Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС)-это многофункциональный эпителия глаза. Здесь мы представляем протокол для создания начальных клеточных культур, полученных из мышиных ПЭС.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) является крайне поляризованную многофункциональный эпителия, который расположен между нейронной сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Это один лист пигментных клеток, которые гексагонально упакованы и связаны плотные соединения. Основные функции НПП включают поглощение света, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных сарай, пространственной буферизации ионов, транспорт питательных веществ, ионов и воды, а также активное участие в круговороте визуального. С такие важные и разнообразные функции критически важно для изучения биологии клетки ПЭС. Был создан ряд НПП клеточных линий; Однако пассированный и увековечен клетки известны быстро потерять некоторые Морфологические и физиологические характеристики естественных клеток ПЭС. Таким образом Главные ячейки являются более подходящими для изучения различных аспектов НПП клеточной биологии и функции. Мышь первичной культуре клеток ПЭС является очень полезным для исследователей, поскольку мышь модели широко используются в биологических исследованиях, однако сбор НПП клетки мыши также является очень сложным из-за их малого размера. Здесь мы представляем протокол для создания основного мыши НПП клеточных культур, который включает Энуклеация и рассечение глаз и изоляции листов ПЭС произвести клетки для культивирования. Этот метод позволяет восстановления эффективного клеток. НПП клетки, полученные из двух мышей может достигать confluency на один 12 мм полиэстер мембраны вставьте предварительно загружаются в культуре пластины после одной недели культуры и отображения, некоторые из первоначальных свойств bona fide НПП клетки как гексагональной формы и пигментации после двух недели культуры.
Введение
Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) является один слой поляризованные эпителиальных клеток, расположенный между нейронной сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Функциональность НПП клеток и целостность НПП монослоя имеют решающее значение для видения, потому что НПП играет важную роль в нескольких процессах, таких как поддержание внешний барьер кровь сетчатки, транспорта воды и ионов между сетчатки и Хориоидея, легкий поглощения, защита от окислительного стресса, контроля метаболизма ретиноидов и фагоцитоз внешних сегментов фоторецепторных клеток в1,2. Расположение НПП задней части глаза, а также ее барьерные функции предотвращения наркотиков систематически осуществляется от перехода из крови в стекловидное тело, сделать это трудно изучить сложности НПП функции в естественных условиях. Таким образом существует большая необходимость создания НПП клеточных культур для изучения НПП клетки в гибкой, управляемой среды3,4.
Существует целый ряд установленных НПП клеточных линий, обеспечивая простой и удобный способ получения и хранения клеток; Однако пассированный клетки имеют некоторые недостатки по сравнению с первичной клетки2,3,4. Во-первых они часто характеризуются изменения в морфологии клеток. Например ни один из существующих линий клетки были найдены пригодны для надежного исследование НПП барьерные свойства из-за потери фенотипа клетки полярности и частичного исчезновения плотных4. Помимо потери полярности и надлежащего соединения к ячейке НПП клеточных линий быстро теряют их пигментации из-за отсутствия ключа меланогенеза ферментов в взрослых НПП5. Пигментация может быть восстановлена, но всеобъемлющий анализ механизма повторной пигментации, который будет включать сочетание просвечивающей электронной микроскопии, выражение гена анализ и химических анализов для подтверждения наличия меланина никогда были выполненных6. Еще одно ограничение, что НПП клеточных линий у жизни расширенной клетки (иногда - бессмертие) и при определенных условиях можно превратить в самостоятельного обновления Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые отсоединить от субстрата и форму плавающей колонии7, 8. это ограничение делает невозможным использовать линии клеток для трансплантации экспериментов3.
Учитывая недостатки созданной НПП клеточных линий первичных культур клеток ПЭС, полученные из свежих тканей может служить более биологически соответствующую модель для изучения ПЭС. Основная НПП клетки были использованы не только для изучения ПЭС специальные функции, такие, как витамин А метаболизм9, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных10 и ионного транспорта11, но и для изучения основных клеточной биологии как эпителия Сотовый полярности2 , лизосомальных гомеостаза и autophagy12,13.
В последние несколько лет произошел ряд публикаций о создании первичного НПП культур указывая растущий интерес к этой области исследования3,14,15. Многочисленные протоколы для человека НПП клетки и клетки не человеческого ПЭС как говядину и свинину НПП клетки были опубликованы16,,1718,19. Однако это более трудным для обработки клеток мыши НПП из-за их гораздо меньшего размера. Даже несмотря на то, что целый ряд публикаций описал протоколы изолировать НПП клетки мыши14,20,21, есть еще многие исследователи пытаются изолировать НПП клетки без загрязнение сосудистое клетки или клетки от мусора нейронных сетчатки. Здесь мы представляем протокол для создания основного мыши НПП клеточной культуры, включая получение глаза от мыши, рассечение глаз и изоляции листов ПЭС произвести клетки для культивирования. Этот видео-протокол будет особенно полезно для исследователей, которые начинают работать с мышь первичной НПП культур и нуждаются в руководстве по методам рассечение.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Процедуры с участием животных темы были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете Питтсбурга
1. подготовить решения
- Подготовка среднего роста, дополняя Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), высокие глюкоза с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин/стрептомицина 1%, 2,5 мм L-глютамина и 1 x MEM заменимых аминокислот. Предварительно теплой СМИ в инкубаторе 37 ° C перед использованием.
- Приготовьте рабочий раствор 2% (wt/vol) dispase II:
- Подготовьте Стоковый раствор 100мг/мл dispase II, растворяя 30 мг dispase II в 300 мкл HEPES-амортизированное saline (50 мм HEPES/Кох рН 7,4, 150 мм NaCl). Этот объем для 3-4 мышей, он может быть масштабируется или вниз на основе числа мышей для эксперимента). Этот запас может храниться в течение по крайней мере за 1 неделю при 4 ° C.
- Подготовьте рабочий раствор 2% dispase, добавляя 300 мкл, 100 мг/мл dispase II акции 1,2 мл стерильной среде DMEM, высокой глюкозы и фильтрации решение через фильтр 0,22 мкм. Этот шаг должен выполняться в Ламинарный шкаф в стерильных условиях. Предварительно теплой подготовленный dispase II в инкубаторе 37 ° C перед использованием.
2. получение мыши глаза
- Усыпить мыши, используя любой утвержденной метод и поместите его на Впитывающим вкладышем.
- Ношение перчаток, поставьте большой палец и указательный палец вокруг глаз и аккуратно вставьте кожу proptose глазного яблока.
- Вставьте наконечник угловой ножницы между кожей и глазного яблока и аккуратно вырезать глаза. Чтобы избежать заражения, кратко окуните глаз в 70% этиловом спирте.
- Сразу же место глаз в фосфат амортизированное Saline (PBS) в чашку Петри.
- Повторите шаги 2.2-2.4 удалить второй глаз.
3. глаз рассечение
- Осторожно удалите соединительной ткани от глаз под микроскопом рассечения. Это можно сделать в PBS или на сухой Петри.
- Использование сшивания щипцы поднять соединительной ткани из глазного яблока и вырезают ножницами беззаботными. Не режьте склеры, потому что это практически невозможно получить нетронутыми задняя выкручиваются, если сократить склеры.
- После очистки соединительной ткани, сохраните полученный глаз в PBS для следующего шага стиральная.
Примечание: Все следующие шаги должны быть выполнены в Ламинарный шкаф в стерильных условиях.
- Промойте глаза дважды в подогретым 37 ° C DMEM (высокая глюкозы). Тщательно передачи глазного яблока в подогретым 37 ° C DMEM (высокая глюкозы) с помощью щипцов. Аспирационная среднего и передачи глазные яблоки свежие средний в новое блюдо.
- Аспирационная DMEM (высокая глюкозы) среднего и инкубировать глаза в рабочем растворе подогретым 2% (wt/vol) dispase II для 45 мин в инкубаторе 37 ° C.
Примечание: Все следующие шаги, место и манипулировать глаза или окуляры в среднего роста, которые будут защищать ткани и обеспечить хорошую среду для рассечения. - Удаление решения II dispase и мыть глаза дважды в среднего роста, аспирационных старый среднего и добавив новый среднего роста подогретым 37 ° C (рис. 1a).
Примечание: После диссоциации, dispase II, глазные яблоки не станут мягкими. - Держите глаза с щипцами и надрезают вокруг Ора Серрата каждого глаза с помощью ножниц беззаботными под микроскопом рассечения, помещены в Ламинарный шкаф.
- Сохраняя глазного яблока в растворе, осторожно удалите передней роговицы, расширяя разрез вокруг окружности Серрата Ора и отбирала передней роговицы после полного разреза.
- Удаление капсулы хрусталика и связанные Ирис пигментированные эпителия, осторожно потянув их из наглазник пинцетом teethed (рис. 1b, 1 c).
- Инкубируйте результате задняя окуляры в среднего роста для 20 минут при 37 ° C для облегчения разделения нейронных сетчатки из ПЭС.
- Нарежьте 4 лепестки под микроскопом рассечения, помещены в Ламинарный шкаф задняя окуляры. Сокращение должно быть достаточно долго сгладить наглазник, но достаточно коротким, чтобы лепестки подключен (рис. 1 d).
- Сгладить наглазник и удалить нейронных сетчатки, очень осторожно потянув их пинцетом удерживая остальные ПЭС Хориоидея склера комплекс с другой щипцами (Рисунок 1e). Начните потянув от края, а не из центра.
- Передача всех расквартированы тканей в новых стерильных культуры блюдо заполнены с подогретым 37 ° C рост среднего.
4. изоляция первичных клеток НПП
- Проведение один лепесток расквартированы ПЭС Хориоидея склера комплекса с супер штраф щипцы, Аккуратно отделите нетронутыми листы НПП от базового базальной мембраны (мембрана Бруха) с использованием микрохирургической серповидный нож под микроскопом рассечения помещены в Шкаф ламинарный поток (Рисунок 1f).
- Перенесите НПП листы в новых стерильных культуры блюдо, содержащие среднего роста с помощью микропипеткой Р200. При передаче НПП листы, мокрой наконечники с среднего роста, закупорить несколько раз для предотвращения прилипания внутрь кончик ткани. НПП будет четко отличимы от сосудистое: НПП выглядит более буроватые, в то время как Хориоидея темнее и выглядит липкий и пушистый.
- Кроме того используйте ферментативный пищеварения и нежный диссоциации не щипцов для отсоединения НПП сосудистое14.
- Вымойте НПП листов, 2 - 3 раза с помощью подогретым 37 ° C среднего роста в стерильных культуры блюдо. После каждой стирки шаг тщательно Соберите НПП листы, избегая других тканей сетчатки мусора или сосудистое. В конце последнего мыть собирать НПП листы с микропипеткой Р200 и поместите их в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл.
Примечание: Существует не нужно центрифуга НПП листы: они будут осадок самотеком в течение 1 мин. - Удалите дополнительный рост среднего, с помощью микропипеткой P200. Ресуспензируйте клетки в свежих подогретым роста среднего и аккуратно нарезанных их с помощью микропипеткой P200. Избегайте образования пузырьков. Подвеска одной ячейки является идеальным, но также избегать слишком много Тритурация, иначе НПП клетки не способны выжить. Мы рекомендуем очень осторожно Тритурация для 40 - 50 раз.
5. Культивирование клеток НПП
- Пластина клетки на табличке культуры.
- Если нисходящие приложения НПП клетки требуют, сохраняя их полярности, плита НПП клетки от 2 мышей в одном 12 мм полиэстер мембраны Вставка предварительно загружаются в 12-ну культуры пластин. Покрытие клетки на высокой плотности желательно, потому что в этом случае НПП клетки способны сохранить исходные свойства, например гексагональной формы и пигментации.
- Не двигаться пластину или изменить среднего роста для первых 72 ч культивирования. После 3 дней Замените старый средних свежих подогретым роста среднего. После этого изменения культуры среднего каждый день. Как только НПП клетки confluency, уменьшите FBS в средство роста до 2%.
Примечание: Клетки можно разделить с помощью трипсин 0.25%. Однако после разделения клетки могут потерять их шестиугольной формы и пигментации в последующих проходах. Мы не рекомендуем, разделение клетки, но если это требуется по течению приложений культуры, имейте в виду, что главные ячейки не может бесконечно пассированной: они известны де дифференцировать после 5-7 ходов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мышь первичной НПП культура создана от 2 мышей в 12 мм полиэстер мембраны Вставка достигает 90-95% confluency после 1 недели в культуре. После 2 недель культуры клетки достигли 100% confluency и начал формироваться мозаику гексагональной, пигментированный и Би тому клеток. 3 недели культуры, клетки, по-прежнему образуют форму и пигментации, однако, после 4 недель часть клеток получил гиперпигментированных (рис. 2).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представлен подробный протокол обеспечивает надежное создание мышь первичной НПП культур, которые достигают confluency после 1 недели и представить основные характеристики НПП гексагональной формы и пигментации после 2 недель. Полученные клетки ПЭС может использоваться для ряда течению приложений, таких как витамин А метаболизм9, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных10 и ионного транспорта11, эпителиальных клеток полярности2<...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
DS получила финансирование от Bayer HealthCare и F. Hoffmann-La Roche, Германии и Швейцарии исследований. Остальные авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов. Эта работа поддерживается исследования, чтобы предотвратить слепоту (неограниченный гранты Вильмер глаз институт и Университет Питтсбурга). Эта работа также поддерживается запуск средств DS от офтальмологии, Университет Питтсбурга.
Благодарности
Это исследование финансировалось частично BrightFocus фонд (DS).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| animals | |||
| 2~3-недельные мыши | |||
| Name | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| reagents | |||
| Модифицированная орлиная среда (DMEM) от Dulbecco, | GIBCO | 11965092 | |
| диспаза II | Сыворотка | D4693 | |
| (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | GIBCO | 15140122 | |
| раствор заменимых аминокислот MEM (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS), 1X, pH 7,4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-глютамин (200 мМ) | GIBCO | 25030-081 | |
| Этиловый спирт | Fisher Scientific | 111000200 | |
| Антитело к RPE65 | Подарок от доктора Майкла Редмонда | ||
| Флуоресцеин Фаллоидин | Invitrogen | F432 | |
| Козий антикролик IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Инвитроген | А11011 | |
| Козья сыворотка | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Параформальдегид (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Поликлональное антитело | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Номер | Комментарии |
| >инструменты и оборудование | |||
| ламинарный шкаф | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Препарирующий микроскоп (стереомикроскоп Zoom) | |||
| со стерилизацией горячим воздухом | Binder | C150 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5702 | |
| чашки Петри | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 мм Полиэфирные мембранные вставки предварительно загружены в 12-луночные культуральные планшеты, размер пор: 0,4 &; m, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott ножницы для тенотомии, лезвия std, острые | инструменты STEPHENS | S7-1320 | |
| Castroviejo ушивающие щипцы 0,12 мм | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent прямой нож | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Пинцет #5, 11 см, прямой, 0,1x0,06 мм Наконечники, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| ножницы для ванны, 8 см, 45 градусов; Уголок, стандартный | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 и микро; m | Millipore | SLGL0250S | |
| шприц, 5 мл | BD | 309632 | |
| инвертированным лабораторным микроскопом Leica DM IL LED | Leica | ||
| Наконечники для пипеток | Gilson | ||
| Barrier и нефильтрованные наконечники для пипеток | Thermo Scientific |
Ссылки
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
