Визуализация корковых модулей в плоский млекопитающих коре

Некоторые из наиболее значительных изменений в структуре мозга через филогении можно наблюдать в коре. Несмотря на существенные различия коры животных общей схеме и может быть широко разделены двумя разными способами, слои и области¹. Кортикального слоя лежат параллельно поверхности головного мозга и различаются в номер из 3 слоев в рептилиям коре² 6 слоев в млекопитающих коре¹. С другой стороны корковых областях коры отдельных регионов, которые в основном соответствуют различных функций, например, соматосенсорной коры участвует в ощущение касания или зрительной коры в обработке визуальных материалов. Эти корковых областях часто подразделяются³патчи или модули, которые регулярно повторяем анатомические структуры, по существу нашли параллельно сетчаточных поверхности головного мозга. Корковых модулей может ограничиваться конкретной слой⁴, или продлить через несколько слоев⁵.

Стандартные секущей методы мозга включают разделы, нормальное к поверхности головного мозга, как коронковой или сагиттальной. В то время как эти методы могут использоваться для визуализации корковых модули, множество интересных особенностей могут быть выявлены при кортикальной модули визуализируются вскользь, в плоскости, параллельной поверхности головного мозга. Например соматосенсорные модули в грызунов мозга, представляющие усы, появляются как баррелей когда визуализирована нормали к поверхности мозга, и таким образом регионы получают имя ствол коры. Однако на визуализации баррелей в касательной ориентации, они показывают столбик карта, с бочки изложены в топографических ориентации зеркального отображения точное расположение усы на поверхности внешней тела. В некоторых случаях, Модульная композиция даже избежал обнаружения на значительные периоды, когда визуализирована в не тангенциальные манере. Медиальный entorhinal коры, известен за наличие сетки клеток, нейронов, которые огонь в шаблоне регулярного гексагональной, когда животное обход среды. Несмотря на то, что это сильно исследованной площади, до недавно, наличие пятен или модули клеток в медиальной entorhinal коры, которые физически располагаются в гексагональной шаблон⁶, бежал обнаружения. Наличие и расположение этих модулей, в мозге крыс, способствовали, сделав тангенциальная разделы медиальный entorhinal коры и расследования cytoarchitecture послойного образом.

После разрезания, конкретный аспект визуализации корковых модулей также может быть реализована несколькими способами. Классически исследования очерчены модулей на основе клеток плотность или волокна макет¹. Еще один популярный подход является использование цитохрома оксидазы гистохимии, который показывает области выше деятельности⁸. Новые подходы включают в себя глядя на типы генетически детерминированных клеток, различие на основе их белков выражение профили^6,8.

В этом исследовании мы подчеркиваем методы изолировать коры от млекопитающих мозги, получить плоский тангенциальная секций и визуализировать корковых модулей на основе гистохимии цитохрома оксидазы и иммуногистохимии камерного типа специфических белков.

Все экспериментальные процедуры выполнялись согласно немецкой руководящие принципы защиты животных под руководством комитетов местных этики (LaGeSo). Человека и Бат мозга данные были получены от Науманн et al. ⁵ Следующая процедура выполняется на мужской взрослых крыс Wistar (штамм: RJHan:WI).

1. перфузии и извлечения головного мозга

Примечание: Чтобы получить содержанием однородно фиксированной и без крови мозга, transcardial перфузии животного приветствуется, как остаточной крови повышается неспецифическая фонового сигнала во время окрашивания. Тем не менее это также можно получить уплощенных секции от ООН перфузии образца и их выведение. Простота обработки образца зависит от концентрации фиксатором используется. Слишком мало фиксации увеличивает риск обработка повреждение головного мозга во время уплощение и резки, в то время как слишком высокие концентрации ниже гибкость для рихтовки и качество окрашивания сигнала.

1. Transcardially perfuse животного, с иглой 23G. Для более подробного руководства см. Гейдж и др. ⁹
   1. Использование фосфат буфер солевой¹⁰ (PBS; 0,02 М; рН 7,4), чтобы избавиться от крови от мозга и тела животного. Продолжайте, пока инфузия жидкости появляется ясно, по крайней мере 150 мл PBS, проникнуты через сердечно-сосудистой системы.
      Примечание: Лучшие результаты достигаются при давлении похож на спектр физиологических артериального давления увлажненную животного (например, крыса: 120-130 мм рт.ст.). При необходимости добавьте в решение во избежание свёртывания крови¹¹гепарина (10 ед/мл).
   2. Чтобы исправить мозга, transcardially влить минимум 100 мл параформальдегида¹² (ПФА, 4%; в 0,1 М фосфатного буфера (PB)¹³) до тех пор, пока шею животного жесткой.
      Предупреждение: PFA является потенциальным канцерогеном.
      Примечание: Для гистохимические активности, окрашивание, такие как цитохрома-оксидазы, наилучшие результаты достигаются, при использовании 2% PFA. Для других окрашивание, например иммуногистохимии, 4% PFA является предпочтительным.
2. Экстракт мозг от черепа.
   Примечание: См. Гейдж и др. ⁹ для деталей.
   1. Изолируйте головы, с использованием больших ножницы или кости ножницы.
   2. С помощью тонкой ножницами, вырезать кожу вдоль средней линии от шеи к носу. Тяните за исключением кожи, чтобы разоблачить черепа. Удаление шеи и височной мышцы с помощью тонкой ножницы.
   3. Сделайте срединной прорваться через кость инков, начиная от затылочного до теменной кости.
   4. Используйте Rongeurs чтобы слезает инков кости. Сдвиньте тонкой ножницы вдоль Сагиттальный шов и отрезать от заднего конца теменной до конца передней лобной кости.
   5. Используйте Rongeurs чтобы слезает с теменной и лобной кости. Кроме того Поднимите кости с помощью щипцов. Используйте ложку сократить шнуры воспалении брюшины и удалить мозга. Переводить мозг PB (0,1 М; рН 7,4).
3. Исправить ООН перфузии мозга путем погружения в 4% PFA для 1-3 ч при температуре 4 ° C (в зависимости от размера мозга и зонд: белозубка: ~ 1 ч, человека: ~ 3 часа).
   Примечание: Для больших и gyrencephalic мозги, как люди, изолировать и вырезать из области, представляющие интерес для сокращения времени фиксации.
4. Чтобы получить больше корковых областях в секции, сгладить мозга до дальнейшего после фиксации; Перейдите к шагу 2. Однако, чтобы получить разделы труднее достичь областях как медиальный entorhinal коры, пост исправить мозга в 4% ПФА за 24 часа, прежде чем перейти к шагу 2.

2. мозг диссекции и уплощение

1. Отдельных полушарий мозга с помощью лезвия бритвы (lissencephalic мозги) или скальпель (gyrencephalic мозги).
   Примечание: Если не пост Исправлена головном мозге, она чувствительны к повреждениям, обработки.
2. Необязательный шаг за пособничество последующего раздела регистрации и усадки оценки:
   1. Прокол коры в районе непроцентных, с иглой 35G, нормальное к поверхности коры головного мозга. Повторите шаг два раза на определенных расстояниях вдоль корковых листа. Для определения расстояния вдоль корковых листа, использовать заранее сократить поток на фиксированной длины (например, 5 мм) и заложить его вдоль поверхности коры, чтобы определить точки прокола.
3. Lissencephalic мозги: удалить подкорковых структур с использованием рассечения шпателем. Критической: Держите мозг влажным с PB (0,1 М; рН 7,4) на протяжении всей процедуры.
   1. Держать мозг, мозжечок и аккуратно вставьте лопатку чтобы открыть плоскости рассечение в мозолистого. Круглым наконечником шпатель должен указывать от коры.
   2. Сдвиньте шпатель далее и осторожно потяните шпатель находится между таламус и коры. Отдельные подкорковых структур с царапинам ходатайствам.
   3. Осмотрите полушария для равномерной толщины.
      Примечание: Любой неровной регионов может привести к Транс слой градиента при резании. Для тангенциальной секционирование, используйте скальпель сделать чистый срез через мозг, параллельно поверхности сетчаточных региона, из которого желательны тангенциальная секции.
   4. Дополнительные шаги для улучшения качества выравнивания:
      1. Сделать чистая прорезать стриатума, прилежащем ядре и орбитофронтальной коры, так как они увеличивают толщина коры в боковой области. Кроме того добавьте снятия вырезать на базе региона Внутренняя префронтальной коры, которая позволяет разворачивается медиальной части коры головного мозга.
   5. Место полушария (коры вниз) на стеклянное скольжение. Перейдите к шагу 2.6.
4. Gyrencephalic мозги: удалить белого вещества разворачиваться Извилин (подробные протоколы, см.: Sincich и др. ¹⁴; Tootell Сильверман и¹⁵). Критической: Использование PB (0,1 М; рН 7,4), чтобы держать мозг влажной на все времена.
   1. Положите области интересов на влажной бумаге фильтра в большой Петри, с коры вверх.
   2. Удаление паутинной мембраны и Пиа, используя два щипцами.
   3. Использование влажной ватным тампоном и аккуратно вставьте в каждом борозды для отсоединения спайки между извилин.
   4. Повернуться мозга с помощью другой влажной фильтр-бумаги.
   5. Используйте две изогнутые микро шпатели разворачиваться единого извилин. Используйте выпуклой стороне шпатели дразнить помимо белого вещества до достижения рядом с вогнутым концом извилины. Использование влажной ватным тампоном и приступить к закрученного движения достичь вогнутым концом извилины.
   6. Дразнить друг от друга одной извилин. При необходимости добавьте небольшое облегчение отрубы если напряжение слишком высока.
   7. Придавить развернулось мозга в чашке Петри или подобный контейнер.
5. При необходимости место большие мозги на фильтровальной бумаги охватывает губку, чтобы обеспечить, что регионы не высохнуть.
6. Место два проката куски глины с обеих сторон. Критической: Как толщина глины определяет, сколько полушария может быть выровнена, убедитесь, что глина 10-20% тоньше, чем ООН уплощенных коры.
7. Аккуратно нажмите второй стекла слайд и малых Петри на коре, до тех пор, пока полушария полностью плоская. Чтобы получить наилучшие результаты для нужного региона, место стеклянное скольжение сначала на соответствующей области. Чтобы получить наилучшие результаты для lissencephalic мозги, место стеклянное скольжение тангенциально в боковой части сначала и концентрированного давления на этот регион.
8. Положить вес (например, керамические часы стекло) на стекло слайды/Петри и придавить полушария для 3-5 ч при температуре 4 ° C в PB.
9. После фиксации выпустить давление и удалить стеклянных скольжениях. Положите уплощенных полушария в PFA (свободное плавание) для 24 h на шейкер на 4 ° C.
   Примечание: Лучшие результаты для stainings гистохимические деятельности достигаются при использовании 1% PFA. Для других stainings, например, иммуногистохимия, для ООН перфузии мозга, 2%, PFA может быть использован.

Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса для рихтовки крыса коры полушария и визуализация модулей в соматосенсорной коры. После transcardial перфузии, расчлененный мозг мыши (A). Подкорковых структур были удалены и коры было уплощенная между двумя слайдами стекла в фосфатного буфера (B). Плоский полушария (C) после фиксированной, вскользь секционного и витражи для активности цитохрома оксидазы (D). Масштаб баров = 1 см. R: Ростральные, C: каудально, L: боковое, M: медиальной. Адаптировано из Лауэр et al. рисунок ²³ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Резка тангенциальная разделы

Примечание: В зависимости от требований пятная протоколы, процедуры резки и толщина может быть адаптирована. Vibratome был использован для вырезать полусферы для дальнейшей гистохимические обработки (шаг 3.2) на 80-150 мкм. Однако для обработки иммуногистохимии, тоньше секции желательны и замораживания микротом использовался для резания (шаг 3.3) на 10-60 мкм. Смотрите видео 1.

1. Мыть уплощенных полушария в PB (0. 1 m; рН 7,4) за 15 мин.
2. Вырежьте полушария на vibratome.
   1. Место полушария касательной на держателе нарезки. При необходимости снова нажмите мягко с стеклянное скольжение перед закреплением в положении (например, с суперклей).
      Примечание: Минимизируйте количество клея, потому что резки артефакты могут привести из-за небольшой толщины плоский полушарий.
   2. Вырежьте полушария от конца толще и более стабильной в конце тоньше (кзади передний, здесь) на требуемой толщины. Перейдите к шагу 3.4.
      Примечание: Если использовались фиксации низкой концентрации, разрезать его на медленной скорости и высокой амплитудой.
3. Вырежьте полушария на замораживание микротома.
   1. Cryoprotect мозга, погружая его в растворе сахарозы 30% (в PB) пока он тонет.
      Примечание: В зависимости от размера ткани, будучи cryoprotected, тонущий в решении может варьироваться от нескольких часов до нескольких дней. Для более крупных мозг может считаться криозащиты альтернативные методы (см. Rosene и др. ¹⁶).
   2. Формируют ледяной базы на замораживание микротом для монтирования в мозг. Постройте ледяной базы путем замораживания PB на лице блок замораживания микротома. Критической: Обеспечить параллельно лезвию микротом поверхности льда базы. Для этого, вырежьте пустой льду базы с помощью ножа микротома точно выровнять параллельно поверхности режущей базы льда.
   3. Внедрить в замораживания среднего мозга и смонтировать его в блок лицо микротом с области интересов параллельно поверхности блока. Лицо сетчаточных поверхности головного мозга к блок лицо микротома. Критический: Отрегулируйте температуру застывания в зависимости от размера выборки; более высокие температуры обеспечить лучшее раздел целостность при резании, но крупные разделы требуют более низких температурах для замораживания образца равномерно.
   4. Вырежьте мозг тангенциально в требуемой толщины (медленнее и единообразных резания привести лучшее качество секции).
4. Мыть в подразделах PB 15 мин на шейкер.

Видео 1: схема видео тангенциальная вырезание из крыса медиальный entorhinal коры и компоновки модулей parasubicular и entorhinal. Медиальный entorhinal коры головного мозга, грызун расположен в задней части коры и наклонен в сторону медиальной и брюшной. Тангенциальный секций получаются путем ориентации ножом вдоль этот угол. Следовательно соответствующие ячейки тип специфического окрашивания показывает модульных конструкций в медиальной entorhinal коры и прилегающих parasubiculum. Видео взято из Рэй и Брехт⁸. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

4. Визуализация корковых модулей с использованием цитохрома оксидазы пятнать

Примечание: Различные пятная протоколы разработаны для гистохимические обнаружения активности цитохрома оксидазы, например, сначала Вонг-Райли¹⁷ и позднее изменена Divac et al. ¹⁸ этот протокол основан на один Дивац и др. ¹⁸, поскольку использование никель аммония сульфат (Ниасе) приводит к более высокий контраст и лучше определенные модули в окрашенных областей коры головного мозга.

1. Подготовьте цитохрома-оксидазы, окрашивание раствора (см. Дивац и др. ¹⁸). 10 мл раствора, добавить: 10 мл HEPES буфера (0,1 М, рН 7,4), 400 мг сахарозы, 12,5 мг Ниас, 2 мг цитохрома C, 6 мг Диаминобензидин (DAB).
   Предупреждение: DAB и Ниасе являются канцерогенными.
   Примечание: Добавьте DAB только до инкубации секций.
2. Вымойте разделы в буфере (0,1 М, рН 7,4) HEPES на шейкер для 15 мин.
3. Инкубируйте в подразделах окрашивание раствора при комнатной температуре на шейкер.
   Примечание: Соблюдайте скорость окрашивания. Если есть нет видимых реакции, измените для инкубации при температуре 37 ° C. В зависимости от количества фиксации окрашивание может наблюдаться после 10 минут или несколько часов.
4. Остановить реакции путем добавления 4% PFA; Это предотвращает нежелательные повторно умирает и увеличение фонового сигнала.
5. Мыть разделы, три раза с помощью HEPES буфер для 10 мин.
6. Монтировать и сухой разделы на стеклянных вставках.
7. Обезвоживает секции с все большее алкоголя строки:
   1. Вымойте слайды в 60% этанола за 1 мин мыть слайды в 80% этанола, за 1 мин мыть слайды в этанол 96% за 2 мин мыть слайды в 100% этанола за 3 мин мыть слайды в изопропиловый спирт для 5 минут вымыть слайды в ксилоле на 5 мин.
8. Немедленно добавьте средство быстрого закалки монтажа, а coverslip. Критический: Не используйте сред на водной основе монтажа, как Ниаса будут размыты и ухудшить окрашивание.
9. Держите разделы на 4 ° C для длительного хранения.

5. Визуализация корковых модулей с помощью иммуногистохимическое окрашивание

Примечание: Несколько протоколов доступны для иммуногистохимии, оптимизированный для образца и типа зонд. Адаптация может производиться при необходимости, различной концентрации антител, permeabilizing агентов и инкубации раз. Следующий протокол приводит к хорошие результаты для обнаружения большой спектр антител и визуализация флуоресцентных зондов.

1. Вымойте разделы в PBS (0,1 М; рН 7,4) за 15 мин.
2. Дополнительно: Выполните извлечение антигена разоблачить эпитоп, с помощью водяной бане (на основе Цзяо et al. ¹⁹; для альтернативных методов см Pileri и др. ²⁰).
   1. Разогреть на водяной бане до 80 ° C. Подготовить tri натрия цитрат буфера¹⁹ (рН 8.0) и разогреть на водяной бане до 80 ° C.
   2. Перенести разделы tri натрия цитрат буфер. Инкубировать в разделах 30 мин при 80 ° C
   3. Прохладный секций до комнатной температуры
   4. Вымойте разделы в PBS на 15 мин.
3. Вымойте разделы два раза в PBS-X (0,5% Тритон-X, в PBS 0,1 М) за 15 мин.
4. Блокировать неспецифических epitopes, инкубации разделы бычьим сывороточным альбумином (БСА; 2,5%) и Тритон-X (0,75%). в PBS в растворе втечение 2 ч.
5. Инкубировать в разделах основное антитело, например, кальбиндин - D28k (1:5 000, 1% BSA в PBS-X), на 2-3 дня на шейкер на 4 ° C.
   Примечание: Оптимальное разведение для первичного антитела зависит от конкретных антитела, используемые. Обратитесь к информации производителя для получения разрежения критерии для специфического антитела. Несколько антитела могут быть использованы вместе, но должны быть заявлены в отношении различных видов.
6. Мыть в разделах три раза в PBS на 15 мин.
7. Инкубируйте разделы на ночь в вторичное антитело (1: 200, 1% BSA в PBS) при 4 ° C на шейкер.
   Примечание: Несколько вторичных антител может использоваться в различных спектрах, если были использованы несколько первичных антител.
8. Смыть вторичные антитела путем промывания в разделах три раза в PBS на 10 мин.
9. Монтировать и сухой разделы на стеклянное скольжение для микроскопии.
   Примечание: Секции по-прежнему должна быть влажной до монтажа coverslip.
10. Применить монтажа средних подходит для флуоресценции красители на разделах ткани и применить coverslip.
11. Сухие разделы за 1 час.
12. Для длительного хранения печать coverslip, используя лак и хранить в темноте при 4 ° C.

Мы получили плоский корковых участков соматосенсорной коры в различных мозги и обработать их для гистохимии цитохрома оксидазы визуализировать somatotopic модулей, представляющих различные части тела. Этот сравнительный подход позволяет изучать эволюционных сил что коры форму, например, показывая очень сохраняется представление mystacial вибриссов в грызуны и Зайцеобразные как бочки21 (рис. 2). В отличие от других частей тела, таких как лапы и гениталии показывают различия в их относительной размер и отражать специализации экологическую нишу или полового отбора22,23.

Чтобы понять архитектуру медиальный entorhinal коры, мы получили разделы параллельно сетчаточных поверхности. Это было достигнуто главным образом по касательной секционирование медиальный entorhinal коры в мышей, крыс и египетские плодоядными летучими мышами. В организме человека из-за значительно больший размер и больше неровности в entorhinal коры, мы осторожно плоский коры после приготовления тангенциального распила entorhinal коры. Впоследствии, все мозги были замораживают и секционного на криостата на 60 µm. иммуногистохимия была выполнена на полученные разделы с антитела анти кальбиндин, чтобы визуализировать модули кальбиндин положительных пирамидальной клетке в медиальной entorhinal Кора5 (рис. 3). Кальбиндин модули в коре entorhinal показывают замечательные периодичности через все эти мозги и различаются по размеру только с коэффициентом 10 через ~ 20,000-fold изменения в мозге размеры5.

Рисунок 2: топографические макет модулей коры ствола через млекопитающих определены цитохрома оксидазы гистохимии. Тангенциальный разделов IV слой из соматосенсорной коры (A) мышь, Когтистая песчанка (B), (C) крысы, дегу (D), (E) хомяка, кролик (F), показаны стволы как высоко сохранены somatotopic представление mystacial вибриссов. Масштаб баров = 500 мкм. M: медиальной, L: боковых, R: Ростральные, C: каудально; Ориентация в A применяется также к B-E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: периодические макет медиальный entorhinal коры модулей через млекопитающих определены иммунореактивности кальбиндин. Тангенциальный разделы из слоя II кора медиальной entorhinal (A) мыши, крысы (B), (C), египетские фрукты bat, и (D) человека, Показать макет сохранены периодические кальбиндин положительных пирамидальной клетке модулей. Масштаб баров = 250 мкм. M: медиальной, L: боковых, D: спинной, V: вентральный, R: Ростральные C: каудально; Ориентация в D также относится к B, C. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.