Эта статья описывает использование высокого разрешения УЗИ в генной инженерии рака поджелудочной железы мышей. Главной целью является предоставить подробную инструкцию для обнаружения и оценки эндогенного опухоли поджелудочной железы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование УЗИ высоким разрешением монитор опухоль начала и роста в модели генно-инженерных рака поджелудочной железы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
LSL-крас G12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX-1-Cre модель мыши (КЗК) представляет установленные и часто используемые трансгенные модели для оценки Роман терапии рака поджелудочной железы. Опухоль начала является переменной в модели КЗК 8 недель до нескольких месяцев. Таким образом неинвазивная изображений инструменты необходимы для экрана для начала опухоли и монитор для реакции на лечение. Для решения этой проблемы, за последние годы появились разные подходы. Высокое разрешение УЗИ имеет основные преимущества, такие как номера инвазивность, быстро сессии раз и высокое разрешение без облучения. Однако УЗИ у мышей не является тривиальным и достаточно анатомические знания и практические навыки требуются для успешного выполнения УЗИ высокого разрешения в модели доклинические рака поджелудочной железы. Вместе со следующей статьей представлено подробное практическое руководство для УЗИ брюшной полости в мышиных моделях с особым упором на модели эндогенного рака поджелудочной железы. Кроме того предоставляется краткое изложение общих ошибок и как их избежать.
Введение
Генетически модифицированные мыши модели получили все большее значение в исследовании рака из-за их способности тесно пилки сложный характер человека канцерогенеза1,2,3. Один из наиболее часто используемых моделей для изучения развития рака поджелудочной железы, прогрессирование и лечебных ответ характеризуется активация мутации в онкоген крас, в сочетании с инактивации p53 усмирителя тумора4. Этот -LSL-красG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX-1-Cre (КЗК) модель мыши имитирует поэтапный переход от неинвазивного интраэпителиальная неоплазия поджелудочной железы (Панин) поражений в инвазивной карциномы. Фенотипически почти всех мышей развиваются PDAC в течение первых шести месяцев после рождения. Однако по сравнению с пересаженной моделей, модель КЗК показывает высоко вариабельные опухоль начала от 8 недель до нескольких месяцев4. После опухолях поджелудочной железы достигает определенного размера (5-9 мм в диаметре), рост опухоли ускоряет быстро и должны быть зачислены в доклинических испытаний5мышей. Таким образом точное обнаружение опухоли начала и размера опухоли является необходимым условием для логистики доклинические исследования и мониторинг терапии. В целом, несколько подходов, как магнитно-резонансная томография (МРТ)-6, КТ сканирования7,8,9 или УЗИ высокого разрешения могут быть использованы для проводить скрининг опухоли и терапия10. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Хотя МРТ- или компьютерная томография (КТ)-изображения позволяет сбора данных высокого разрешения, а также точный объем вычислений, время длительного обследования под общего седативного эффекта, и очень дорогое оборудование требуется и позволяют не частой Сканирование в течение долгого времени. В отличие от мелких животных УЗИ является установленным метод, который может быть использован для экрана для брюшной патологий у мышей11. Преимущества этого метода визуализации короткие сканирование раз, высокое разрешение, и возможность использования ультразвуковая допплерография или контраст расширения УЗИ (CEUS) для визуализации перфузии органов параллельно. Однако анатомические знания, 3D воображение и тщательное практической подготовки необходимы для правильного образа интерпретации.
В следующей статье предоставляется подробный протокол для использования УЗИ высокого разрешения в модели КПК. Кроме того стандартные УЗИ изображения изображены и помечены структуры органа для облегчения ориентации для следователя.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол является в соответствии с руководящими ухода за животными в Goettingen медицинский центр университета, Германия (33,9-42502-04-15/2056). В зависимости от конкретных потребностей отдельных животных Обзор советов, некоторые из шагов, протокол может быть изменен соответствующим образом.
1. брюшной пальпация КЗК мышей
- Чтобы избежать ненужных УЗИ, ощупывайте брюшко мыши для выявления мышей, которые возможно могут нести внутрибрюшное поражения и впоследствии должен пройти УЗИ брюшной полости.
- Выполните, пальпация живота загрузок начиная с 8 недель возраста в мышиной модели КПК. Высокое разрешение УЗИ может применяться также в модели пересаженных опухоли (например, orthotopics) или других генетически модифицированные мыши модели.
Примечание: В зависимости от опухоли кинетики и исследование цели (предотвращение исследование, исследование терапевтического вмешательства), обнаружение очень маленьких опухолей (1-2 мм) целесообразно монитор опухоль начала до опухоли могут быть пальпируется.
- Выполните, пальпация живота загрузок начиная с 8 недель возраста в мышиной модели КПК. Высокое разрешение УЗИ может применяться также в модели пересаженных опухоли (например, orthotopics) или других генетически модифицированные мыши модели.
- Поместите курсор мыши на сетке клетке и осторожно поднимите мыши за хвост и пальпировать живота, нежно идя вверх и вниз с индексом и пальцем руки-фиксации (рис. 1).
- Если мышь переносит мягкая пальпация, действовать, постепенно увеличивая давления. Большего сопротивления могут быть легко обнаружены в верхней и нижней части живота. Иногда, жесткий кал может быть ошибочно истолковано как опухоль массы.
2. Подготовка рабочего пространства
- Обеспечить место для по крайней мере три различных подразделений: предварительной проверки области, сканирование этапа и восстановления клетке. Требуемый материал изображены на рисунке 2.
- Чистые основные рабочие пластины (например с 70% этанол) и переключиться на платформе Отопление до начала сканирования (рис. 3). Убедитесь, что целевой 38-40 ° c температуры прежде чем первая мышь передается.
- Включите машина УЗИ и создайте новую папку для приобретенных данных (Рисунок 4). B-режим применяется для брюшной воображения. Кроме того убедитесь, что брюшной датчик подключен к активному порту машины. Исправить головку преобразователя в верхней части рабочей стадии с помощью преобразователя монтажные системы.
- Подготовка восстановления клетке на нагревательной пластинки или Термоматы (или использование Отопление лампа) для обеспечения после процедуры терморегуляции и скорейшего выздоровления отсканированных мышей. Наносят тонким слоем ткани как подушка в нижней части этой клетке, чтобы избежать стремление постельных принадлежностей с риска удушения (рис. 5).
3. Ингаляционная анестезия
- Нажмите ввод мыши в зале индукции. Открыть клапан для перевозчика потока газа (1 Л/мин кислорода или воздуха) и установите изофлюрановая концентрации до 4%, позволяя медленно растущей насыщенности палаты индукции. Убедитесь, что правильной изофлюрановая очистки (пассивной или активной фильтрации) находится на месте. После того, как правило, около 2-4 мин мышь будет под глубокой седации.
- Поддерживайте успокоения управляющими изофлюрановая 2% через носовой конус на стадии рабочего.
- Тщательно передать животное из камеры для индукции стадии работы. Проверьте носовой конус для постоянной газового потока. Положите мыши мордой в носовой обтекатель на выходе линии анестезии. Штатные должности для первоначального сканирования — лежа. Мышь также могут быть размещены на его правой или левой стороны для улучшения видимости поджелудочной железы головы или хвоста опухоли (рис. 6).
- Хотя УЗИ брюшной полости не болезненные per se, выполните тест щепотку ноги как индикатор для свободный состояние боль и глубокие обезболивающий государства. Если мышь находится до сих пор активно или активно передвигаться, переводной животное обратно в зале индукции на неоднократные и продолжительные индукции.
- Используйте глазную мазь защиты для предотвращения роговицы травм из-за потери жидкости.
- Во время анестезии используйте систему мониторинга. Однако ЭКГ и ректальной температуры не регулярно используется для сканирования УЗИ брюшной полости. Важно отметить, что мышей теряют способность высиживают под наркозом. Поэтому внимательно наблюдать за клинические признаки переохлаждения или респираторного дистресса, как затрудненное дыхание или апноэ. Если любой симптом является очевидным стоп изофлюрановая и мышь в клетке восстановления немедленно.
4. УЗИ параметры
- Переключение на ультразвуковую систему, как описано в инструкции производителя. Убедитесь, что параметр основной ставится на общие изображения с брюшной пакет активирован. Обычно для сбора данных в качестве стандарта используется B-режим изображений.
- Достижение качества оптимизированного изображения со следующими параметрами: частота 40 МГц, 2D-получить 25-30 дБ, изображение глубиной 10 мм, ширина изображения 10 мм, 3 зоны фокуса с центром между 3-6 мм.
5. мыши подготовка
- Исправьте верхних и нижних конечностей, при помощи клейкой ленты. Будьте осторожны избежать каких-либо вреда животному из-за фиксации (рис. 7).
- Удалите все брюшной меха, с использованием электронных ПЭТ Клипперс. Из-за меха текстуры Начните с нижней части живота до грудной клетки. Будьте осторожны в отросток xiphoideus , чтобы избежать повреждения кожи в этой области.
Примечание: Мышь меха отражает ультразвуковых волн и снижает видимость. - Используйте депиляционный крем для выполнения подготовки оптимизированных кожи и полное удаление меха. Администрировать тонкий слой крема на бритые живота, с использованием хлопка советы (рис. 8). Удалите крем (после 30 s или позднее в зависимости от используемых крем) с сухой ткани, а затем большим количеством воды, чтобы полностью удалить все остатки (рис, рис, рис. 11). Остатки крема может вызвать раздражение кожи и слизистой оболочки после УЗИ и таким образом может повлиять на здоровье.
- Для обеспечения надлежащей проверки условия применяются много геля УЗИ на живот (рис. 12). Как правило теплой УЗИ гель используется для того, чтобы свести к минимуму гипотермии для мыши.
- Вручную применить тонким слоем геля УЗИ на головке датчика. Выполните тест, прикоснувшись на конце преобразователя с выемкой. На экране сигнал на левой верхней стороне можно увидеть если датчик расположен правильно.
6. брюшной УЗИ
- Настройка преобразователя на животе с помощью фирмы давления. Тяжелые сжатие мыши живота может привести к сбоям в дыхательной и кровеносной и следует избегать.
- Сканировать вверх и вниз. Отрегулируйте кадр рабочей платформы и колеса для оси x и y.
- В качестве первого шага определите обеих почек. Обычно они появляются как hyperechogenic однородной структуры в нижней части живота. Подключенные полой renalis можно легко найти что далее приводит к нижней полой вены (рис. 13).
- Используйте полой lienalis служит как ориентир судно для поджелудочной железы. Попытка провести различие между полой renalis и полой lienalis. При обнаружении полой lienalis поджелудочной железы могут быть точно локализованы. Нормальный поджелудочной железы является скорее мембраны, которые распространяются через брюшную полость чем прочную структуру (рис. 14 и Рисунок 15).
7. поджелудочной железы опухоль обнаружение и оценка объема
- Идентифицировать поражения поджелудочной железы от всех окружающих структур. Они обычно появляются как гипоэхогенные неоднородных круглой или удлиненной ткани масс (рис. 16). Опухоль обычно твердые и вряд ли могут быть сжаты до сканирования головы. Обратите внимание, время от времени это может быть сложно проводить четкое различие между опухолью и петли тонкой кишки. Обратите внимание на перистальтику кишечника, что не должно наблюдаться в опухолях поджелудочной железы.
- При опухоли обнаружение экран вверх и вниз, чтобы получить впечатление общего размера и измерить самый большой диаметр с помощью УЗИ суппорта. Найдя подходящее изображение, замораживание экрана и использовать инструмент «Линейка» для точного определения размера опухоли. Обратите внимание, для последующего использования, это будет важно дифференцировать ли опухоль локализуется в хвост, тела или головки поджелудочной железы.
- Перед изменением вернуться жить режим, убедитесь, что для сохранения изображений для записи работы. Обратите внимание, во время замораживания изображение, которое может случиться что колесо регулировки освобождается, и ультразвуковой зонд еще более нажатии мыши живот. Таким образом исправление Корректировка сжатия перед изменением режима для замораживания.
- После окончания измерения первого самолета повернуть головку сканирования на 90° в продольном положении (рис. 17), либо повернуть мышь на его стороне, для обнаружения опухолей продольной расширения. Некоторые опухоли может потребоваться изменить положение указателя мыши для надлежащей видимости. Для опухолей поджелудочной железы хвост мышь можно разместить на его правой стороне (рис. 10 и рис. 19), на головы опухолях поджелудочной железы на его левой стороне (рис. 11 и рис. 20).
8. Количественная оценка объема опухоли
Примечание: Одна из основных целей всех усилий является правильное определение объема опухоли. Хотя существует несколько методов метод расчета, включая формулу эллипсоида является предпочтительным в Университет Goettingen медицинский центр.
- Оснащены все три ранее полученных диаметров, рассчитайте примерный объем соответствующего опухоли (рис. 21).
- В качестве альтернативы используйте двигательной системы сканирования головы для выполнения автоматизированной проверки области опухоли с последующей объем вычислений и 3 объемным реконструкции.
9. Восстановление
- После сканирования, тщательно удалить все скотчем и тщательно удалить все УЗИ гель сухой салфеткой.
- Тщательно передача мышь в клетку восстановления ( Рисунок 21). Избегайте любой ткани покрытия на mouse´s лицо, которое может привести к дыхания. Боковой позиции для восстановления должно быть предпочтительным.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
УЗИ является универсальным и неинвазивный метод, который используется для решения ряда вопросов в мышиных моделях заболеваний человека. По сравнению с всех других изображений подходы основные преимущества являются высокой пропускной способностью, стоимость, эффективность, короткие приобретение время и режиме реального времени. Однако этот инструмент требует опыта для создания точных, высокое качество изображения. Особенно в случае нежелательных артефактов по крайней мере некоторый опыт ра...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол предоставляется подробное описание для количественной оценки опухолях поджелудочной железы с помощью изображений с высоким разрешением УЗИ брюшной полости в генетически модифицированные мыши модели. Недавно Састра et al. опубликовал подробное описание как количественно опухолях поджелудочной железы в модели мыши, но не визуализированных инструкции по подготовке и обработке как условие для всех дальнейших шагов были показаны11. Общая цель этой рукописи должна обеспечить всеоб...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Deutsche Krebshilfe (Max Eder группы: 110972), DGVS докторской диссертации стипендию (SMB) и Else-Kröner-Fresenius-фонд стипендию (RGG) в Университет Goettingen медицинский центр. Мы благодарим Jutta Blumberg и Ульрике Wegner за экспертной технической помощи. Мы также благодарим всех животных техников на объекте животных Университет Goettingen медицинский центр для мыши держать. Все эксперименты проводились согласно правилам немецкого животных.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ультразвуковая система высокого разрешения Visual Sonics Vevo2100, включая сцену визуализации и линию анестезии | FUJIFILM VisualSonics Inc, Канада | VS-11945 | |
| Преобразователь микросканирования Vevo 2100 MS-550-D (22-55 МГц) | FUJIFILM VisualSonics Inc, Канада | VS-11874 | |
| Система анестезии Vevo (индукционная камера для анестезии с входом свежих и отработанных газов) | FUJIFILM VisualSonics Inc, Канада | SA-12055 | |
| Vevo Imaging Station (рабочая сцена с носовым конусом для подачи анестезии) | FUJIFILM VisualSonics Inc, Канада | SA-11982 | |
| электронные машинки для стрижки домашних животных | Panasonic Marketing Europe, Германия | 5025232484324 | Panasonic ER-PA10-s |
| Labotect Hot | plate Labor tech Gö тинген, Германия | 13854 | |
| крем для глаз (офтальмологическая мазь) | Schü lke& Mayr, Германия | 9080249 | |
| ветеринарный изофлуран | Abbvie, Германия | 4831867 | |
| крем для депиляции | RB healthcare Великобритания, Великобритания | 8218535 | |
| 70% этанола (v/v) в дистиллированной воде | TH. Geyer, Германия | 22941000 | |
| гель для ультразвука | Asmuth, Германия | 13477 | |
| салфетки для салфеток | Kimberly-Clark Германия, Германия | 7558 | |
| ватные насадки | Meditrade, Германия | 75481116 | |
| стеклянная чаша для УЗИ гель | ARC France, France | H1149 | |
| миска для воды | W & P Trading Co., США | B00K2P6PLQ | |
| марлевые губки | Fuhrmann, Германия | 960504 |
Ссылки
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Olive, K. P., Politi, K. Translational therapeutics in genetically engineered mouse models of cancer. (2), Cold Spring Harbor. 131-143 (2014).
- Westphalen, C. B., Olive, K. P. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer. The Cancer Journal. 18 (6), 502-510 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Frese, K. K., et al. nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Paredes, J. L., et al. A non-invasive method of quantifying pancreatic volume in mice using micro-MRI. PLoS One. 9 (3), e92263(2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Aung, W., et al. Immunotargeting of Integrin alpha6beta4 for Single-Photon Emission Computed Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer Model. Molecular Imaging. 15, (2016).
- Akladios, C. Y., et al. Contribution of microCT structural imaging to preclinical evaluation of hepatocellular carcinoma chemotherapeutics on orthotopic graft in ACI rats. Bulletin du Cancer. 98 (2), 120-132 (2011).
- Neesse, A., et al. CTGF antagonism with mAb FG-3019 enhances chemotherapy response without increasing drug delivery in murine ductal pancreas cancer. Proceedings of the National Academy of Science USA. 110 (30), 12325-12330 (2013).
- Sastra, S. A., Olive, K. P. Quantification of murine pancreatic tumors by high-resolution ultrasound. Methods in Molecular Biology. 980, 249-266 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
