Method Article

Interactome-Seq: Протокол для строительства Domainome Библиотека, проверки и отбора Фаговые отображения и следующего поколения последовательности

DOI:

10.3791/56981

⸱

October 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы, описанные разрешить строительство, характеристика и выбор (против целевого выбора) из любого источника ДНК библиотеки «domainome». Это достигается путем исследования трубопровода, который сочетает в себе различные технологии: фага дисплей, складной репортером и следующего поколения последовательности с веб-инструмент для анализа данных.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Складной журналисты являются белки с легко идентифицировать фенотипы, например антибиотикам, складные и функции которого нарушается, когда сливается с плохо складывания белки или случайных открытом чтения фреймов. Мы разработали стратегию, где, используя ТЭМ-1 β-лактамаз (фермент, присвоении ампициллин сопротивления) в геномной масштабе, мы можем выбрать коллекции правильно сложенный протеин доменов из кодирования части ДНК любой intronless генома. Фрагменты белка, полученные на этот подход, так называемые «domainome», будет хорошо выражена и растворимые, что делает их пригодными для структурно функциональных исследований.

Клонирование и отображение «domainome» непосредственно в систему отображения фага, мы показали, что это можно выбрать конкретные белка домены с желаемой привязки свойств (например, другие белки или антитела), обеспечивая тем самым важным экспериментальной информации для идентификации генов аннотации или антигена.

Выявление наиболее обогащенного клонов в выбранной поликлональных населения может быть достиган с использованием Роман секвенирование нового поколения технологий (НГС). По этим причинам мы представляем глубокую последовательности анализа самой библиотеки и выбора мероприятий предоставлять полную информацию о разнообразии, изобилия и точное сопоставление каждого выбранного фрагмента. Протоколы, представленные здесь показать основные шаги для строительства библиотеки, характеристик и проверки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью для строительства и выбор библиотек складывается и растворимого белка доменов из любого источника, генной/геномной начиная. Этот подход сочетает в себе три различные технологии: фага дисплей, использование складной репортером и следующего поколения последовательности (НГС) с конкретным веб-инструмент для анализа данных. Методы могут использоваться во многих различных контекстах белка на основе исследований, для идентификации и аннотации новых доменов белков/белков, характеристика структурных и функциональных свойств известных белков, а также определение белок взаимодействие сети.

Многие открытые вопросы по-прежнему присутствуют в исследованиях на основе белков и разработки методов для оптимального белок производства является важной потребность в нескольких областях расследования. Например несмотря на наличие тысяч геномов прокариот и эукариот1, соответствующий карта относительной протеомов аннотацию прямого закодированного белков и пептидов отсутствует до сих пор подавляющее большинство организмов. Каталог полный протеомов становится сложной цели, требующие огромных усилий в плане времени и ресурсов. Золотой стандарт для экспериментальных заметки остается клонирования все открытые рамки считывания (ORFs) генома, строительство так называемой «ORFeome». Обычно функции гена назначается на основании гомологии связанных генов известных деятельности, но этот подход является недостаточно точной из-за наличия многих неправильные аннотации в справочных баз данных2,3,4, 5. Кроме того, даже для белков, которые были выявлены и комментариями, дополнительные исследования необходимы для достижения характеристика с точки зрения обилия, выражений шаблонов в разных контекстах, включая структурные и функциональные свойства, а также взаимодействие сетей.

Кроме того поскольку белки состоят из разных доменов, каждый из них показаны специфические особенности и вклад в по-разному функций белков, изучение и точное определение этих доменов может позволить более полную картину, как на сингл гена и на уровне полного генома. Все необходимая информация делает исследования белков на широкой и сложной области.

В этой перспективе важный вклад могут предоставляться на беспристрастной и высок объём методы для производства белка. Однако успех таких подходов, рядом значительных инвестиций, необходимых, опирается на способность производить растворимый/стабильный белка конструкции. Это основные ограничения фактор, так как было подсчитано, что только около 30% белков может успешно выразил и производится на достаточных уровнях экспериментально полезным6,,78. Подход для преодоления этого ограничения основан на использовании случайно фрагментированных ДНК, чтобы произвести различных полипептидов, которые вместе обеспечивают перекрывающихся фрагментов представление отдельных генов. Только небольшой процент случайных фрагментов ДНК являются функциональные ORFs, хотя подавляющее большинство из них являются нефункциональные (благодаря наличию стоп-кодонов внутри их последовательностей) или кодировать для неестественное (ORF в кадре оригинал) полипептиды с биологического смысла.

Для решения всех этих вопросов, наша группа разработала высок объём белка выражение и взаимодействие анализ платформу, которая может быть использована на геномной масштаб9,10,и11,12. Эта платформа включает следующие методики: 1) метод для выбора коллекции правильно сложенный протеин доменов из кодирования части ДНК от любого организма; 2 технология отображения фага для выбора партнеров взаимодействия; 3) NGS полностью характеризовать весь interactome стадии изучения и выявления клонов интерес; и 4) веб-инструмент для анализа данных для пользователей без каких-либо биоинформатики или навыков программирования для выполнения анализа Interactome-Seq в простым и удобным способом.

Использование этой платформы обеспечивает важные преимущества по сравнению альтернативных стратегий расследования; Прежде всего этот метод полностью беспристрастной, высокой пропускной способности и модульные для исследования, начиная от одного гена до всего генома. Первый шаг конвейера является создание библиотеки от случайно фрагментированных ДНК исследуемых, который характеризуется затем глубоко NGS. Эта библиотека генерируется с использованием вектора инженерии где генов/фрагменты интерес клонируются между последовательность сигнала для секреции белков в Периплазматическое пространство (т.е., лидер Sec) и гена β-лактамаз ТЭМ1. Синтез белка будет наделять ампициллин сопротивления и способность выжить под давлением ампициллин, только в том случае, если клонированные фрагменты в кадр с этими элементами и результате синтез белка является правильно сложенные10,13 ,14. Все клоны спасли после антибиотика выбора, так называемые «фильтруют клонов», ORFs, подавляющее большинство из них (более 80%) и являются производными от реальных генов9. Кроме того сила этой стратегии заключается в выводах, что все клоны фильтрации ORF кодирования для правильно сложить/растворимые белки/домены15. Как много клонов, присутствует в библиотеке и картирования в том же регионе или домена, имеют разные начальные и конечные точки, это позволяет беспристрастной, единый этапа идентификации минимальная фрагментов, которые могут привести к растворимых продуктов.

Дальнейшее совершенствование технологии предоставляется с помощью NGS характеризуют библиотеки. Сочетание этой платформы и конкретных веб-инструмент для анализа данных дает важные объективную информацию на точное нуклеотидных последовательностей и расположение выбранных ORFs на ссылку ДНК исследуемых без необходимости дальнейших обширных анализов или экспериментальные работы.

Domainome библиотеки могут передаваться в контекст выделения и используется в качестве универсального инструмента для выполнения функциональных исследований. Высок объём белка выражение и взаимодействие анализ платформы что мы интегрированы и что мы называли Interactome-Seq использует преимущества технологий отображения Фаговые путем передачи фильтрованного ORF в phagemid вектор и создания ФАГ ORF Библиотека. После повторного клонирован в контекст отображения фага, белка, домены отображаются на поверхности частиц M13; Таким образом domainome библиотек можно непосредственно выбрать для фрагментов гена кодирования домены с конкретными ферментативную деятельность или привязки свойств, позволяя interactome сети профилирования. Этот подход был первоначально описан Zacchi соавт. 16 и позднее используется в нескольких других контексте13,17,18.

По сравнению с другими технологиями, используется для изучения взаимодействия протеин протеина (включая дрожжей два гибридной системы и масс-спектрометрии19,20), одно из главных преимуществ является усиление связывание партнера, что происходит во время ФАГ Отображение нескольких раундов выделения. Это увеличивает выбор чувствительности, таким образом позволяя выявление низкой обильные связывания белков доменов присутствует в библиотеке. Эффективность отбора выступал с ORF-фильтрации библиотеки далее увеличивается из-за отсутствия нефункциональные клонов. Наконец технология позволяет выбор выполняться против белков и не протеинового приманки21,,2223,24,25.

Фаговые выборки с использованием библиотеки domainome ФАГ может производиться с использованием антител, исходя из сыворотки больных с различных патологических состояний, например аутоиммунных заболеваний13, рака или инфекции заболеваний как приманку. Этот подход используется для получения так называемого «антитело подпись» болезни под исследования, позволяющие массово идентифицировать и охарактеризовать антигены/epitopes конкретно признаны больных антител в то же время. По сравнению с другими методами использование фага дисплей позволяет идентификации как линейной, так и конформационные антигенных эпитопам. Выявление конкретных подписи потенциально может иметь важное значение для понимания патогенеза, новый дизайн вакцины, выявление новых терапевтических целей и развития новых и конкретных инструментов, диагностические и прогностические. Кроме того когда исследование сосредоточено на инфекционные заболевания, основным преимуществом является, что открытие иммуногенных белков зависит от выращивания патогена.

Наш подход подтверждает, что складной журналистам может использоваться в геномной масштабе для выбора «domainome»: коллекция правильно сложенные, хорошо выраженной, растворимые белки доменов от кодирования части ДНК или cDNA от любого организма. Когда изолированные фрагменты белка полезны для многих целей, предоставляя основные экспериментальной информации для гена аннотации, а что касается структурных исследований, антитела epitope сопоставления, выявления антигена, и т.д. Полнота высок объём данных, предоставленных NGS позволяет анализ сложных образцов, таких как Фаговые отображения библиотек и имеет потенциал, чтобы обойти традиционной трудоемкой собирание и тестирование отдельных Фаговые спасли клонов.

В то же время благодаря функции отфильтрованных библиотеки и крайняя чувствительность и мощности NGS анализа можно определить ответственность каждого взаимодействия непосредственно на начальном экране, без необходимости создания домена протеина дополнительные библиотеки для каждого неизбежно белка. NGS позволяет получить всеобъемлющее определение всей domainome любого генно/геномной начиная источника и данных анализа веб-инструмент позволяет получение весьма специфические характеристики с качественной и количественной точки зрения interactome белки доменов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Строительство ORF библиотеки (рис. 1)

  1. Подготовка Вставка ДНК
    1. Подготовка фрагментов из синтетических или геномной ДНК
      1. Экстракт/очищают ДНК, используя стандартные методы26.
      2. Фрагмент ДНК в sonication. Если с помощью стандартного sonicator, как общее предложение начать с 30 s импульсов на 100% выходной мощности.
        Примечание: Пилот экспериментов должно быть сделано с различной мощности и sonication раз, чтобы задать оптимальные условия для подготовки ДНК. После каждого испытания определяют размер фрагментов ДНК электрофорезом геля агарозы.
      3. Загрузите sonicated ДНК на 1,5% агарозном геле, вместе с 100 лестница ДНК bp. Выполните короткий электрофорез на 5 V/см 15 мин и вырезать часть гель, содержащий мазок фрагментированных ДНК.
      4. Очищение дна вставки с комплектом извлечения геля на основе столбцов и измерять концентрацию, используя Спектрофотометр UV.
        Примечание: по крайней мере 500 нг очищенный вставок должны быть получены после этого шага, чтобы быть лигируют с 1 мкг переваривается вектора, как описано в шаге 1.3. Проверьте качество подготовки фрагментов, оценки260nm/A280nm и коэффициенты 230nm/a260nm, поскольку низкого качества образца будут влиять на эффективность перевязки.
      5. Лечить до 5 мкг вставок с 1 мкл быстрый притупления комплект фермента смеси, согласно инструкциям производителя. Инактивации ферментов нагреванием при 70 ° C, за 10 мин образцы можно хранить при температуре-20 ° C до использования.
    2. Подготовка фрагментов из cDNA
      1. Извлечь РНК с стандартными методами (например, с помощью Тризол или аналогичных реагенты).
      2. Фрагмент мРНК при нагревании до выполнения обратной транскрипции. Окончательный длина фрагмента ДНК контролируется мРНК кипения времени и концентрации случайного праймера. Например тепла образец 6 мин на 95 ° C.
      3. Подготовьте cDNA, с использованием случайных праймеров с любых имеющихся комплекта после производителя протокол.
      4. Разрушающим cDNA поли dT хвосты по гибридизации с биотинилированным поли да за 3 ч при 37 ° C и отделить на стрептавидина магнитные шарики, как описано в Carninci et al. 13
      5. Восстановить свободный материал и очистки на основе столбцов ДНК очистки комплект следуя инструкциям производителя. Измерьте концентрацию, используя Спектрофотометр UV. Смотрите примечание в шаге 1.1.1.4.
  2. Подготовка фильтрации вектора
    1. Digest 5 мкг очищенный клонирования вектор pFILTER312 с 10 U EcoRV энзима ограничения, следующие производителя протокол.
    2. Загрузка 2 мкл (200 нг) переваривается вектора, вместе с 100 нг непереваренных вектора и 1 k bp молекулярных маркеров, на геле агарозы 1%, для проверки правильного пищеварения. Тепла инактивирует энзима ограничения.
    3. Добавить 1/10 объема 10 x буфер фосфатазы и 1 мкл (5 ед) фосфатазы и инкубировать при 37 ° C на 15 мин тепловой инактивации за 5 мин на 65 ° C.
    4. Очистить переваривается плазмиды путем извлечения из геля агарозы и измерять концентрацию, используя Спектрофотометр UV. Образцы можно хранить при температуре от-20 ° C до использования.
  3. Перевязка и преобразования
    1. Выполняют лигирование следующим: 1 мкг переваривается плазмида добавить 400 нг фосфорилированных вставок (плазмида: Вставка молярное соотношение 1:5), 10 мкл 10 x буфер для T4 ДНК лигаза, 2 мкл высокой концентрации Т4 ДНК лигаза в окончательный объем 100 мкл. Инкубируйте реакции на густыми 16 ° C GHT. Тепла инактивирует при 65 ° C для 10 мин.
    2. Осадок продукт перешнуровки, добавив 1/10 объема раствора ацетата натрия (3 M, рН 5.2) и 2,5 томов 100% этанола. Смешать и заморозить при температуре-80 ° C для 20 мин.
    3. Центрифуга для максимальной скоростью 20 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    4. 500 мкл холодный 70% этанола в гранулах и центрифуги на максимальной скорости на 20 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    5. Воздух сухой гранулы. Ресуспензируйте осажденный ДНК в 10 мкл воды.
    6. Выполняйте электропорации бактериальной клетки.
      Примечание: Требуется использование высокоэффективных клеток (выше 5 х 109 трансформантов за мкг ДНК). Мы предлагаем использовать Escherichia coli DH5αF' (F'/ endA1 hsd17 (РК − МК +) supE44 Тхи 1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) производится в доме или приобретенные от нескольких производителей.
      1. Место соответствующее количество microcentrifuge трубок и 0,1 см электропорация кюветы на льду. 1 мкл очищенный лигирование раствора (в воде ди) для 25 мкл клеток и Флик трубки в несколько раз.
      2. Передача смеси ДНК клеточной холодной кювета, нажмите на столешницу 2 x, протрите воды от экстерьера кювета, место в пульс электропорации модуль и нажмите.
      3. Выполняют электропорации с машиной стандартного electroporator, с использованием 25 МКФ, 200 Ω и 1,8 кв. Постоянная времени должен быть 4-5 мс.
    7. Сразу же добавить 1 мл жидких 2xYT среды без любой антибиотик, передать тюбик 10 мл и позволяют выращивать при 37 ° C, тряски на 220 rpm для 1 h.
    8. Пластина превращается DH5αF' на 15 см 2xYT плиты агара дополнена 34 мкг/мл Хлорамфеникол (pFILTER сопротивление) и 25 мкг/мл ампициллин (селективный маркер для ORFs) и Инкубируйте на ночь на 30 ° C.
    9. Пластина разведений библиотеки на 10 см 2xYT плиты агара дополнены с хлорамфеникол + Ампициллин и хлорамфеникол только, для выполнения библиотеки титрования. Инкубируйте на ночь на 30 ° C.
  4. pFILTER-ORF библиотеки проверки
    1. Испытания 15-20 колоний от хлорамфеникола и хлорамфеникол/ампициллин пластины для оценки распределения размера вставки. Выбрать один колоний с наконечником и развести их отдельно в 100 мкл 2xYT среды без антибиотиков. Используйте 0.5 мкл этого решения в качестве шаблона дна для реакции PCR, с любой стандартной полимеразы TaqDNA производителя протоколом.
    2. Выполнение 25 циклов усиления с помощью T отжиг 55 ° C и времени расширение 40 s при 72 ° C. Грунтовка последовательности приведены в Таблице материалов.
    3. Загрузка продуктов ПЦР на 1,5% агарозном геле, вместе с 100 bp лестница ДНК и запуск.
  5. Коллекция библиотеки pFILTER-ORF
    1. Собирать бактерий от 150 мм пластин, добавив 3 мл свежего 2xYT среды и жать их с стерильных скребок, тщательно перемешать, дополнить их с 20% стерильный глицерина и хранить при температуре-80 ° C в небольших аликвоты.
    2. Очистить плазмида ДНК из одной Алиготе библиотеки (перед добавлением глицерин) с использованием комплекта добычи на основе столбцов плазмида, следуя инструкциям производителя.
    3. Измерьте концентрацию с Спектрофотометр UV. Образцы можно хранить при температуре-20 ° C до использоваться для подготовки библиотека phagemid и/или характеристика NGS.

2. subcloning из отфильтрованных ORFs в векторе Phagemid (рис. 2)

  1. Подготовка ORF фильтрации фрагментов ДНК
    1. Настройка Пищеварение энзима ограничения 5 мкг очищенный вектора из вектора библиотека pFILTER-ORF, добавление 10 U BssHII и инкубации согласно протоколу производителя. Инактивирует фермент и дайджест с 10 U NheI.
    2. Загрузите переваривается ДНК на 1,5% агарозном геле, вместе с 100 лестница ДНК bp. Выполнение короткого электрофорез на 5 V/см 15 мин или просто достаточно отличить мазок подакцизным фрагментов и вырезать часть геля, содержащего их.
    3. Очищение дна вставки с комплектом гель колонке база добычи и измерять концентрацию, используя Спектрофотометр UV.
  2. Подготовка phagemid ДНК
    1. Настройка Пищеварение энзима ограничения 5 мкг27 очищенный pDAN5 для вставки.
    2. Очистить переваривается плазмида, идущий переваривается ДНК на 0,75% агарозном геле и извлекать из геля с набором на основе столбцов.
    3. Измерьте концентрацию, используя Спектрофотометр UV. Образцы можно хранить при температуре от-20 ° C до использования.
  3. Перешнуровка Библиотека, трансформации и коллекции
    1. Выполняют лигирование и преобразования, как описано для pFILTER вектора.
    2. Пластина превращается DH5αF' на 150 мм 2xYT плиты агара дополнена 100 мкг/мл Ампициллин и Инкубируйте на ночь на 30 ° C.
    3. Пластина разведений библиотеки на 100 мм 2xYT плиты агара дополнена 100 мкг/мл ампициллин, чтобы определить размер библиотеки.
    4. Выполните проверку библиотека методом ПЦР случайно выбранный клонов, как описано в шаге 1.4.
    5. Собирать библиотеку phagemid-ORF, уборки бактерий от 150 мм пластин, тщательно перемешать, дополнить их с 20% стерильный глицерина и хранить при температуре-80 ° C в небольших аликвоты.
    6. Очищайте плазмида ДНК из одной Алиготе библиотеки, используя набор для добычи на основе столбцов плазмида, следуя инструкциям производителя.
    7. Измерение концентрации в спектрофотометре УФ. Образцы можно хранить при температуре-20 ° C до использоваться для характеризации NGS.

3. Фаговые библиотеки подготовка и процедура отбора

  1. Фаговые производство
    1. Разбавить запасов Алиготе библиотеки phagemid в 10 мл жидкого бульона 2xYT дополнена 100 мкг/мл ампициллин для того чтобы иметь ОД600nm = 0,05.
    2. Растут 5 - 10 раз больше, чем исходный объем разреженных библиотеки в стерильную колбу, при 37 ° C при встряхивании в 220 об/мин, до тех пор, пока достигнет OD600nm = 0.5.
    3. Заразить бактерий с помощником фаг (например M13K07) в разносторонности инфекции 20:1. Оставьте при 37 ° C на 45 мин с случайные агитации (каждые 10 минут).
    4. Центрифуга бактерий на 4000 x g 10 мин при комнатной температуре. Отменить супернатанта, вновь приостановить Пелле бактерий в 40 мл жидкого бульона 2xYT дополнена ампициллин 100 мкг/мл и 50 мкг/мл канамицин и расти на 28 ° C с встряхивания на 220 об/мин для ночлега.
    5. На следующий день после, центрифуги бактерий на 4000 x g 20 мин при 4 ° C. Соберите супернатанта, содержащие бактериофаги.
  2. ПЭГ высыпание бактериофаги.
    1. Добавить 1/5 объем 0,22 мкм фильтруемый PEG/NaCl решение (20% w/v PEG 6000, 2,5 М NaCl) очищается бактериофаги и инкубировать на льду за 30-60 мин.
      Примечание: Решение стало дымный после нескольких минут, указывающий успешное Фаговые осадков. Облачность решения будет увеличиваться со временем инкубации.
    2. Центрифуга на 4000 x g 15 мин при 4 ° C. Белый Малый Пелле бактериофаги лягут.
    3. Ресуспензируйте в 1 мл стерильного PBS. Трансфер в 1,5 мл трубки и центрифуги на 4 ° C на 10 мин на максимальной скорости, чтобы удалить загрязнения бактерий. Станут коричневые Пелле.
    4. Супернатант передачи, содержащие бактериофаги к новой пробке. Держите бактериофаги на льду для выбора последовательных титрования и ФАГ.
  3. Фаговые титрования
    1. Подготовьте серийных разведений Фаговые решения. Положите 10 мкл раствора ФАГ в 990 мкл PBS для получения 10-2 разрежения. Разбавьте снова этот препарат, чтобы сделать 10-4 и от этого получить разбавления 10-6 .
    2. Расти DH5αF' клеток бактерий в жидкой среде 2xYT при 37 ° C при встряхивании до од600nm = 0,5 достигается. Передача 1 мл подготовленный бактерий в 1,5 мл трубку и сразу же заразить с 1 мкл Фаговые разбавления 10-4 . Инкубируйте без тряски при 37 ° C на 45 мин повторить ту же процедуру для разбавления 10-6 .
    3. Пластина разведений зараженных бактерий в 100 мм 2xYT пластины. Установите пластину на 30 ° C на ночь.
    4. Пластина 100 мкл неинфицированных DH5αF' на табличке агар 2xYT дополнена 100 мкг/мл ампициллин проверить отсутствие загрязнения в подготовке.
    5. На следующий день после подсчитать количество колоний и рассчитать титр ФАГ. Экспресс титр как количество бактериофаги/мл. Ожидаемые титр составляет 10-12-13 бактериофаги/мл.
  4. Фаговые выбор
    1. Фаговые выбор, используя в качестве наживки очищенные антитела
      1. Saturate бактериофаги путем разбавления 200 мкл препарата ФАГ в равным объемом PBS - 4% сухого обезжиренного молока и инкубировать 1 час при комнатной температуре в медленное вращение. Этот шаг позволяет настроить блокирование бактериофаги для неспецифической привязки. Передать 30 мкл белка G с покрытием магнитные бусы 1,5 мл.
      2. Мыть два раза следующим: 500 мкл PBS, инкубировать на колесе в медленное вращение на 2 мин при комнатной температуре, обратить бисер на одной стороне трубки с помощью магнита и удалить супернатант.
      3. Инкубируйте насыщенных бактериофаги промывают бисером на 30 минут при комнатной температуре с медленным вращением.
      4. Нарисуйте бисер с одной стороны, с помощью магнитного поля. Соберите супернатанта, содержащий бактериофаги использоваться для выбора шага.
      5. Подготовьте магнитные бусы при выполнении на предыдущем шаге, спряжение очищенных антител. Вымойте 30 мкл белка G с покрытием магнитные бусы, как описано выше. Разбавить 10 мкг очищенных антител в 500 мкл PBS, Добавить промытый бусины и инкубировать в медленное вращение при комнатной температуре 45 мин мыть дважды с PBS.
        Примечание: Выполнение двух различных препаратов магнитных шариков: один с антителами интерес и один с управления антител, например, антитела, очищенного от здоровых доноров. Последовательность, антигенов, выбранные с контролем, что антитела вычитаются на этапе анализа результатов. В качестве альтернативы магнитные бусы, нагруженные антителами управления может использоваться для выполнения предварительной очистки шаг бактериофаги (следовать протокол для инкубации с ООН конъюгированных бисером).
      6. Фаговые выбор: рисовать бусы на одной стороне трубки с помощью магнита, удалить последний мыть, добавить бактериофаги и проинкубируйте с медленного вращения при комнатной температуре за 90 минут Вымойте 5 раз с 500 мкл PBS-0.1% Tween-20 и 5 раз с PBS.
      7. Элюировать привязанных бактериофаги, представляющий результат выбора, путем смешивания бисер с 1 мл раствора DH5αF' клеток, выращенных на од600 = 0.5. Инкубируйте бактерий с бисером для 45 минут при 37 ° C встряхивании периодически (каждые 10 минут). Пластина вывода на 150 мм 2xYT агар тарелку с 100 мкг/мл ампициллина.
      8. Пластина 100 мкл неразбавленной и различных разведениях вывода (10-1 -10-5) для выполнения титрования. На следующий день после сбора бактерий от 150 мм пластин, добавив 3 мл свежего 2xYT среды и жать их с стерильных скребок, тщательно перемешать, дополнить их с 20% стерильный глицерина и хранить при температуре-80 ° C в небольших аликвоты.
      9. Растут один Алиготе снова, чтобы выполнить второй раунд отбора. Повторите все панорамирования процедуру, как описано выше, за исключением условия стирки. В этом случае мыть 10 раз с PBS - 1% Tween-20 (Залейте раствор в трубе и вылейте снова немедленно). Затем добавить 500 мкл PBS и инкубировать на вращение при комнатной температуре за 10 мин выполняют другие 10 стирок с PBS. Перейдите к шагу элюции как первый раунд отбора.
      10. Извлечь плазмида ДНК из одной Алиготе вывода с помощью набор на основе столбцов, следуя инструкциям производителя. Хранить плазмида при-20 ° C до тех пор, пока он будет использоваться для глубокого последовательности.
    2. Фаговые выбор, используя в качестве наживки рекомбинантных белков
      1. Saturate бактериофаги путем разбавления 200 мкл препарата ФАГ в равным объемом PBS - 4% сухого обезжиренного молока и инкубировать 1 час при комнатной температуре в медленное вращение.
      2. 100 мкл стрептавидина магнитные бусы. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре для выбора бактериофаги стрептавидина привязки. Удаление стрептавидина привязкой бактериофаги, нарисовав бисер в одну сторону с помощью магнита. Возьмите супернатанта из предыдущего шага и добавить биотинилированным белка (в концентрации 100-550 Нм) и инкубировать на ротор при комнатной температуре за 30 мин до 1 часа.
      3. Подготовить магнитные бусы: при выполнении предыдущего шага, мыть 100 мкл стрептавидина магнитные бусы с PBS, Ресуспензируйте в PBS 2% сухого обезжиренного молока и проинкубируйте с вращения при комнатной температуре за 30 мин до 1 часа.
      4. Фаговые выбор: рисовать бусы на одной стороне трубки с помощью магнита, удалить PBS - 2% молока и Ресуспензируйте бусины с ФАГ белка смесь. Проинкубируйте с медленного вращения при комнатной температуре 90 мин.
      5. Рисовать бусы на одной стороне трубки с помощью магнита, удалить супернатант и мыть их тщательно пять раз с 500 мкл PBS 0,1% Tween-20. Выполните элюции, как описано в предыдущей сессии.

4. Фаговые библиотека глубокую виртуализации платформы (рис. 3)

  1. ДНК вставляет восстановления от pFILTER-ORF-библиотеки, pDAN5-ORF-библиотеки или выбран ФАГ библиотек
    1. Размораживание одного Алиготе библиотеки, количественно с помощью спектрофотометра, восстановить вставками ДНК путем усиления с конкретными грунтовки.
      Примечание: Праймеры, используемый для спасения вставки связаны в конце их 5' для адаптеров последовательностей, таким образом позволяя последовательных индексации ампликон бассейнов получены и прямого секвенирования ДНК вставок восстановлены с помощью синтезаторов. В Таблица материалових последовательность. Сетевые адаптеры жирным шрифтом, и конкретные праймеры выделены курсивом.
    2. 2.5 мкл (pFILTER/phagemid/выбран ФАГ) библиотеки можно используйте в качестве шаблона дна для реакции PCR.
    3. Используйте следующую программу: 95 ° C 3 мин; 25 циклов 95 ° c за 30 сек, 55 ° C за 30 сек, 72 ° C для 30 s; 72 ° C для удержания 5 мин при 4 ° C.
      Примечание: на данном этапе рекомендуется для запуска 1 мкл продукта PCR на Bioanalyzer или TapeStation, чтобы проверить размер ампликонов и проверить, что они находятся в допустимом диапазоне.
  2. Очистке PCR
    1. Магнитные бусы (например, AMPure) довести до комнатной температуры. Передать весь продукт PCR от ПЦР-пробирку 1,5 мл. Вихревые магнитные шарики для 30 s, чтобы убедиться, что бисер равномерно рассредоточены. 20 мкл магнитной бусины, к каждой трубе, содержащие продукт PCR, микс от нежно закупорить. Инкубации при комнатной температуре без встряхивания в течение 5 мин.
    2. Место пластину на магнитного стенд на 2 мин или до тех пор, пока расчистил супернатант. С продуктов ПЦР на магнитную подставку снимите и выбросьте супернатант.
    3. Вымойте бусины с свежеприготовленные 80% этанола, с продуктов ПЦР на магнитного стенд, следующим: 200 мкл свежеприготовленные 80% этанола для каждого образца хорошо; инкубировать пластину на магнитного стенд для 3 s; Осторожно снимите и выбросьте супернатант.
    4. Выполните второй мыть этанола, с продуктов ПЦР на магнитную подставку; в конце второй мыть тщательно удалить все этанола и позволяют бисером высохнуть за 10 мин.
    5. Удаление продуктов ПЦР из магнитного стенд, 17,5 мкл 10 мм трис рН 8,5 к каждой трубе, нежно Пипетка вверх и вниз в 10 раз, убедитесь, что бусины полностью высокомобильна. Инкубации при комнатной температуре на 2 мин.
    6. Поместите трубки на магнитного стенд на 2 мин или до тех пор, пока расчистил супернатанта, тщательно передачи 15 мкл супернатанта, содержащих чистые продукты PCR для новой 1,5 мл трубки. Храните очищенные продукты PCR при-15 ° C до-25 ° C до недели, если не приступить немедленно к индекс PCR.
  3. Индекс PCR
    Примечание: После очистки ПЦР, выполните индекс PCR. Используйте комплект Nextera XT индекс; Таким образом можно будет последовательность результате двойной индексированных библиотек в мультиплексированном Illumina бежит.
    1. Перевести все 15 мкл, содержащие каждый продукт очищается в новой ПЦР-пробирку и настроить следующими содержащие реакции: 15 мкл очищенный ампликон продукта, 5 мкл индекс грунтовка 1 и 5 мкл индекс грунтовка 2, 25 мкл 2 x PCR смеси; Окончательный объем 50 мкл.
    2. Выполнять ПЦР на тепловая велосипедист, используя следующую программу: 95 ° C в течение 3 мин, 8 циклов 95 ° c за 30 сек, 55 ° C за 30 s, 72 ° C для 30 s; 72° C за 5 мин, затем провести на 4 ° C.
  4. ПЦР-очистки 2
    1. Следовать за тот же протокол, описанные в разделе 4.2 для ПЦР убирать со следующими изменениями: в первом шаге мкл 56 магнитной бусины для каждого 50 мкл продукта PCR.
    2. Ресуспензируйте бисер в 27,5 мкл 10 мм трис рН 8,5 на заключительном этапе очищения и передачи 25 мкл новой трубки (это очищенный окончательный библиотека готовых для количественной оценки и затем последовательности).
    3. Храните пластины при-15 ° C до-25 ° C до недели, если не приступить к библиотеки количественной оценки.
  5. Качественные и количественные оценки последовательности библиотеки
    1. После очистки, запустить 1 мкл 1:10 разрежения окончательный библиотеки на bioanalyzer, чтобы проверить размер и количественно это выбор региона окончательный Библиотека трассировки.
    2. Параллельно выполните библиотека количественной оценки в реальном масштабе времени PCR с помощью библиотеки комплекта количественной оценки за производителя протокол.
  6. Библиотеки виртуализации
    1. Бильярд двойного индексированного библиотек, производится вместе с других библиотек двойного индексированного последовательности. Считывает последовательность, которую долго читает этот вид библиотеки, создавая, по крайней мере 250 bp парных конец с помощью Hiseq2500 или MiSeq инструментов для получения в первом случае 250bp PE читает и в втором случае 300 bp PE.

5. Bioinformatic данных анализа с помощью Interactome-Seq веб-инструмент

  1. Анализируйте читает, возникла из библиотеки pFILTER/phagemid/выбран ФАГ последовательности с Interactome-seq конвейер данных анализа. Веб-инструмент свободно доступен по следующему адресу: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод фильтрации схематизируются на рисунке 1. Каждый вид intronless ДНК может использоваться. На рисунке 1A представлена первая часть фильтрации подхода: после загрузки на геле агарозы или bioanalyzer, хороший фрагментация ДНК интерес появляется как мазок фрагментов с распределение длины в желаемый размер 150-750 ВР. Дается образ представителя виртуальный гель фрагментированной ДНК получены. Фрагменты загружены на геле агарозы з...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание высокого качества весьма разнообразны ORFs отфильтрованных библиотеки является первым важным шагом в рамках всей процедуры так, как оно повлияет на все последующие шаги трубопровода.

Важной особенностью выгодно нашего метода является, что любой источник (intronless) ДНК (cDNA, геномной ДНК, ПЦР получены или синтетических ДНК) подходит для строительства библиотеки. Первый параметр, который следует принимать во внимание это, что длина фрагментов ДНК, клонированные в pFILTER вектор долже...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грант от министерства образования Италии и университета (2010P3S8BR_002 КТ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ультразвуковой гомогенизатор SonopulsBandelinHD2070или аналог
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo ScientificSM0321или аналог
GeneRuler 1 kb DNA LadderThermo Fisher ScientificSM0311или аналог
Molecular Biology AgaroseBioRad161-3102или аналог
Green Gel PlusFisher Molecular BiologyFS-GEL01или эквивалентный
6x ДНК-загрузочный красительThermo Fisher ScientificR0611или эквивалентный
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704или эквивалентный
Quick Blunting KitNew England BiolabsE1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis спектрофотометрThermo Fisher ScientificND-2000
Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкостиThermo Fisher Scientific4368813
магнитные шарики стрептавидинаNew England BiolabsS1420Sили эквивалентный
набор для очистки QIAquick PCRQiagen28104или эквивалент
EcoRVNew England BiolabsR0195L
Антарктическая фосфатазаNew England BiolabsM0289S
T4 ДНК-лигазаНовая Англия BiolabsM0202T
Ацетат натрия 3M pH5.2общий лабораторный поставщик
этанол для молекулярной биологииSigma-AldrichE7023или эквивалент
DH5aF' бактериальные клеткиThermo Fisher Scientific
0,2 мл пробиркиобщего лабораторного поставщика
Пробирки 1,5 млобщий лабораторный поставщик
0,1 см ЭлектропораторBiosigma4905020
Электропоратор 2510Eppendorf
2x YT среднийSigma-AldrichY1003
Ампициллин натриевая сольSigma-AldrichA9518
ХлорамфениколSigma-AldrichC0378
DreamTaq ДНК-полимеразаThermo Fisher ScientificEP0702
Смесь растворов дезоксинуклеотидов (dNTP)Новая Англия BiolabsN0447S
96-луночный термоамплификатор (с подогреваемой крышкой)общий лабораторный поставщик
150 мм пластиныназначения
ГлицеринSigma-AldrichG5516
BssHIINew England BiolabsR0199L
NheINew England BiolabsR0131L
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104или эквивалент
M13KO7 Helper PhageGE Healthcare Life Sciences27-1524-01 
Сульфат канамицина из Streptomyces kanamyceticusSigma-AldrichK1377
Полиэтиленгликоль (ПЭГ)Sigma-AldrichP5413
Глорид натрия (NaCl)Sigma-AldrichS3014
PBSобщий лабораторный поставщик
Dynabeads Protein G для иммунопреципитацииThermo Fisher Scientific10003Dили аналог
MagnaRack Магнитный сепарационный штативThermo Fisher ScientificCS15000или аналог
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Обезжиренное сухое молокоEuroCloneEMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems, Fisher Scientific7958935001
AMPure XP бусиныAgencourt, Beckman CoulterA63881
Nextera XT dual IndexPrimersIllumina FC-131-2001 или FC-131-2002 или FC-131-2003 или FC-131-2004
MiSeq или Hiseq2500Illumina
SpectrophotomerNanodrop
Agilent Биоанализатор или TapeStationAgilent
Forward PCR праймеробщий лабораторный поставщик5' TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3'
Праймер для обратной ПЦРобщий лабораторный поставщик5' TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3'
Прямой праймер дляпоставщика NGS для общей лаборатории5' TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3';
Обратный праймер дляобщего лабораторного поставщика5' GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';
общего NGS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
  2. Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170(2007).
  3. Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284(2007).
  4. Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867(2010).
  5. Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
  6. Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
  7. DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
  8. Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  9. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  10. Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110(2010).
  11. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
  12. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).
  13. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
  14. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  15. Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
  16. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  17. Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
  18. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  19. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
  20. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
  21. Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
  22. Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
  23. Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
  24. Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
  25. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  26. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146(2003).
  27. Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
  28. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  29. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421(2009).
  30. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
  32. Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
  33. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
  34. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).
  35. Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
  36. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Domainome LibraryPhage DisplayNext Generation SequencingORF Library ConstructionGel ElectrophoresisDNA LigationElectroporationAntibiotic SelectionPlasmid PurificationNGS Analysis

Related Articles