Assay ремонт мембраны клеток с помощью двух Фотон лазерный микроскоп

Краткое содержание

Клеточной мембраны, ранив через два фотона лазерного это широко используемый метод для оценки мембраны закрытия способности и может быть применен к нескольким типов клеток. Здесь мы описываем протокол в vitro жить изображений запечатывания мембраны в клетках пациента dysferlinopathy, после двух Фотон лазерной абляции.

Аннотация

Многочисленные патофизиологические оскорбления может привести к повреждению мембраны клеток и, в сочетании с врожденными дефектами в ремонте клеточной мембраны или целостности, может привести к болезни. Таким образом, понимание глубинные механизмы окружающих клеточной мембраны ремонта является важной задачей для развития новых терапевтических стратегий для заболеваний, связанных с динамикой неблагополучных клеточной мембраны. Многие в пробирке и в vivo исследований, направленных на понимание клеточной мембраны запечатывания в различных контекстах болезни используют два Фотон лазерной абляции в качестве стандарта для определения функциональных результатов после экспериментального лечения. В этот assay мембраны клетки подвергаются ранив двух Фотон лазером, что приводит к клеточной мембраны к разрыву и флуоресцентные краски проникнуть в клетки. Интенсивность флуоресценции в ячейке затем может контролироваться количественно оценить способность клеток запечатать сам. Существует несколько альтернативных методов для оценки клеточной мембраны ответ на травмы, а также большие различия в двух фотона лазерного, ранив сам подход, таким образом, единой модели ранения клетки благотворно будет служить для снижения различия между этими методологиями. В этой статье мы приводим простой лазерной двух фотонов, ранив протокол для оценки клеточной мембраны ремонт в vitro как здоровых, так и dysferlinopathy пациента фибробластов что transfected клеток с или без полнометражные dysferlin плазмиды.

Введение

Клеточной мембраны эукариотической клетки состоит из двухслойной белка шипованных фосфолипидов который определяет intra/внеклеточных среды ячейки и имеет важное значение для поддержания клеточного гомеостаза и ячейку выживания. Клеточной мембраны травм, связанных с механической или химической оскорбления являются обычным явлением в различных типах клеток млекопитающих, включая скелетных и сердечной мышцы, желудка и легких клетки^1,2,3,4. Помимо травмы в результате ежедневных физиологические функции клеточных мембран также могут быть повреждены экологической оскорбления, бактериальные токсины и ишемии-реперфузии⁵. Неспособность запечатать разрывов в клеточной мембраны ведет к нерегулируемый приток внеклеточного Ca^{2 +}- наряду с других потенциально токсичных компонентов внеклеточного - в клетку, вызывая течению сигнала каскады, которые могут быстро привести к ячейке смерти^1,4,5,6.

На сегодняшний день, были несколько предложенных моделей для ремонта мембраны в клетках. Ремонт различных механизмов могут активироваться в зависимости от размера и характера разрыва мембраны. Например, предполагается, что клеточные мембраны могут использовать боковое поток или белка, засорение для ремонта небольших сбоев (< 1 Нм). Модель бокового fusion предлагает, что мембрана разрывы быстро зашли через боковые набора dysferlin содержащих мембраны⁷, в то время как белок, засорение модель предполагает, что небольшие проколы рекомендованный через агрегаты белка (в основном Аннексины) ⁸. и наоборот, более крупные поражения мембраны триггер Ca^{2 +}-зависимых, dysferlin опосредованной везикул фьюжн и формирование патч ремонт. В модели патч ремонт, быстрый Ca^{2 +} приток в ячейку запускает набор нескольких белков (dysferlin, аннексины, mitsugumin-53 и EDH белки), которые образуют комплекс или «патч», наряду с сочетанием внутриклеточных везикулы или на сайте мембраны лизосом ущерб^4,9,10,,1112. Важно отметить, что эти модели не обязательно являются взаимоисключающими и могут работать в концерте для облегчения ремонта мембраны. Неспособность должным образом запечатать повреждение клеточной мембраны связан с несколькими государствами болезни, включая мышечная дистрофия (dysferlinopathy - включая Миеси миопатии и конечности ремень мышечная дистрофия типа IIB дистальная миопатия с передней большеберцовой начала) ¹³,¹⁴кардиомиопатия и Чедиака-Хигаси синдром (CHS)¹⁵.

Учитывая, что целостность надлежащего клеточной мембраны и запечатывания играет такую важную роль в здоровье и болезни, более глубокое понимание глубинные механизмы клеточной мембраны ремонта бы полезно в поисках роман терапевтических стратегий. Это, таким образом, необходимо иметь соответствующие экспериментальные методы для мониторинга кинетики и оценить способность клеточной мембраны ремонта. Были разработаны несколько в vitro методы для моделирования мембраны ремонт. Одна стратегия включает механические травмы, которая может способствовать клеток соскоб с пипеткой/хирургическое лезвие/бритвой или путем опрокидывания клетки¹⁶стеклянные бусины. Однако этот тип механических повреждений генерирует большие поражения и создает высокую степень изменчивости в ячейке травмы, как внутри, так и между культурами.

Другой способ генерации мембраны раны является лазерной абляции, два Фотон микроскопии. В отличие от традиционного лазера confocal микроскопии, которая использует один фотон возбуждения два фотона лазерного одновременно использует две длинные волны, низкой энергии фотонов для облегчения возбуждения электронов¹⁷. Этот нелинейный процесс приводит возбуждения исключительно в пределах фокальной плоскости и не вдоль всего пути света¹⁷ (рис. 1). Это сократило объем помогает возбуждение к минимуму фотоповреждения при визуализации живых клеток^18,19. Поэтому исследователи способны генерировать точного поражения в клеточной мембраны и монитор мембраны запечатывания в режиме реального времени с помощью флуоресцентных красителей и наблюдения изменений в интенсивности флуоресценции клеточной мембраны разрывы, а затем reseals.

Этот подход неоднократно использовались для изучения мембраны, ранив в пробирке и в естественных условиях и в несколько ячеек типы^20,21. Например мембран ремонта дефектов фибробластов и myotubes, производный от dysferlinopathy, которую больных оценивали с помощью этой техники^22,23. Кроме того один мышечных волокон, изолированные от мышей были использованы для мониторинга ремонт патч формирования^13,24,25. Движение дневно тегами белков может также наблюдаться во время ремонта мембраны в одном мышечных волокон⁹. Кроме того процесс sarcolemmal восстановления после двух фотона лазерного ранения в zebrafish эмбриона можно наблюдать в режиме реального времени в vivo²⁶.

В этой статье мы приводим методологию для оценки динамики ремонт клеточной мембраны в фибробласты, используя два фотона лазерного ранения, хотя эта методология может применяться для различных типов клеток с целью количественного определения плазматической мембраны запечатывания способность в пробирке. В этом методе, клетки инкубируют с FM4-64, липофильных, клетки непроницаемый краситель, который быстро флуоресцирует как он привязывается к отрицательно заряженных фосфолипидов в цитоплазме при входе в клетку через мембраны поражения (рис. 2& 3). Количественная оценка краситель флуоресценции рядом с поражением мембраны позволяет для наблюдения за время, которое требуется для клеточной мембраны для запечатывания сам. Чтобы проиллюстрировать полезность этого метода, мы используем dysferlinopathy пациента фибробластов transfected с плазмид GFP-конъюгированных полнометражные dysferlin (DYSF) для оценки спасательных ремонт клеточной мембраны.

Протокол

Клетки фибробластов человека, используемые в данном исследовании были использованы с одобрения Комитета по этике человека факультета медицины и стоматологии в университете Альберты.

1. transfection клеток с полнометражные DYSF плазмиды

1. Культура клетки фибробластов в T225 колбу, содержащие 40 мл питательных сред - 36 мл Дульбекко среднего изменения орла (DMEM), 4 мл плода бычьим сывороточным (ФБС) и 20 мкл пенициллина/стрептомицина (P/S) - в инкубатор CO₂ при 37 ° C.
   Примечание: Клетки должны быть культурный примерно 70-80% confluency и не должно быть позволено стать полностью вырожденная.
2. Для подготовки клетки для посева, промойте клетки с 40 мл-фосфатный буфер (PBS) дважды, а затем добавьте 5 мл 0,05% трипсина для отсоединения клетки. Возвращение клетки до 37 ° C CO₂ инкубатора и инкубации клеток на 5 мин.
   1. Когда клетки полностью отдельностоящий, добавьте 40 мл питательных сред для остановки реакции трипсина.
   2. Подсчитать ячейки, используя Горяева или другую ячейку, подсчет устройство.
3. Семя клеток в 1 х 10⁵ клеток/мл 2мл в 35 мм коллаген покрытием стекло дно блюда. Инкубировать клетки на ночь в инкубатор CO₂ при 37 ° C.
   Примечание: Клетки должна быть примерно 50-60% притока на следующий день.
4. Удалите медиа роста и заменить его с 2 мл сыворотки, лишенные массовой (рост без FBS).
5. Transfect клетки с полнометражные dysferlin плазмиду с помощью lipotransfection.
   1. Подготовка 150 мкл сыворотки лишен средств массовой информации в 1,5 мл (одна трубка для каждого блюдо, котор нужно transfected).
   2. 3 мкл Реагента трансфекции, к каждой пробке 1,5 мл, содержащих сыворотки лишен средств массовой информации. Проинкубируйте его по крайней мере 5 минут при комнатной температуре.
   3. В отдельном 1,5 мл трубку добавьте 175 мкл сыворотки лишен средств массовой информации и 3,5 мкг плазмидной ДНК.
      Примечание: Умножьте выше суммы для каждого дополнительного блюдо transfected.
   4. Объединить 150 мкл сред, содержащих плазмидной ДНК в трубку с 150 мкл сыворотки лишен средств массовой информации и трансфекции реагента. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
   5. Равномерно распределите 300 мкл СМИ с плазмиды и трансфекции реагент блюдо. Инкубировать блюда для 24 h в инкубатор CO₂ при 37 ° C.
6. Замените СМИ свежих питательных сред, содержащих сыворотки и проинкубируйте его на дополнительные 24 часа в инкубатор CO₂ при 37 ° C.

2. Подготовка клеток для assay ранив двух Фотон

1. Удалите средства массовой информации, закупорить и промойте клетки один раз с 1 мл раствора в Tyrode, а затем добавьте 1 mL свежих Tyrode раствора, содержащего 1 мкл 2,5 мм FM 4-64 красителя.
   Примечание: Конечная концентрация FM 4-64 краситель-2,5 мкм.
2. Если оценки мембраны ремонта в условиях истощения кальция, промойте клеток в 1 мл PBS и затем добавьте 1 mL PBS, содержащие 1 мм EGTA.
   Примечание: Как PBS будет вызывать клетки для отсоединения со временем, ранив assay должно быть завершено как можно скорее.

3. два фотона лазерного ранив пробирного

1. С помощью инвертированного конфокального микроскопа и связанные программы программное обеспечение, создать цель мкм 0.2 мкм x 2 и поместите его на краю клеточной мембраны, так что целевой линии пересекаются и находится перпендикулярно направлению клеточной мембраны (рис. 2).
2. Используйте лазер HeNe 543 Нм для возбуждения сигнал FM красителя и задать диапазон обнаружения для 600-760 Нм. Использование Аргонового лазера 488 нм возбуждают GFP сигнал (рис. 4) и дальность обнаружения для 500-550 Нм.
   1. Создать серию 5 мин время сканирования последовательных изображений, изображений клетки каждые 5 s.
   2. Для создания поражением мембраны, отбеливатель клеток с помощью двух фотона лазерного равным 820-Нм, используя 15% мощность с 10 итераций лазера и отбеливателя клетки 25 s после начала временных рядов.
3. Для количественного определения FM 4-64 краситель флуоресценции, используйте программное обеспечение для рисования 6 мкм x 6 мкм региона интерес (ROI) и поместите его рядом, ранив местоположение и в пределах ячейки (рис. 3).
   Примечание: Избегайте области выборки пикселей перенасыщения, используя функцию «Индикатор диапазона» в программном обеспечении - в этом приложении, красные пиксели представляют перенасыщенной пикселей. Экспорт сырья флуоресценции значения в электронную таблицу для статистического анализа.
4. Рассчитать относительный флуоресценции значения для каждой точки время путем вычитания фон (стоимость средняя флуоресценции timepoints до ранения мембраны) и деления чистое увеличение флюоресценция значение в момент t = 0 (рис. 5, 6) .

Результаты

Здоровые фибробластов, -лечение dysferlinopathy пациентов фибробластов и пациента фибробластов transfected с плазмида, содержащий последовательность полнометражные dysferlin были подвергнуты два фотона лазерного ранив оценить мембраны запечатывания способность в режиме реального времени. Здорового человека фибробластов клетки отображаются низкий уровень FM 4-64 флуоресценции активации после лазерной ранения и не лечить пациента фибробластов выставлены высокой степенью интенсивности флуоре...

Обсуждение

Двух фотона лазерного ранив клеточной мембраны — это точный и универсальный метод для оценки динамики мембранных запечатывания в пробирке. В этой статье мы описали протокол для определения запечатывания способности в dysferlinopathy пациента клеток с помощью двух Фотон лазера, ранив пробирного клеточной мембраны. Наши результаты показывают, что dysferlinopathy пациента клетки являются неполноценными запечатывания клеточной мембраны, которая согласуется с выводами других исследователей и которое далее подчеркивае...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
сыворотка плода крупного рогатого скота	Sigma-Aldrich	F1051
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)	Thermo Fisher	15140122
трипсин-ЭДТА (0,05%), фенол красный	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буферный раствор	Sigma-Aldrich	D8537
35 мм посуда со стеклянным дном с коллагеновым покрытием	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Сыворотка с недостаточным содержанием сыворотки	Thermo Fisher	31985070
Реагент для трансфекции	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Краситель	Invitrogen	T13320
Tyrode' s Раствор солей	Sigma-Aldrich	T2397
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Carl Zeiss	NA
Chameleon Двухфотонный лазер	Coherent	NA