

Основные ограничения этой методики берутся как функции алгоритма. Во-первых алгоритм будет создавать только круги. В то время как Cryptococcus клетки и их капсулы взять на круговой морфологии, было бы трудно применять этот метод для обнаружения объектов не круглое. Во-вторых благодаря как круги обнаруживаются CHT алгоритм может обнаружить огромные псевдо-круги, основанный на внешних краях нескольких кластерных кругов. Однако любой исказил клеток тела, поймали в псевдо-круг можно легко обнаружены и удалены из результирующих наборов данных.

Этот метод предназначен для измерения круговой полисахаридной капсулы Cryptococcus видов на основе чернил Индии светлые области микроскопии; Хотя он может быть применен к другим контраста на основе круговой объект измерения.

Введение

Cryptococcus neoformans является патогенных дрожжей, найдены повсеместно в мире, который связан с человеческие заболевания преимущественно в популяциях подавленным иммунитетом. C. neoformans прежде всего приходится существенной причиной общее ежегодное количество смертей в субсахарской Африке вследствие инфекционных болезней1. Основным клиническим проявлением криптококковой инфекции является менингоэнцефалит, который следует вторжения центральной нервной системы на транспорте в зараженные макрофаги (троянский конь образом) или прямые пересечения blood - brain барьер. C. neoformans выражает некоторые факторы вирулентности, включая возможность реплицировать на температуре человеческого тела, активность уреазы, melanization и формирование полисахаридной капсулы2. Полисахаридной капсулы состоит из повторяющихся glucuronoxylomannan и glucoronoxylomannangalactan полимеров и функции как защитный барьер против факторы экологического стресса и иммунной реакции2.

Хотя размер криптококковой полисахаридной капсулы размер последовательно не связывается с вирулентности, есть свидетельства того, что это фактор в патогенезе2,3,,4,5, 6,7. Капсула размер связан с менингитом патологии6, может повлиять на способность макрофагов контролировать Cryptococcus инфекции5и может привести к потере вирулентности если отсутствует8. Таким образом измерения размера капсулы являются общими в криптококковой исследований, но там не fieldwide стандарт для метода капсула измерения.

В настоящее время C. neoformans полисахаридной капсулы измерение основано на ручных измерений микроскопии изображений, и точные методы приобретения изображений и измерение варьируются от лаборатории9,10, 11. Главная задача этого метода является, что некоторые исследования требуют приобретения тысяч отдельных измерений, что затрудняет поддержание точность и надежность. Кроме того даже когда публикуются результаты, есть часто недостаточное описание метода измерения. Многие публикации не объяснить, каким образом были получены их измерения, что фокальной плоскости был использован, как они определены порог для капсула идентификации, ли они использовали радиус или диаметр, ли они использовать одно измерение, или в среднем несколько, или другие детали. Некоторые публикации только состояние их метод как какая программа была использована, например, «Adobe Photoshop CS3 был использован для измерения клетки»11. Такое отсутствие стандартизации и отчетности подробно может сделать воспроизводимость трудно, если не невозможно. Различия в человеческое зрение, компьютер яркости, Микроскоп настройки, слайд освещения, и других факторов может изменяться не только между отдельными лицами, но и между образцы, в то время как расчеты на основе соотношения значений интенсивности пикселей будет оставаться постоянным и применимые между выборками. Эта техника была создана в контексте обеспечения стандартизированной, точной, быстрый и простой способ измерить размеры капсул для поля, в котором не было ни до.

Как упоминалось ранее CHT алгоритм, давно, и сценарии для автоматического обнаружения круги были написаны раньше. Этот метод улучшает в двух областях, где бы не отвечают другие скрипты. Во-первых просто обнаружения круги не достаточно, потому что с криптококковой клетки должны быть обнаружены два различных кругов по отношению друг к другу. Этот метод специально обнаруживает клетки органов внутри капсулы, провести различие между двумя и выполняет вычисления только на соответствующие пары тела капсула. Во-вторых даже когда следующие же протокол, разные исследователи будут в конечном итоге с различными приобретенные изображения. Позволяя контролировать каждый параметр алгоритма следователь, этот инструмент может быть скорректированы в соответствии широкий спектр методов приобретения. Нет необходимости для стандартизированных охвата, цели, фильтра и так далее.

Этот метод легко может применяться к любой ситуации, в которой следователь должен обнаружить круги в изображении что контраст с их фоне. Как круги светлее и темнее, чем их фона могут быть обнаружены, подсчет и измерить, используя эту технику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка чернил Индии слайд

  1. Пипетка 10 мкл криптококковой образца на слайд. Любые циклические дрожжей будет работать, но для этого эксперимента H99 был единственным штаммом используется.
    Примечание: Если образец непосредственно с носителя культуры, разбавления 1:2 с водой или PBS может помочь предотвратить тушь от слипания.
  2. Пипетка 2 мкл Индии чернильное пятно на образце и смешивать, физически толкает наконечник пипетки для образца и переезд круговыми движениями до тех пор, пока чернила Индии появляется равномерно.
  3. Поместите coverslip образца, удерживая левый край coverslip против поверхности слайда, затем аккуратно и равномерно снижение противоположной стороне coverslip над образца.
  4. Разрешить на слайд, чтобы воздух сухой за 5 мин.
  5. Осторожно примените легкий слой лака до coverslip границы сформировать печать и сохранить Индии чернильное пятно.

2. изображений слайд

  1. Место слайды в светлых местах микроскоп с камеры вложения и известных пиксель в микронный преобразования. Настройте фильтры, цели и контрастность, так что клетки капсулы являются ясными и клеток тела являются целенаправленной, темные полосы.
    Примечание: Различные фильтры, цели и параметры контрастности будет работать, но рекомендуется 20 x цель, Ph1 фильтр и биннинга 2 x 2.
  2. Убедитесь, что поле зрения плотным, но не перенаселенный с криптококковой клетки, с четкой контраст между капсулу клетки и фон и правильно сфокусированные с телом клетки визуализированы как темная полоса.
    Примечание: Точное количество клеток для оптимального изображения будет варьироваться в зависимости от образца и цели используется. Важные аспекты, чтобы убедиться, что клетки не кластерных или перекрытия, что плоскости фокуса ячейки существенно не изменяются, и что существует значительное чернил Индии пятна видны на заднем плане (по крайней мере 25% от поля).
  3. Сохранение изображений в один каталог с четких титулов, как алгоритм измерения будет выполняться на изображениях в одном каталоге и выходных данных будут организованы согласно имена файлов изображений.

3. алгоритм настройки

  1. Установить Python версии 2.7
  2. Установить дополнительные python библиотек, выполнив команды «ПУМ установить подушку» и «ПУМ установить openpyxl».
  3. Установка MATLAB, следуя инструкциям на
  4. Построить библиотеку python MATLAB, следуя инструкциям на https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Скачайте три необходимые файлы, включенные в этой рукописи дополнительных материалов («QCA.py», «Analysis2.m» и «TestRun.m»).
    Примечание: Эти файлы могут быть извлечены в любом месте, но все три должны быть в той же директории.

4. Использование алгоритма

  1. Запустите приложение, дважды щелкнув на QCA.py.
    Примечание: Приложение может занять несколько минут, чтобы начать. «QCA.py» файл содержит структуру программы, которая вызывает «.m» файлы для запуска алгоритма фактической.
  2. Выполните шаги, описанные в программе.
    1. Входной тип расширения файлов изображений предшествует период и разделенных точкой с запятой (вкл.». TIF;. JPEG») затем нажмите кнопку Enter .
    2. Выберите каталог, в котором расположены файлы изображений, нажав кнопку Выбор каталога и выбрать папку, которая содержит изображения.
    3. Создание списка файлов изображений в каталоге, нажав кнопку Создать список изображений . Изображения будут перечислены в текстовом поле справа. Проверьте и убедитесь, что список является точным и полным.
    4. Выберите случайное изображение из списка, чтобы использовать в качестве предварительного просмотра, нажав кнопку Выбрать случайное изображение .
      Примечание: Если изображение не удается открыть из-за «неправильное изображение режиме ошибка», алгоритм будет по-прежнему функционировать должным образом несмотря на не отображаются изображения. После шага 4.2.7 тестовое изображение будет по-прежнему отображаться.
    5. Цель ввода микроскопа и биннинга параметры. Если параметры по умолчанию не соответствуют Микроскоп используется, выберите «Custom пиксель преобразования» и ввод пиксель в ум преобразования для файлов изображений. После выбора, нажмите кнопку Вычислить преобразования и убедитесь, что преобразование является правильным согласно текстовое поле справа.
      Примечание: Представитель изображения, показанный на рисунке 1 были рассчитаны с 40 x увеличение и 2 x 2 биннинга выбран.
    6. Входные параметры алгоритма для обнаружения круг.
      1. Ввод минимального и максимального радиуса, обнаруживаемая наружная капсула обнаружения как Min и Max капсула радиуса записи. Меньший диапазон позволит более точные результаты.
      2. Ввод минимального и максимального радиуса, обнаруживаемыми для обнаружения тела клетки как Min и Max клетки тела радиуса записи.
        Примечание: Все четыре из этих записей должны быть цифры, представляющие их соответствующие значения в пикселях, согласно исходного изображения.
      3. Переместите капсулу и чувствительность клеток тела ползунков, чтобы отрегулировать порог чувствительности алгоритма. Низкая чувствительность будет строгим и уменьшить обнаружение ложных положительных круг, но может также обнаружить меньше реальных кругах. И наоборот высокая чувствительность будет увеличить скорость обнаружения, но может также привести к ложных положительных кругах.
        Примечание: Представитель результаты были получены с минимальный радиус капсула 7, максимальный радиус капсула 45, минимум тела радиус 4, максимальная тела радиус 30, капсула чувствительность 87 и тело чувствительность 87.
    7. Проверьте параметры на случайно выбранных изображений, нажав на кнопку Run Test . Результаты будут отображаться в центре верхней программы, заменив исходное изображение. Если результаты выглядят точной, рекомендуется выбрать дополнительные случайные изображения также попытаться убедиться, что выбранные параметры будут соответствовать все выбранные изображения.
      1. Максимально количество органов и капсулы обнаружен и визуально проверить ли круги, как представляется, подходят правильно. Количество органов внутри капсулы обнаружены будет отображаться в текстовом поле справа. В противном случае манипулировать параметры алгоритма, до тех пор, пока результаты точны.
        Примечание: Толстые цветные круги, только для того, чтобы помочь с визуализацией. Фактической круги, созданных для измерения, это математическая кривая рассчитывается алгоритмом HCT.
    8. Запустите алгоритм обнаружения на весь каталог файлов изображений, нажав на кнопку Начать анализ . Каждое изображение будет анализироваться и программа будет отображать «завершена» в текстовом поле справа когда были проанализированы все изображения.
    9. Нажмите кнопку матч и очистки . Это будет соответствовать обнаруженных клеток органов для обнаруженных капсулы, когда они находятся в и вычислить истинное капсула радиус путем вычитания тела от капсулы.
      Примечание: Если алгоритм используется для обнаружения флуоресценции или другая ситуация, в которой находится только один круг обнаружен этот шаг не требуется. Вместо этого нажмите Только тянуть органы или Только тянуть капсулы для сбора данных для только синий или только зеленые круги, соответственно. Важно отметить, что если только капсула данные извлекаются радиус направит всего радиус ячейки как не быть вычитанным радиус тела клетки.
    10. Найдите данные, завершенного в файле «CleanedOuput.csv» в каталоге изображений. Если только один кусок данных был выбран, этот файл будет называться «CleanedBodies.csv» или «CleanedCapsules.csv».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изображения получаются сначала микроскопии чернил Индии слайдов с помощью микроскопа яркие поля в сочетании с камерой (рис. 1А). Важно иметь клетки разлученных и достаточно низкой плотности, чтобы не подавить поля зрения, а также о том, как использовать достаточно пятно для создания контраста между клетками и фон. Как указано в протоколе, точное количество клеток для оптимального изображения будет варьироваться в зависимости от образца, микро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги этой методики подготовки слайд чернил Индии и приобретение микроскопа изображений. Хотя алгоритм успешно протестирована с различных методов слайд и изображения рекомендуемый Протокол описан в этой рукописи. Полисахаридной капсулы обнаруживается, основанные на исключение чернил Индии частиц из домена капсулы, как эти частицы являются слишком большими, проникнуть в сеть фибриллярных полисахарид. Чернила Индия исключение приводит в светлый круг на темном фоне. Алгоритм определяет круги, основанные на наскол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы признать Энтони Боуэн, чьи слайды были использованы в качестве второго человека бок о бок сравнения, а также Sabrina Нолан, чьи слайды были использованы в качестве третьего человека бок о бок и второй Микроскоп сравнения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
India InkBecton, Dickinson and Co.
Fisherbrand Superfrost Микроскоп СлайдыFisher Scientific12-550-14325x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass FisherScientific 12-548-B22x22-1
Салли Хансен HardasNails Xtreme Wear Лак для ногтейСалли ХансенN/A109 невидимый
SAB MediaSigmaS3306
Cryptotoccus neoformansATCC208821штамм H99
Olympus AX70 МикроскопOlympusAX70TRFСнято с производства ; Светлопольный микроскоп
Qimaging Retiga 1300QimagingN/AСнят с производства; Фотоаппарат Микроскоп Насадка
MATLABMathWorksН/Д Самаяпоследняя версия Рекомендуется
Язык программированияPython Н/ДВерсия 2 необходима; 2.7 рекомендуется
Microsoft ExcelMicrosoftN/AСамая последняя версия рекомендуется
Фосфатно-солевой буфер (PBS)SigmaP3813
261194

Ссылки

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561(2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cryptococcus

Похожие статьи