Method Article

Эффективное производство и генерируемые идентификации ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена нокауты в модели системы данио рерио

DOI:

10.3791/56969

⸱

August 28th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменения в системе модель данио рерио (данио рерио) целевых генома значительно способствовало появление подходов на основе ТРИФОСФАТЫ. Здесь мы описываем обтекаемый, надежный протокол для поколения и идентификации ТРИФОСФАТЫ производные нонсенс аллели, включающий гетеродуплексного assay мобильности и выявление мутаций, с помощью следующего поколения последовательности.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика кластеризованный, регулярно interspaced, короткие, рецидивирующий repeat (ТРИФОСФАТЫ) система Streptococcus pyogenes позволила настраиваемый платформы быстро генерировать генной модификации в широкий спектр организмов, в том числе данио рерио. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования использует один руководство РНК (sgRNA) для целевой эндонуклеазы связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) в геномной ДНК (геномная ДНК) целевой интерес, где Cas эндонуклеазы генерирует двухручьевой перерыв (DSB). Ремонт DSBs ошибкам механизмов привело к вставок и удалений (indels). Это может привести к фреймшифт мутации, которые часто вводят кодоном преждевременной остановки в пределах последовательности кодирования, таким образом создавая аллеля белка null. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома инжиниринг требует лишь несколько молекулярные компоненты и легко вводится в zebrafish эмбриона путем микроинъекции. Этот протокол описывает методы, используемые для создания ТРИФОСФАТЫ реагенты для данио рерио микроинъекции и для идентификации рыб, экспонируется микрофлорой передачи ТРИФОСФАТЫ изменение генов. Эти методы включают в себя в vitro транскрипция sgRNAs, микроинъекции ТРИФОСФАТЫ реагентов, выявление indels индуцированных на целевой сайт, используя метод, основанный на ПЦР, называемое гетеродуплексного мобильности пробирного (HMA) и характеристика indels с помощью низкую пропускную способность и мощный следующего поколения последовательности (НГС)-на основе подхода, который можно анализировать несколько продуктов ПЦР, собранных от гетерозиготных рыбы. Этот протокол является упорядочена, чтобы свести к минимуму количество необходимых рыбы и видов оборудования, необходимых для выполнения анализа. Кроме того этот протокол предназначен для подпадать для использования в лаборатории личного всех уровней опыта, включая магистрантов, позволяя этот мощный инструмент для экономически использоваться любой исследовательской группой заинтересованных в выполнении основанный ТРИФОСФАТЫ геномных изменений в данио рерио.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сохранению молекулярного механизма через эукариот лежит сила с использованием модельных организмов для исследований. Многие из этих систем модели облегчить использование реверс генетических подходов, таких как целевых генов нокауты охарактеризовать вклад продукт гена биологического или болезнь процесс интерес. Джин нарушение методов в организмов, таких как данио рерио исторически полагались на целевых введение фреймшифт мутации, которые обусловлены неточным ремонт DSBs1,2. Когда DSB вводится в геноме, поражения ДНК будет восстановлена через один из двух путей, которые повсеместно присутствуют почти все типы клеток и организмов: не гомологичных конце присоединения (NHEJ) и ориентированные на гомологии ремонт (HDR)3,4 . Неточный характер NHEJ машины часто производит indels различных длин5,6,,78,9. Введение фреймшифт перегласовок в кодирующая последовательность гена может производить преждевременной остановки кодоном, который часто оказывает ген нефункциональным.

Инженерной стратегии раннего генома в zebrafish содействовать indels включены meganucleases, цинка палец nucleases и транскрипции эффекторных активатор как nucleases, все из которых использовали ДНК белковых взаимодействий целевой нуклеиназы к определенному геномной Целевой объект, где он представил14,13,11,12,15, DSB10,. Однако эти технологии часто трудно применять благодаря трудоемким и сложным техники, необходимые для создания Нуклеаза, предназначенный для последовательности ДНК интерес. В отличие от предыдущих стратегий основанный ТРИФОСФАТЫ гена редактирования не полагаться на ДНК белковых взаимодействий для ориентации. Вместо этого связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) эндонуклеазы направлена через РНК руководство, которое использует базовый сопряжения взаимодействий нуклеотидов для целевой геномной сайт интерес16,,1718,19 ,,2021. Благодаря простоте разработки РНК руководство с желаемой спаривание взаимодействий для ориентации его относительно легко ориентироваться эндонуклеазы Cas для желаемого Локус. Тип II ТРИФОСФАТЫ системы в частности широко разработан для редактирования генома приложений благодаря несколько выгодных функций, включая использование единого многодоменных Cas нуклеиназы (Cas9), требующего взаимодействия с ДНК для стимулирования активности эндонуклеазы и использования единого руководства РНК (sgRNA) для его родственных последовательности ДНК18. Последовательность требования, необходимые для нападения на родственных sgRNA, хорошо понимали19, и желаемый sgRNA легко порожденных в vitro транскрипция. Простота и надежность ТРИФОСФАТЫ/Cas9 подход значительно облегчает целевых генетической модификации в данио рерио и широкий спектр других организмов.

Укрепление способности осуществлять что изменения целевых генома в zebrafish вследствие разработки основанный ТРИФОСФАТЫ реагентов значительно увеличить возможность изучать процессы символических позвоночных организмов, таких как развитие центральной нервной системы. Данио рерио геном содержит Ортологи 70% белка кодирование генов в геном человека, а также 84% генов, связанных с заболеваниями в людях22. Данио рерио развития экспонатов несколько ключевых качеств, которые повышают его использования в обратном генетические исследования: эмбрионы закладываются в больших лап, развивать внешне от матери, что делает их поддается генетической манипуляции, микроинъекции и взрослых рыбок данио сексуально зрелых, 3 месяцев, что позволяет для быстрого распространения желаемых линий23.

Доступны многочисленные протоколы, описывающие различные подходы для создания и определения ТРИФОСФАТЫ производные indels в zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Однако многие из этих процедур являются время интенсивного, требуется доступ к дорогостоящим оборудованием и может быть сложным для лабораторий с ограниченным опытом. Шаги, описываемые обеспечивают простой, надежный и экономичный ТРИФОСФАТЫ/Cas9-стратегию инженер данио рерио нокаут линий. Этот протокол описывает использование высокоэффективных комплект синтезировать sgRNAs с помощью ДНК-олигонуклеотиды (oligos), похож на другие подходы, которые были ранее описанных32. Описывается протокол включает два шага, в частности, значительно упростить анализ мутировал ТРИФОСФАТЫ линий: поэтапное использование на основе ПЦР HMA33 легко определить присутствие модификаций генома и анализ последовательности у гетерозиготных мышей данио рерио быстро и легко определить характер несколько indels экономичным образом. Кроме того пошаговые инструкции включены для надежный выбор, надежный добывающих и нагнетательных руководство РНК. Шаги, описанные здесь олицетворяют сравнительно недорогой, надежный протокол, позволяющий лабораторного персонала с широкий спектр опыта вносить идентификации генов нокауты в данио рерио.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями руководства для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья. Протокол был утвержден Purdue животное уход и использование Комитетом (PACUC номер 08-031-11).

1. дизайн Oligos отдельный шаблон для производства руководство РНК

  1. Выберите целевой области, представляющие интерес для изменения в регионе кодирования гена. Это должно быть близко к 5' концу гена для создания усеченной белок, но не так близко, что последующее начало в кадр кодоном позволяет производство белка с скромные N-терминальный усечения.
    Примечание: Один способ исключает эту возможность необходимо проверить течению кодирвоания гена, в рамки начала кодон. Кроме того используя руководство РНК, предназначенного в середине большой экзона, может помочь определить PCR праймеры для последующего скоринга результате indel.
  2. Выявления потенциальных участков руководство в регионе геномной интереса, используя руководство РНК выбор программы (см. Таблицу материалы)34,35,36. Задайте данные браузера данио рерио и последовательность смежных мотив (PAM) protospacer, 5'-НЭС-3».
    Примечание: Идеальный gRNA последовательности содержат 5′-G в первой позиции gRNA для эффективного T7 в vitro транскрипция. Если нет приемлемого руководства найдено с G в положении 5 ′, 5′ база другого руководства могут быть изменены для G или G могут быть добавлены на конце 5′ Руководство РНК, но это может снизить эффективность резки37. Чтобы максимизировать производительность резки, оптимального руководства последовательность имеет содержание GC 40-80% (выше, тем лучше) и содержит G в положении 20th , прилегающих к PAM, но не требуется38. Пример идеальной таргетинга последовательности: 5 ′ - G (N)18 G-3′ - NGG (NGG является PAM). Помимо изучения результатов из программы выделения РНК руководство для определения оптимального руководства РНК как описано выше, следует позаботиться чтобы избежать руководство РНК с предсказал сильное пробить эффектами, которые значительно усложняют течению анализа. В частности руководство РНК с предсказал пробить эффекты подпадают Кодирующие области должны быть исключены, и пробить сайтов предсказал должны быть минимизированы.
  3. Из выходных данных руководство РНК дизайн инструмента, исключить последовательность PAM (5 ′ НЭС-3′); Он не используется для ориентации, но включает в себя признание последовательности для расщепления Cas9.
  4. Для оставшихся 20 нуклеотидов (НТС), добавьте T7 промоутер последовательность и последовательность совпадения (регион дополняет эшафот oligo используется для синтеза полная длина sgRNAs поставляется в комплекте транскрипции рекомендованные в пробирке ) в указанном порядке ниже, чтобы получить 54 nt oligo: T7 промоутер последовательность: 5 ' TTCTAATACGACTCACTATA-3′; Руководство РНК последовательности 5′ - G (N)18 G-3′; Перекрытие последовательность: 5 ' GTTTTAGAGCTAGA-3 '
  5. Определить праймеры PCR которые фланге прогнозируемое сокращение сайта (Cas9 расщепляет 3 nt вверх по течению, Пэм последовательности) на расстоянии 50 – 150 пар оснований (ВР) каждый из разреза с помощью web ориентированного программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Это будет использоваться в дальнейшем для измерения эффективности резки. Если нет подходящей грунтовки идентифицируются с помощью этих ограничений, другой сайт руководство РНК может потребоваться рассмотреть.
  6. Закажите 54 олигонуклеотиды nt производить руководство РНК и ПЦР Праймеры для анализа целевых объектов (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Как дополнительный положительный контроль, может быть полезно для производства sgRNA ориентации генов, необходимых для производства пигмента для проверки производительности этого протокола, с помощью легко забил визуальные фенотип (см. Рисунок 1 для представителя результаты). Общей целью является ген тирозиназы, используя oligo (руководство РНК последовательности подчеркиванием)39: 5 ' TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3′

2. Подготовка ТРИФОСФАТЫ реагентов для эмбриона микроинъекции

  1. Заказать коммерчески доступных Cas9 белка (см. таблицу материалы).
    Примечание: Инъекций Cas9 мРНК могут также быть использованы для создания indels в zebrafish40,41, однако zebrafish эмбриона микроинъекции с белком Cas9 было показано, быть более эффективным32,42.
    1. Приостановите Cas9 белка предоставленного буфера мал для генерации 1 мг/мл раствора. Сохраните решение в инъекции готовые аликвоты в пробирках, ПЦР на-80 ° C для сведения к минимуму количество циклов замораживания оттаивания. Поэтому для генерации 5 мкл инъекционного раствора, 2 мкл 1 мг/мл Cas9 раствора используется, Cas9 может быть aliquoted в 2 мкл аликвоты, используя PCR газа трубы.
  2. Синтезировать sgRNA с использованием sgRNA в vitro транскрипция комплекта (см. Таблицу материалы). Выполните в vitro транскрипция в соответствии с инструкциями производителя.
    Примечание: Поддерживать РНКазы бесплатно технику во всех шагов подготовки решения синтеза, очистки и инъекции. Например, использовать одноразовые перчатки и часто менять их, использовать советы, которые являются сертифицированные РНКазы бесплатно и чистые поверхности и пипетки с коммерчески доступных решений по обеззараживанию лабораторного оборудования и труб (см. Таблицу материалы).
  3. Очищайте синтезированных sgRNA, с помощью Ацетат аммония осадков, используя технику, RNase бесплатно.
    Примечание: в качестве альтернативы, sgRNAs могут быть очищены с помощью ряда коммерчески доступных на основе столбцов РНК очистки наборы для относительно скромных затратах.
    1. 25 мкл Ацетат аммония 5 М и вихревой тщательно перемешать.
      Примечание: Раствор ацетата аммония является коммерчески доступных (см. Таблицу материалы), или раствором 5 M могут быть сделал в доме, добавив 385.4 мг ацетата аммония молекулярных класс 1 мл РНКазы свободной воды и температуре-20 ° C.
    2. 150 мкл 200-доказательство свободной от нуклеиназы этанола, для каждого образца. Место реакции в морозильной камере-80 ° C не менее 20 мин.
      Примечание: Образцы могут храниться на ночь-80 ° c, но не будет значительно увеличить доходность всего РНК.
    3. Центрифугуйте образцы на максимальной скорости (> 16000 x g) в 4 ° C microcentrifuge за 20 мин.
    4. Тщательно удалите супернатант, медленно дозирование жидкости, гарантируя Пелле РНК не нарушается.
    5. Добавить 1 мл 70% этанола (создан путем разбавления свободной от нуклеиназы этанола в РНКазы свободной воды) и осторожно перемешать трубки, переворачивать его несколько раз мыть остаточные соли из трубки.
    6. Повторите шаг центрифугирования для 7 мин.
    7. Удалить супернатант первый дозирование выкл большинство решения с помощью пипетки P1000, а затем использовать пипетки Р200 для удаления столько решение как можно скорее без нарушается гранулы. Сухие гранулы РНК в чистого пространства, например Ламинарный шкаф или стендовые, стараясь избежать загрязнения РНКазы, за 15 минут или до не более жидкие капли видны в трубе.
    8. Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл РНКазы свободной воды, количественную оценку продукта (например, с помощью Спектрофотометр) и Алиготе решение для длительного хранения в холодильнике-80 ° С.
      Примечание: Типичные концентрации диапазоне от 800 – 2500 нг/мкл.
  4. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Убедитесь, что был создан полнометражный РНК с помощью мочевины/страницы. Кроме того использование геля агарозы для проверки, что РНК нетронутыми.
    Примечание: Однако, при использовании геля агарозы большее количество gRNA необходимо запустить для визуализации РНК, и продолжительность не может быть точно определено. При анализе эффективности целевых резки после инъекции реагентов в рыбу, если есть нет или мало резки настоящего sgRNA должны быть проверены на деградацию.
    1. Литая гель полиакриламида 8% в КЭ с 40% полиакриламида (19:1) и 8 M мочевины, используя бесплатные РНКазы технику для решения и оборудование43.
      Примечание: Коммерчески доступных материалов может использоваться для очистки оборудования (см. Таблицу материалы).
    2. После того, как гель полностью затвердевшим (около 30 мин), сбалансировать гель, поместив его в КЭ запуск буфера и выполнение электрофорез на 30 минут на 5 V/см.
    3. Смесь 300 – 500 нг sgRNA с равным объемом 2 x РНК гель загрузки красителя (см. Таблицу материалы). С помощью P1000, снимите скважин любой мусор, закупорить работает буфер в каждом хорошо несколько раз. Загрузить заинтересовавшим и Побегите гель на 10 V/см для 2,5 ч.
      Примечание: Маркер Лейн здесь полезен для визуализации длина РНК, но не является обязательным; как правило это легко видно, если полная длина РНК был синтезирован (рис. 2).
    4. Визуализировать полос с использованием нуклеиновых кислот пятна (см. Таблицу материалы).
      Примечание: sgRNA полос должен отображаться как одной группы, тогда как размытие указывает РНК деградации (рис. 2).

3. микроинъекции ТРИФОСФАТЫ компонентов в Zebrafish эмбриона

  1. Настройка разведение танков в ночь перед инъекций, поместив количество желаемых мужчин и женщин (обычно 2 суки и 1 или 2 кобеля) в разведении бак с делителя в место44.
  2. Подготовить микроинъекции плита с 1,5% агарозы в 1 x E3 средства массовой информации (см. Таблицу материалы) с 0,01% Метиленовый синий (фунгицидом), поливая 35 мл растопленного агарозы в 10 см Петри и аккуратно лежали пластиковые формы для создания клиновидную форму желоба в решение, выстукивать плесень избавиться от пузырьков воздуха.
  3. Разрешить агарозы для установки и хранить блюдо с небольшим количеством средства массовой информации и парафин пленкой для предотвращения пластину от высыхания при 4 ° C.
    Примечание: Инъекции пластины для повторного использования в течение нескольких недель, до тех пор, пока колодцы становятся деформируется или сухой, или плита начинает расти плесень.
  4. На утро инъекций оттепель очищенный sgRNA и Cas9 белков на льду. Помните, чтобы обрабатывать все материалы с перчатки для предотвращения загрязнения РНКазы и использовать РНКазы бесплатные советы и трубки.
  5. Генерировать 5 мкл инъекционного раствора путем объединения Cas9 белка и sgRNA в соотношении 2:1 Cas9:sgRNA для получения окончательного концентрации 400 ПГ/nL Cas9 белка и 200 ПГ/nL sgRNA. Инкубируйте раствор Cas9/sgRNA при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы позволить Cas9 и sgRNA образуют рибонуклеопротеида комплекс. 0.5 мкл 2,5% раствор фенола Красного wt/vol (см. Таблицу материалы), и РНКазы бесплатная вода в окончательный объем 5 мкл.
    Примечание: Ионная сила раствора было показано, влияют на растворимость комплекса, поэтому добавление хлористого калия может повысить эффективность резки sgRNAs, который exhibit низкий indel формирования28sgRNA Cas9.
  6. Сделайте иглу, потянув 1,0 мм стекла капилляра с помощью микропипеткой съемник. Отрежьте кончик свежеприготовленные иглы с помощью новой бритвой или щипцы для получения угловой открытие, что будет легко проткнуть хориона и желточный мешок.
  7. Место иглы в микроманипулятор придает microinjector с источником воздуха включен. Под микроскопом света, используя масштаб подходит для калибровки, определяется для конкретного аппарата Отрегулируйте давление впрыска до тех пор, пока игла постоянно выкидывает раствором 1 nL в чашку Петри, заполнены с минеральным маслом.
    Примечание: Важно качество иглы. Практика производства иглы и впрыскивать в желточного мешка эмбрионов до тех пор, пока это навык освоил перед дальнейших экспериментов45.
  8. Удалить разделитель и разрешить рыбу разводить для около 15 мин.
    Примечание: Разведение раза дольше будет производить больше эмбрионов, однако впрыска должно быть завершено в то время как эмбрионы находятся на стадии 1-клетка для максимизации шансов что Cas9 сокращение будет происходить рано и поэтому уменьшение генетических мозаичностью. Эмбрионы могут быть введены на более поздних этапах (2 – 4 ячейки этапы), но это может возможно уменьшить скорость передачи микрофлорой модифицированных аллеля.
  9. Собирать яйца, используя фильтр и промойте их в 10 см Петри с использованием 1 x E3 СМИ с метиленовым синим 0,0001%. Проверьте работоспособность яйца под световой микроскоп, удаление любой неоплодотворенных яиц и мусора.
  10. Отложите 10 – 15 эмбрионов как элемент uninjected в отдельный, обозначенные Петри.
  11. С помощью пипетки передачи, аккуратно выровняйте яйца на тарелке инъекции, разогретую до комнатной температуры.
  12. Под микроскопом рассечение на 2,5 крат, придать 1 nL решения в желточный мешок каждого эмбриона впрыснуть в общей сложности 400 pg Cas9 белка и sgRNA, 200 стр.
    Примечание: Для увеличения резки, если желаемый или необходимости, увеличьте конечная концентрация белка Cas9 до 800 pg/nL и sgRNA до 400 ПГ/nL в инъекционного раствора; Однако это также может увеличить мимо резки или уменьшения зародыша здоровья. Эффективности резки также может быть увеличена путем инъекций непосредственно в ячейки46. Однако, инъекции в желточного мешка технически менее требовательных и дает достаточно резки для производства рыбы с коробкой передач высокой микрофлорой (> 70% потомства, содержащий измененный аллеля).
  13. Возвращение эмбрионы вводят в должным образом помечены Петри, покрыть их с 1 x E3 СМИ с метиленовым синим и положил их в инкубаторе эмбрион, набор до 28 ° C.
  14. В 24 ч пост оплодотворение (hpf), проверить здоровье вводят эмбрионов, удаляя мертвые или аномально развивающихся лиц и изменить средства массовой информации (см. Рисунок 3). Проверьте скорость выживание против uninjected управления.
    Примечание: Когда ориентация несущественные гена, менее 10% летальность ожидается относительно uninjected элемента управления. Если повышенные уровни летальности наблюдаются в Путеводитель вводят население по сравнению с uninjected управления, это может означать, что целевые ген имеет важное значение для развития, или пробить эффекты ведут к развитию не удалось. Уменьшение количества закачиваемой ТРИФОСФАТЫ реагентов может быть необходимым или поколение новых sgRNA с сокращением пробить эффекты могут потребоваться.
  15. Возвращение эмбрионов в инкубаторе и продолжать расти эмбрионов до 72 hpf, изменив средства массовой информации ежедневно для поддержания здоровья эмбриона.

4. анализ эффективности формирования Indel, используя HMA

  1. Собирать два эмбрионов пяти из введенного плит, выросло до 72 hpf microcentrifuge трубы и собирать один наборы пяти эмбрионов с uninjected элемента управления.
  2. Анестезировать эмбрионы, добавив 0,004% MS-222 (tricaine) и подождать 2 минуты.
  3. Чтобы извлечь геномная ДНК, аккуратно Пипетка СМИ от каждого эмбриона набора и 45 мкл 50 мм NaOH. Инкубируйте эмбрионов на 95 ° C в течение 10 мин.
  4. Удаление эмбрионов от источника тепла и остыть до комнатной температуры. 5 мкл 1 М трис-HCl рН = 8 и вихрь образцы энергично (5 – 10 s). Центрифуга решение на максимальной скорости (> 16000 x g) в комнатной температуре microcentrifuge на 3 мин супернатант передать чистый, обозначенные трубки и хранить геномная ДНК при-20 ° C ДНК на срок до 6 месяцев.
    Примечание: Фрагменты ДНК приблизительно 900 bp и меньше будет создаваться путем использования этого протокола.
  5. Настройка 50 мкл реакции PCR, используя 2 мкл подготовленный геномная ДНК от каждого образца (в том числе элемент uninjected) за инструкциями, поставляемыми с полимеразы, используя ранее конструированного грунты, окаймляющие прогнозируемое сокращение сайта.
  6. Очистить ПЦР продукты очистки с помощью ПЦР комплекта (см. Таблицу материалы), элюировать образцы в 30 мкл воды или Элюирующий буфер и количественного определения ДНК, используя спектрофотометр.
  7. Reanneal все 30 мкл каждого очищенного продукта PCR, поместив трубы в плавающих стойку на кипящей водяной бане (примерно 150 мл в 500 мл стакан). После 3 минут Выключите источник тепла и позволяют решения остыть до комнатной температуры, около 1 ч.
    Примечание: Этот шаг первый денатурирует ДНК и затем позволяет нитей, чтобы случайно reanneal для создания возможных гетеродуплексного полос, или несоответствие двухручьевой ДНК, содержащий полиморфизмы созданные ТРИФОСФАТЫ мутагенеза и таким образом были изменены электрофоретическая подвижность, по сравнению с homoduplexes. Последний цикл PCR или пандус вниз программы в Термоциклер также может использоваться для reanneal продукции47,48, но использование кипящей ванной могут принести улучшения резолюции гетеродуплексного продукции.
  8. 5 мкл 6 x загрузки красителя (см. Таблицу материалы) на reannealed решения ПЦР.
  9. Литье с использованием 30% полиакриламида (29: 1) гель полиакриламида/КЭ 15%. После гель, поместите его в аппарат электрофорез с КЭ работает буфер. С помощью P1000, снимите скважин любой мусор, таких как остаточные соли или гель фрагменты, которые могут препятствовать скважин, нежно закупорить буфера вверх и вниз в скважинах несколько раз.
  10. Нагрузки 500 нг reannealed продукты PCR, и загрузки элемента управления (образец из uninjected рыбы) рядом с каждый набор образцов sgRNA. Побегите гель на 150 V за 2,5 часа или до тех пор, пока краска фронт находится в нижней части геля.
  11. Визуализировать полосы, с помощью пятен нуклеиновой кислоты (например, бромид ethidium или SYBR зеленый (см. Таблицу материалы)).
  12. Изучение группы шаблон для каждого элемента управления и ТРИФОСФАТЫ вводят бассейн эмбрионов.
    Примечание: Появление нескольких полос, медленнее в введенный против uninjected полосы указывает образование продуктов Роман гетеродуплексного (рис. 4). Наличие Роман гетеродуплексного ДНК указывает, что indels были порожденных ТРИФОСФАТЫ инъекции. Уменьшение интенсивности группы homoduplex в вводят решения приблизительно 50% или более обычно достаточно привести к достаточно микрофлорой передаче. Кроме того дополнительные полосы иногда определены в uninjected рыбы и не должен рассматриваться в гетеродуплексного полос, когда наблюдается в вводят рыбы.
  13. Выберите инъекции с высоким КПД резки относительно uninjected элемента управления для каждой цели; Эмбрионы от этих уколов может использоваться выращивать рыбу искать indels, вызывая преждевременное стоп-кодонов.
    Примечание: Для высокоэффективных резки (снижение в полосе homoduplex, около > 50% интенсивности), скрининг 20 – 30 взрослых рыб должно быть достаточно для получения передачи микрофлорой.
    Для sgRNAs, который генерирует меньше резки более взрослых рыб может быть необходимо увеличить вероятность выявления рыб, которые exhibit микрофлорой передачи измененных аллелей, содержащий кодоном преждевременной остановки. Если формирование indel не соблюдается это может быть необходимо редизайн sgRNA в другой регион гена. Если наблюдается формирование группы не гетеродуплексного, sgRNA могут деградировали, и sgRNA качества должны быть проверены с помощью геля мочевины/PAGE.

5. выявление и распространение нокаут-линий

  1. Для выявления потенциальных основатель родительского рыбы, выполняют хвост клипы взрослых рыб F0 (вырос до примерно 2,5-3 месяца) для выявления присутствия indels. Анестезировать рыбы в tricaine 0,62 мм (см. Таблицу материалы), затем использовать чистые, острые лезвия бритвы для удаления примерно 1/2-3/4 хвостового плавника.
  2. Место хвост в 45 мкл 50 мм NaOH и вернуть восстановления бак рыб. Выполнения извлечения геномная ДНК как описано (шаги 4.2-4.4). Как только рыба возобновляется нормальный плавательный поведение, поместите рыбу обратно на течет вода системы пока не определены характер indel.
    Примечание: Очень важно для обеспечения отдельных рыб идентифицируются и могут быть надлежащим образом сопоставлены результаты хвост клипов.
  3. Как описано (шаги 4.5 – 4,9), выполнить HMA на хвост клип геномная ДНК для определения, если рыба была изменена путем инъекций ТРИФОСФАТЫ (рис. 5). Для выявления основатель рыбы, породы взрослых, которые демонстрируют гетеродуплексного полос от хвоста геномная ДНК рыбы одичал типа. Собирать эмбрионы и вырастить их до 72 hpf.
  4. В отеле 72 hpf, собирать 10 эмбрионов и место каждого эмбриона в отдельных труб. Выполнения извлечения геномная ДНК как описано выше (шаги 4.2-4.4) с помощью 11,25 мкл 50 мм NaOH и 1,25 мкл 1 М трис рН = 8.
  5. Повторите ПЦР и электрофорез для выявления гетеродуплексного полос, как описано выше (шаги 4.7 – 4.13) для определения, если аллели indel прошли этому поколению (рис. 6).
  6. Основываясь на процент передачи в одной эмбрионов, с помощью HMA, растут в среднем на 20 – 30 эмбрионы, полученные от Креста для каждой линии ТРИФОСФАТЫ интереса к взрослой жизни.
    Примечание: Этот номер может быть увеличивается или уменьшается в зависимости от частоты герминальных передачи.
  7. Выполняйте хвост клипы взрослых рыб F1 для выявления присутствия indels как описано (шаги 5.1-5.2). Как описано (шаги 4.5-4.11), выполнить HMA на хвост клип геномная ДНК для определения, если рыба носит indel (рис. 7).
  8. Для рыб, содержащие гетеродуплексного группу подготовьте для последовательности анализа ДНК.
    1. Выполняйте ПЦР с использованием новой грунтовки для того чтобы усилить продукт PCR ВР 300 – 600, вокруг отрезока сайта.
    2. Использование ПЦР очистки комплект для очистки ДНК и элюировать в 30 мкл. изучить ДНК на геле агарозы для обеспечения что однодиапазонный присутствует.
      Примечание: Некоторые гетеродуплексного могут присутствовать на геле агарозы и отображается в виде маленький мазок или двойной полосы чуть выше продукта ПЦР на ожидаемый размер.
  9. Если один-три indels анализируются, последовательность продукты PCR, используя Сэнгер секвенирования и определить последовательность indel, используя инструмент биоинформатики49. В противном случае определение последовательности нескольких продуктов ПЦР с помощью NGS анализа (см. Таблицу материалов) является более экономичным.
  10. Определить если преждевременная остановка кодоном были получены с помощью анализа последовательности с помощью инструмента биоинформатики (см. Таблицу материалы).
  11. Место рыбы, содержащий требуемый Мутантный аллель в новый танк с соответствующих меток.
  12. Дизайн ПЦР Праймеры для конкретных indel аллелей для генотипирования будущих потребностей. Эти грунты следует охватывают мутировавших последовательности и не усиливают одичал тип последовательности.
  13. В крест гетерозиготных данио рерио для создания разделения населения, которая будет содержать линии нокаут-25%.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальных подходов, описанных в настоящем Протоколе позволяют для эффективных, экономически производство данио рерио нокаут-линии с использованием технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9. В этой статье для облегчения интерпретации и устранения неполадок из результатов, полученных с помощью этот протокол были включены следующие цифры. После успешного производства и микроинъекции ТРИФОСФАТЫ-реагентов данио рерио эмбрионы могут быть проанализированы для открытой фенотипы и indel формирования с помощью HMA. Элемент полезным визуализировать успех ТРИФОСФАТЫ эксперимента является использование sgRNA, описанные на шаге 1.5 целевой пигментных гена тирозиназы. Cas9-индуцированной indel формирования в тирозиназы приводит к потере пигментации и легко забил 48 hpf (рис. 1). Еще один полезный контроля для обеспечения что подготовка ТРИФОСФАТЫ-реагентов для инъекций был успешным, это проверить что полнометражный (120 nt) sgRNA синтезирована с помощью денатурируя геля полиакриламида (рис. 2, переулок 1 и 2). Если деградировавших РНК может показаться как мазок, например Майна 3 (рис. 2) показывает деградированных РНК, которая не подходит для инъекций.

Анализировать частоту формирования indel мишенью ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генов, которые не приводят к открытой фенотипов например тирозиназы, HMA анализ — это простой и надежный метод. sgRNA/Cas9 вводят эмбрионов, анализируются с помощью HMA результатов в формировании гетеродуплексного полос и уменьшение интенсивности homoduplex группы (рис. 4). Наличие гетеродуплексного полос используется далее в настоящем Протоколе, для выявления потенциальных основатель рыбы из microinjected эмбрионов и как взрослые (рис. 4 и 5), чтобы проанализировать эффективность передачи микрофлорой учредителя ( Рисунок 6) и для проверки наличия indel гетерозиготных F1 рыб (рис. 7). Гетерозиготных рыбы, которые содержат indel являются кандидатами для NGS определить характер indel и определить, присутствует ли кодоном преждевременной остановки в регионе кодирования целевого гена.

figure-results-1
Рисунок 1 : Zebrafish эмбриона экспонат дефектом пигмент, когда вводят с sgRNA, ориентация на один клеточной стадии тирозиназы . (A) одичал тип, uninjected эмбриона на 48 hpf и (B) вводят эмбриона на 48 hpf. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 : В vitro транскрипция sgRNA с помощью синтеза Кит. Oligos были синтезированы, используя в vitro транскрипция согласно инструкции комплект синтез sgRNA. 500 нг РНК был запущен на геле мочевины/страницы, как описано. sgRNA, загруженных в строках 1 и 2 показывает группы, соответствующий по всей длине, нетронутыми 120 nt РНК. SgRNA в переулок 3 показывает образец деградированных РНК, которая не подходит для инъекций.

figure-results-3
Рисунок 3 : Сравнение здоровья 24 эмбрионы вводят hpf. Жизни эмбриона (A) разработать 24 hpf, легко отличить от эмбриона, что прервала развитие (B). Эмбрионов, которые напоминают (B) или резко изменили функции (a), такие как искривление позвоночника или изменены головы и глаз развития должны быть удалены из блюдо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4 : Гетеродуплексного мобильность assay sgRNA-Cas9 microinjected zebrafish эмбриона. Бассейны 5 эмбрионов за образец были собраны на 72 hpf и геномная ДНК было извлечено. Гетеродуплексного анализ был выполнен как описано, образцы были загружены в равной степени с 500 нг ДНК. Переулки: M = 100 bp маркер; 1 = uninjected управления; 2 = инъекций образца 1; 3 = инъекций пример 2. Ожидаемый размер группы = 98 bp.

figure-results-5
Рисунок 5 : Гетеродуплексного мобильность анализ геномная ДНК, извлеченные из хвоста взрослых вводят ТРИФОСФАТЫ у рыбок данио. Эмбрионов, которые вводили с sgRNA и Cas9 белков выращивали до совершеннолетия (3 месяца). Рыбы-B и C экспонат гетеродуплексного полос и впоследствии были разведены для выявления микрофлорой передается indels; рыбы A не использовался в последующем анализе потому, что она не проявляет положительный гетеродуплексного группы. Переулки: 1 = одичал тип управления; 2 = рыба A; 3 = рыба B; 4 = рыба C. ожидаемый размер группы = 98 bp. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6 : Гетеродуплексного мобильность пробирного Одноместный эмбрионов, порожденных разведение ТРИФОСФАТЫ F0-вводят данио рерио одичал тип рыбы для выявления indels микрофлорой препроводил. Данио рерио были вязка и эмбрионы F1, вырос за 72 ч. Одноместный эмбрионов были собраны и гетеродуплексного анализ как описано. Переулки: 1 = одичал тип управления; 2-10 = одного эмбриона F1 в переулок. Этот гель показывает, что 7 из 10 эмбрионов показывают позитивный гетеродуплексного группы, указывающее скорость передачи микрофлорой 70% indel. Ожидаемый размер группы = 98 bp. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7 : Гетеродуплексного мобильность пробирного взрослых F1 данио рерио хвост клипов. Взрослые рыбы F1 забили HMA для идентификации indels. Рыбы, которые выставлены позитивные гетеродуплексного группы были ПЦР усиливается и представлен для широкого последовательности анализа определить характер, мутации. (A) полосы: 1 = одичал тип управления; 2 = рыба (4 bp, удаления 1 bp несоответствия). (B) эти F1 рыбы были выявлены же основателя и еще показать различные гетеродуплексного кучность, указывающее микрофлорой передачи нескольких модифицированных аллелей с одним учредителем. Переулки: 1 = одичал тип управления; 2 = рыба B (4 bp вставки, 7 несоответствие bp), 3 = рыба C (4 bp удаления, 4 bp несоответствия). Каждый из этих indels создан кодоном преждевременной остановки в кодирующая последовательность целевого гена, как определяется NGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает производства гена нокауты в системе позвоночных модель данио рерио, с использованием технологии ТРИФОСФАТЫ-Cas9. Ранее были описаны ряд протоколов для проведения инженерных ТРИФОСФАТЫ опосредованной генома в zebrafish15,25,26,50,,51-52. Этот протокол основывается на предыдущих усилий, объединения ряд простых, но можно воспроизвести последовательную экспериментальные методы, в частности, HMA и NGS несколько гетерозиготных рыбы, чтобы создать простой, экономичный, и экспериментально надежный протокол для ТРИФОСФАТЫ опосредованной мутагенеза в данио рерио, который подходит для лабораторий укомплектованы персоналом с широкий спектр профессиональной подготовки и опыта, а также учебных лабораторий.

Рекомендации по конструкции и синтез руководство РНК, включены в этот протокол. Основное внимание в руководстве РНК дизайн является минимизация эффектов пробить. Были разработаны несколько алгоритмы предсказания позволяет ТРИФОСФАТЫ пользователям доступ к инструментам вычисления с удобный графический интерфейс, которые предсказывают как деятельность на цели руководства и шанс пробить эффекты34, 35,36. Конкретные преимуществом системы данио рерио является снижение ставки-целевого воздействия, потому что Cas9 вводят в эмбрионы, и поэтому выражение является несохраняемым, которое было показано в мышах приведет к снижению пробить эффекты53. Тем не менее было продемонстрировано пробить эффекты встречаются в zebrafish54. Один из способов управления для пробить эффектов является основатель фенотип данио рерио, что были получены два независимых руководство РНК, которые нацелены же ген, как эти руководства будут скорее всего, влияет на различных сайтах-целевого. Альтернативный способ свести к минимуму последствия мимо, не описанное в настоящем Протоколе является использование мутировавших Cas9, который генерирует однорядная перерывы на цель ДНК, которые устраняются с высокой эффективностью. Сопряжения ДНК Никс в непосредственной близости друг от друга, которые являются дополнительными к противоположной нити результатов в формировании эффективного indel в желаемой локусе и минимизирует пробить эффектов55,56.

Помимо различных ставок-целевого воздействия, различные sgRNAs может иметь различные ставки мутагенеза желаемому57,,5859. Этот протокол использует HMA для анализа эффективности мутагенеза данного sgRNA с использованием гетеродуплексного группы формирования33,40. Гетеродуплексного полосы создаются путем гибридизации генерируемые ПЦР ДНК пряди, которые содержат несоответствия и может быть легко решена с помощью электрофореза геля. В отличие от других методов, обычно используется для измерения indel формирования такие как T7 эндонуклеазы пробирного или высоким разрешением расплава анализ25,26, HMA не требуют дорогих фермента сократить несоответствие ДНК и не требует сложный анализ ПЦР расплава кривых. Важно отметить, что использование HMA проверить высокие темпы indel формирования в вводят население также позволяет следователю свести к минимуму количество рыбы, необходимые для последующего производства нокаут-линий, что снижает стоимость выявления мутации с желательными характеристиками.

Относительная простота генерации основанный ТРИФОСФАТЫ indels позволяет создавать несколько аллелей генов, несколько сразу. Веб-программное обеспечение для анализа одной мутации от гетерозиготных рыбы с использованием Сэнгер последовательности продуктов ПЦР49. В случае, когда анализируются три или более аллелей ТРИФОСФАТЫ мутировал NGS характеризовать характер indel, скорее всего, чтобы быть более экономически эффективным, чтобы характеризовать характер indel как этот подход позволяет бассейн до 50 различных аллелей характеризуется на o NCE (см. Таблицу материалы)60,,6162. Такая экономика масштаба, вероятно, будет особенно полезным в бакалавриат лабораторных условиях.

Таким образом, этот протокол предоставляет пошаговые инструкции для герметизации генерации высокого качества ТРИФОСФАТЫ реагентов (в частности, sgRNA) таким образом, что меньше взрослых рыб должны быть созданы и проанализирована успешно определить мутантные аллели интереса, который также снижает время и стоимость генерации требуемой линии. Важно отметить, что этот протокол был разработан таким образом, что он может быть применен в лабораториях с ограниченными ресурсами для производства zebrafish мутант доступным образом. Кроме того мы нашли, что этот подход подходит для магистрантов и таким образом расширяет возможности для образования и профессиональной подготовки студентов, заинтересованных в практический опыт в основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R21CA182197 J.O.), Ральф W. и Грейс м. Шолвальтер исследование доверия и в Purdue сельскохозяйственной науки и расширение для программы экономического развития (AgSEED). Сэнгер последовательности данных были приобретены Purdue Genomics Core, поддерживаемый Р30 CA023168. Мэри Witucki поддержали центр Университета Purdue рака исследований летних студентов исследовательской программы при поддержке Ассоциации округа рака Кэрролл. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Мы благодарим Бенджамин Картер, Эллен Деннинг и Тейлор Sabato за предоставление критических отзывов на рукопись. Мы благодарим Департамент биохимии за поддержку этой работы и центр данио рерио исследований в университете Purdue, за их самоотверженность в уходе и благосостояние наших данио рерио колонии. Наконец мы благодарим объекта Core геномики Purdue, и вклад Филлип-Сан-Мигель в отношении услуг NGS.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Программное обеспечение для анализа sgРНКCRISPOR
Программное обеспечение для анализа sgРНКBreaking-Cas
Программное обеспечение для анализа sgРНК ChopChop
Дизайн праймера для ПЦРPrimer 3
без РНКазыhttp://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
вода без РНКазылюбой марки. Thermo Fisher и Qiagen имеют подходящую воду.
Этанол без РНАЗ Этаноллюбой маркикласса молекулярной биологии не содержит РНАЗа. Fischer, VWR продают подходящий этанол.
Cas9 ProteinPNA BioCP01Cas9 белок с сигналом ядерной локализации.
Целевые специфические олигонухотидыIntegrated DNA Technologies (IDT)Синтез направляющих РНК.
ПЦР-праймеры направляют сайт разреза РНКIntegrated DNA Technologies (IDT)Используется для гетеродуплексного анализа, продукт 100-300.о.
ПЦР-праймеры направляют сайт разреза РНКИнтегрированные технологии ДНК (IDT)Использование для секвенирования CRISPR-аллелей, рекомендуется продукт 300-600.о.
EnGen sgRNA Synthesis KitNew England BioLabsE3322In vitro трансккриб направляющие РНК.
10X TBEThermo FisherB52РНКазный буфер для электрофореза нуклеиновых кислот.
6X Load DyeNew England BioLabsB7025SЗагрузка ДНК для электрофереза.
5M ацетат аммонияThermo FisherAM9071Реагент для очистки направляющих РНК.
Этанол (200 проба, без нуклеаз)Любая маркаОчищающий реагент для очистки направляющих РНК. Материалы молекулярного качества не содержат РНКазы.
Вода без нуклеазыЛюбая маркаДля синтеза и очистки направляющих РНК.
RNase awayThermo Fisher10328011Устраняет загрязнение РНКазой поверхностей, оборудования, стеклянной посуды.
DNA Ladder, 100.н.New England BioLabsN0467SСтандарты молекулярной массы для гель-электрофореза ДНК.
DNA Ladder, 1 kbNew England BioLabsN0552SСтандарты молекулярной массы для гель-электрофореза ДНК.
РНК-лестницаNew England BioLabsN0364SОдноцепочечный маркер РНК для проверки того, что полная длина sgРНК была синтезирована
TEMEDThermo Fisher17919Casting полиакриламидный гель.
Персульфат аммония (APS)Sigma-AldrichA3678Литейный полиакриламидный гель.
40% полиакриламид (19:1)BioRad161-0154Литейный денатурирующий полиакриламидный гель.
МочевинаSigma-AldrichU5378-100GЛитейный денатурирующий полиакриламидный гель.
Загружающий краситель для геля РНК (2x)Thermo FisherR0641Направляющий РНК на денатурирующий гель для электрофореза.
Бромид этидияSigma-AldrichE1510-10MLВизуализация нуклеиновых кислот.
SYBER GreenThermo FisherS7563Альтернативный метод на основе бромида этидия для обнаружения дцДНК в агарозных или полиакриламидных гелях.
МикроцентрифугаEppendorf5424очистка РНК, очистка ПЦР.
MyTaq PolymeraseBiolineBIO-21105Для амплификации ДНК с помощью ПЦР.
Амплификаторлюбой маркидля ПЦР-амплификации.
СпектрофотометрЛюбая торговая маркаNanoDrop или связанный с ней продукт для количественной оценки содержания ДНК/РНК.
Среда для эмбрионов E3Изготовленная на местесреда для выращивания эмбрионов и изготовления инжецитоновой пластины. Рецепт: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Метиленовый синийSigma-AldrichM9140Добавлен в 1х Е3 среды для предотвращения роста грибков на эмбрионах.
Чашка ПетриThermo FisherFB0875711ZStore эмбрионов, литая инъекционная пластина.
AgaroseDenvilleCA3510-8Литейная инжекционная пластина, агарозные гели.
Микроинсекционная формаАдаптивная наука ИнструментыТУ-1Для создания лунок для удержания эмбрионов во время инъекции.
Фенол красныйСигма-ОлдричP0290 Краситель для визуализации инъекций.
Минеральное маслоSigma-AldrichM5904-5MLДля калибровки объема иглы для инъекций.
Переносные пипеткилюбой маркиДвижущиеся эмбрионы.
Лезвие бритвыThermo Fisher11295-10Режущая инъекционная игла, хвост для обрезки взрослой рыбы.
Инкубаторлюбой маркиСодержание эмбрионов при температуре 28,5 oC.
Съемник пипетки VerticleKopf Instruments700CGeneate иглы для инъекций. Дополнительные инструкции по вытягиванию иглы: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
капиллярные трубкиSutter InstrumentsBF100-58-10Geneate иглы для инъекций.
Наконечники микрозагрузчикаEppendorf930001007Загрузите раствор в иглы для инъекций.
МикроинъекторWorld Precision InstrumentsPV 820Инъекция эмбрионов.
Диссекционный микроскопLeicaInjecting эмбрионов.
30% полиациламид (29:1)BioRad161-0156Гелевое литье из гетеродуплекса.
MS-222 (Трикаин)Sigma-AldrichA-5040Обезболивание данио-рерио для обрезания хвостов и экстракции гДНК из эмбрионов. Рецепт: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Микроволновая печьлюбой маркиЛитье инъекционной пластины, агарозные гели.
Окалиналюбой маркиЛитье инъекционных пластин, агарозных гелей.
Перчаткилюбой маркиДля всех аспектов протокола.
N2Любая маркаДля выведения жидкости из капилляра для инъекции эмбриона.
1,000 & микро; Л  СоветыЛюбой брендДля всех аспектов протокола.
200 &микро; L чаевыеЛюбой маркиДля всех аспектов протокола.
10 & микро; L чаевыеЛюбой маркиДля всех аспектов протокола.
Полоски для ПЦР ПробиркиЛюбой маркиДля всех аспектов протокола.
Микропипеткилюбой маркиДля всех аспектов протокола.
Платформа секвенирования NGS: WideseqЕсли ваше учреждение не предлагает эту услугу, посетите: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (Внешняя стоимость: 35 долларов США).
Программное обеспечение для анализаПо Сэнгеру секвенирование гетерозиготных рыб. Посетите: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Программное обеспечение для анализаSnapGene Viewer, Сканер последовательностей для анализа секвенирования NGS.
. http://crispor.tefor.net/. https://omictools.com/breaking-cas-tool. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/Техника Синтез направляющих РНК David последовательностей последовательностей

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
  3. Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
  4. Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  5. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
  6. Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061(2013).
  7. Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process? PLoS Genet. 10 (1), e1004086(2014).
  8. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  10. Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
  11. Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
  12. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
  13. Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
  14. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141(2013).
  15. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861(2012).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
  18. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  19. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  20. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  21. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  22. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  23. Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
  24. Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547(2016).
  25. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  26. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  27. Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
  28. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
  29. Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
  30. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555(2016).
  31. Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
  32. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186(2014).
  33. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  34. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  35. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148(2016).
  36. Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
  37. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  38. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  39. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  40. Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
  41. Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
  42. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319(2015).
  43. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
  44. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  45. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  46. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
  47. Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
  48. Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
  49. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  50. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  51. Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
  52. Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
  53. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479(2015).
  54. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  55. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  56. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  57. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  58. Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
  59. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
  60. Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002(2014).
  61. Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
  62. Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Gene KnockoutZebrafish ModelMicroinjection TechniqueHeteroduplex Mobility AssayIn Vitro TranscriptionsgRNA SynthesisCas9 ProteinGermline TransmissionNext Generation Sequencing

Related Articles