Методическая статья

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

DOI:

10.3791/57040

⸱

10 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, 3Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем пошаговые инструкции: 1) эффективно инженер кишечных органоидов с помощью магнитных наночастиц для ленти- или ретровирусной трансдукции, и, 2) генерировать замороженные секции из инженерных органоидов. Этот подход является мощным инструментом для эффективного изменения экспрессии генов в органоидах для исследования эффектов ниже по течению.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечные органоидные культуры предоставляют уникальную возможность исследовать кишечные стволовые клетки и биологии склепа in vitro, хотя эффективные подходы к манипулированию экспрессией генов в органоидах добились ограниченного прогресса в этой области. В то время как технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном клетки для генерации органоидов, эта стратегия требует тщательного отбора и скрининга путем анализа последовательности, что является одновременно трудоемким и дорогостоящим. Здесь мы предоставляем подробный протокол для эффективного вирусного трансдукции кишечных органоидов. Такой подход является быстрым и высокоэффективным, что сокращает время и расходы, присущие технологии CRISPR/Cas9. Мы также представляем протокол для генерации замороженных участков из нетронутых органоидных культур для дальнейшего анализа с иммуногистохимическим или иммунофлуоресцентным окрашиванием, которое может быть использовано для подтверждения экспрессии генов или замалчивания. После успешного трансдукции вирусных векторов экспрессии генов или замалчивания, кишечные стволовые клетки и функции крипты могут быть быстро оценены. Хотя большинство органоидных исследований использовать в пробирке анализы, органоиды также могут быть доставлены мышам для in vivo функциональный анализ. Кроме того, наши подходы являются выгодными для прогнозирования терапевтических реакций на наркотики, потому что в настоящее время доступны терапии обычно функции модуляции экспрессии генов или белковой функции, а не изменения генома.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность к культуре мыши или человека склепы клеток, как трехмерные (3D) органоидов из тонкого кишечника или толстой кишки в течение длительных периодов времени при условии крупного прорыва, потому что эти культуры отображают определяющие особенности кишечного эпителия in vivo 1 , 2 , 3. Органоиды, полученные из первичных склепов, способны к самообновлению и самоорганизации, демонстрируя клеточные функции, аналогичные их тканям происхождения. Действительно, органоиды резюмируют не только структурную организацию склепов in vivo, но и многие молекулярные особенности, обеспечивая тем самым полезные инструменты для изучения нормальной биологии и состояния болезней. Чтобы проиллюстрировать, органоидные исследования выявилиновые молекулярные пути, участвующие в регенерации тканей 1,2,3,4,5, а также препараты, которые могли бы улучшить функцию в патологическихусловиях 6,7.

Изучение кишечных стволовых клеток представляет особый интерес, поскольку кишечная подкладка является одной из наиболее регенеративных тканей млекопитающих, обновляя себя каждые 3-5 дней, чтобы защитить организм от бактерий, токсинов и других патогенов в кишечные люмены. Кишечные стволовые клетки (ISCs) несут ответственность за эту замечательную регенеративную способность и, таким образом, обеспечивают уникальную парадигму для изучения функции стволовых клеток взрослых1,2. Линейные исследования экспериментов на мышах показали, что изолированные Lgr5-положительные стволовые клетки могут быть культивированы для генерации 3D-органоидов или «мини-кишки» в пробирке, где они тесно отражают свои аналоги in vivo. Органоидные культуры также могут быть получены из изолятов клеток кишечных склепов, состоящих из прародителей, МЦКов и клеток Панета, последние из которых составляют эпителиальные нишевые клетки in vivo. На самом деле, органоидная культура из первичных клеток кишечного склепа превратилась в относительно рутинную технику, которую легко реализовать в большинстве лабораторий с использованием широко доступных реагентов. Эта модель также поддается количественному анализу экспрессии генов с помощью РНК-секвенирования (РНК-Сек) и белков масс-спектрометрией, иммуногистохимией или иммунофлуоресцентным окрашиванием2,4,8. Кроме того, функциональная генетика может быть изучена с помощью усиления функции (переэкспрессия гена или экспрессии активирующего мутантного гена) или потери функции (заглушение гена или экспрессия мутанта потери функции) приближаетсяк2.

Важно отметить, что низкая эффективность и высокая токсичность стандартной плазмидной ДНК или вирусных протоколов трансдукции с полибреном остаются основным препятствием в этой области. Хотя технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном, этот подход требует многовремени выбора с последующим проверкой последовательности9. Здесь мы представляем протокол вирусной трансдукции для первичных кишечных органоидов, который оптимизирует доставку вирусных частиц путем спряжения к магнитным наночастицам и применения магнитного поля. Приводятся ключевые измененияв предыдущие протоколы 4,5,10,11,12,13 и рекомендации по повышению эффективности. Мы также описываем подход к созданию замороженных секций из нетронутых органоидов, культивированных в 3D матригель (отсюда называют подвал мембранной матрицы или матрицы) для дальнейшего анализа с иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного окрашивания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и использованию медицинских учреждений Джонса Хопкинса (IACUC). Этот протокол изменяется из ранее опубликованных методов10,11,12,13.

1. Подготовка реагентов

  1. Приготовьте свежий 293T средний несколько часов вперед и теплой до 37 градусов по Цельсию в водяной бане, по крайней мере 10 минут перед использованием (Таблица 1).
  2. Подготовка плазмид ДНК2,13,14 для вирусной упаковки. (Таблица 2).
  3. Приобретите все остальные необходимые материалы(Таблицаматериалов).

2. Лентивирус или Производство ретровирусных частиц

  1. Почка эмбриона человека (HEK) 293T посев клеток (День 1)
    1. Приготовьте одно культовое блюдо 150 мм, покрыв 50 мкг/мл поли-Д-лисин, растворенный в фосфатном буферном сольнике (PBS; 10 мл/блюдо) на 1 ч при комнатной температуре (RT).
    2. Удалите фосфат буферный солен (PBS)/поли-D-лизин и промойте покрытую тарелку дважды с 5 мл PBS.
    3. Семена 293T-клеток (8'u201210 x 106) в среде 293T (таблица1) общим объемом 15 мл.
    4. Культура 293T клеток на ночь в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 КК, 5% CO2).
  2. Трансфекция клеток HEK 293T (День 2)
    1. Выполните трансфекцию, как только клетки достигли 70-80% слияния (обычно около 24 ч после посева 8'u201210 х 106 клеток).
    2. Подготовка трансфекционной смеси с использованием эффективного подхода, такого как коммерческая киционическая липосома формулировка (Таблицы 1'u20122, Таблица материалов)2.
      1. Разбавленная лентивирусная ДНК строит12 (всего 24 мкг плазмидной ДНК, Таблица 2) в 1,2 мл трансфекционного среднего и инкубирует в течение 5 мин на РТ в 1,5 мл труб (Таблица материалов).
      2. Разбавить трансфекционный регент (36 л) в 1,2 мл трансфекционной среды(Таблицаматериалов) и инкубировать в 5-мл труб в течение 5 мин в соответствии с инструкциями производителя.
      3. Добавьте реагент лентивирусного реагента (шаг 2.2.2.1) к реагенту трансфекции (шаг 2.2.2.2) и аккуратно перемешайте, медленно трубачируя вверх и вниз, используя трубку 5 мл.
      4. Инкубировать смесь в течение 20 минут на RT.
    3. Аккуратно промыть 293T-клетки 5 мл трансфекционной среды и заменить 10 мл трансфекционного носителя.
    4. Добавьте ДНК-липидные комплексы (от шага 2.2.2.3) dropwise к среде 293T клеток и тщательно перемешайте носители в культурных блюдах, двигаясь в горизонтальном и вертикальном направлениях, чтобы обеспечить равное распределение ДНК-липидных комплексов в каждом блюде.
    5. Инкубировать в течение 6 ч в стандартном инкубаторе культурытканей (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).
    6. После инкубации, заменить средства массовой информации с 20 мл свежего вируса сбора среды (Таблица 1).
  3. Коллекция вирусов (Дни 3'u20125)
    1. Собирайте вирусные носители в трубках 50 мл и храните в холодильнике 4 градусов по Цельсию для дальнейшей концентрации.
    2. Замените 20 мл свежего вируса, собирающего среду каждые 24 ч и культуру за одну ночь (24 ч). Повторите сбор носителей в течение следующих 2 дней (Дни 4'u20125).
    3. Убедитесь, что общий объем среды, собранной после 5-го дня, составляет 60 мл (20 мл/день х 3 дня).
  4. Концентрация вируса (День 5)
    1. Центрифуге собранных носителей (60 мл) в течение 5 мин при 400 х г. Затем, пройти супернатант через фильтр (0,45 мкм поры), чтобы удалить любой клеточный мусор.
  5. Сосредоточьтесь на вирусе, добавив 15 мл фильтруемых вирусных носителей в центробежный фильтр (Таблица материалов). Центрифуга при 2500 х г в течение 15 мин при 4 градусах По цельсию. Поскольку вирус не может пройти через этот фильтр, он будет сосредоточен в верхней камере фильтра.
    1. Аспирировать поток через трубку (нижняя камера) и добавить еще 15 мл оставшихся вирусных супернатант средств массовой информации в тот же центробежный фильтр единицы. Центрифуга, как выше (2500 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия), чтобы сконцентрировать дополнительный вирус от супернатанта.
    2. Повторите процесс, используя тот же фильтр для 60 мл носителя с одной трансумции пластины до достижения желаемой концентрации (100 раз).
      Примечание: Мы обычно концентрируем 60 мл носителей сбора вирусов до 600 евро.
    3. Удалите концентрированный вирус из верхней камеры фильтра с помощью трубки 1 мл, затем аликот и храните в трубках 1,5 мл (50 х u201260 л/трубка) при -80 градусов по Цельсию для последующего использования. Храните концентрированные частицы в течение 6 кв201212 месяцев.

3. Изолирование склепов

  1. Эвтаназия мышей с использованием CO2 в соответствии с местными руководящими принципами IACUC.
  2. Поместите эвтаназии животное на спину и мыть живот, распыляя 70% этанола.
  3. Выполните продольное щелочное разрез от грудины до паха, сначала разрезая кожу, а затем подкожную ткань.
  4. Удалить тонкой кишки из желудка в cecum.
  5. Определение регионов, представляющих интерес в тонкой кишке; склепы могут быть изолированы от двенадцатиперстной кишки, jejunum и ileum.
  6. Используя шприц 10 мл, промыть изолированный тонкий кишечник с криптой диссоциации буфера (предварительно охлажденный PBS, содержащий 1 мМ дитиотрейтол (DTT), 1% пенициллин / стрептомицин (не Ca2 "и Mg2 ")в 10 см ткани культуры блюдо ( Таблица культуры блюдо (Таблица 1)
  7. Удалить периферийную жировую ткань и открыть или "филе" кишечной ткани продольно на стерильной стеклянной пластине (15 см х 15 см).
  8. Аккуратно соскребите кишечные эпителиальные виллы с помощью клеточного скребока.
  9. Разрежьте тонкой кишки на 2-20123 см длиной в длину разделы.
  10. Перенесите ткань в трубку 15 мл, содержащую предварительно охлажденные PBS с помощью плоских щипц (116 мм). Вымойте фрагменты ткани, энергично пожимая вручную в течение 30 с (перемещение трубки в противоположных направлениях 60 раз).
  11. Освежите PBS и повторите мыть, пока PBS становится ясно.
    Примечание: Мы обычно мыть фрагменты 2'u20123 раз.
  12. Инкубация ткани в 15 мл конической трубки, содержащей 10 мл крипторазового буфера(Таблица 1) в течение 10 минут при 4 c на орбитальной шейкер на средней скорости, как только PBS ясно.
  13. Энергично встряхните трубку вручную в течение 30 с (противоположные направления и 60 раз) и перенесите ткань с помощью плоских щипц в другую коническую трубку 15 мл, содержащую 10 мл буфера диссоциации склепа. Инкубировать эту фракцию на льду. Не используйте первую фракцию для органоидной культуры, потому что она содержит в первую очередь villi.
  14. Повторите шаги 3.11'u20123.13 для 3'u20124 раз, собирая каждую фракцию и помещая их на лед.
  15. Выберите фракцию, которая обогащается самым высоким процентом кишечных склепов путем сканирования 200 образцов Л Л из каждой фракции под перевернутым микроскопом (4x). Определите склепы по типичной морфологии, как описано ранее (Рисунок 1A)10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Они будут появляться круглой или овальной формы и содержать гранулированные клетки Панета. В отличие от этого, вилли являются палец, как структуры, не хватает гранулированных клеток Paneth(Рисунок 1B).
  16. Передайте выбранную фракцию через ситечко 40 мкм, чтобы при необходимости получить склепы аналогичного размера. Кроме того, изолировать lgr5 "стволовые клетки на основе цитометрии потока для зеленого флуоресцентного белка (GFP), если мыши пересекаются на фоне EGFP-Lgr5 "или другой подходящей модели, которая позволяет идентификацию lgr5 " клеток2.
  17. Подсчитайте общее количество склепов в выбранной фракции следующим образом.
    1. Пипетка 50 л выбранной фракции в гемоцитометр и подсчитывает количество склепов с помощью перевернутого светового микроскопа (4x). Поместите 100 склепов на скважину при использовании 48-хорошей пластины, чтобы обеспечить эксперименты по трансдукции, в которых скважины 3'u20126 будут транс-индуцированы в экспериментальном состоянии для заглушения генов или переэкспрессии.
    2. Основываясь на количестве склепов на 50 л, вычислите объем необходимого буфера диссоциации крипты и перенесите этот объем в трубку 1,5 мл.
      Примечание: Например, подсчитываются 10 склепов на 50 л, для 300 крипто необходимы 6 х 50 л или 300 л.
  18. Центрифуги крипты в 1,5-мл труб на 300 х г в течение 5 мин.
  19. Тщательно отбросить супернатант, аккуратно pipetting от верхнего жидкого слоя и resuspend гранулы в 100 зл. фактор роста снижение подвале мембранной матрицы на льду(Таблица материалов).
  20. Семя матричных склепов в 37 градусов по Цельсию предварительно прогретые 48-хорошо пластины (30 л/ну, 100 склепов / хорошо). Инкубировать пластину в стандартном инкубаторе культуры тканей в течение 5'u201215 мин, чтобыобеспечить матричную геляцию (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).
  21. Наложить каждый гель с 250 qL органоидной культуры (ENR) среды (Таблица 1) и поместить 48-колодец пластин обратно в стандартный инкубатор культуры тканей (37 КК, 5% CO2). Проверьте культуры для организации склепа на маленькие, круглые, кистозные формы после 24 ч; почки сформируются через 220125 дней.
  22. Аккуратно заменяйте медиа-носители ENR каждые 3 дня. Удалите старые носители ENR с нежным всасыванием, заботясь не прикасаться к матрице при замене носителя.
  23. Прохождение органоидных культур каждые 4'u20127 дней, как ранее описано11.

4. Органоидная подготовка фрагмента

  1. Преобразуйте органоиды, как только они образуются (в течение 1 кв20122 недель) или после прохождения. Для одного эксперимента трансдукции, подготовить 2'u20123 скважин культивированных органоидов в 48-ну хорошо пластины в состоянии с 100"u2012200 органоидов / хорошо или 200'u2012600 органоидов в экспериментальном состоянии трансдукции.
  2. Обмен ENR с 250 Л трансдукционного носителя(таблица 1) и культуры в трансдукции средств массовой информации в течение 3 или более дней или до тех пор, пока органоиды принять кистозной морфологии. Включите ингибитор Wnt3a и ROCK (Y27632) в трансдукционную среду для увеличения количества стволовых и панетовых клеток; Никотинамид (Nic) повышает эффективность культуры (см. среду трансдукции в таблице1).
  3. Механически разрыв куполо-как подвальная мембранная матрима структуры со средствами массовой информации и трубчатый наконечник с помощью 1 мл трубки.
  4. Перенесите органоиды и носители в стерильную трубку 1,5 мл.
  5. Механически нарушить матрицу дальше, трубацией с 200 юл пипеткой 10-u201215 раз.
  6. Центрифуга органоидных фрагментов на RT на 500 х г в течение 5 мин.
  7. Откажитесь от супернатанта осторожно с помощью пипетки и resuspend гранулы в 1 мл DMEM / F12 среды (Таблица 1).
  8. Добавить Dispase I (6 л при 10 мг/мл) и DNase I (2,5 л при 10 мг/мл). Хорошо перемешать, аккуратно прокладав трубку, используя трубку 1 мл.
  9. Инкубировать органоиды при 37 градусах по Цельсию в течение 20 мин в трубке 1,5 мл.
  10. Добавьте 500 зЛ носителей ENR, чтобы прекратить реакцию диссоциации; сыворотка в ENR прекращает реакцию.
  11. Передайте органоидные клетки через 20 мкм клеточный ситечко и центрифугите органоидные фрагменты при 400 х г в течение 5 минут.
  12. Приостановить органоидные фрагменты с 150 йЛ трансдукционной среды(Таблица 1).

5. Генетическая инженерия органоидов или crypt клеток вирусной трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Посмотреть рисунок 2.

  1. Семена органоидных клеточных кластеров с 200 л трансдукции среднего / хорошо в 48-хорошо пластины и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 КК, 5% CO2). Кроме того, поместите свежеизолированные клетки криптографических клеток (1000 склепов) в 200-й цЛ трансдукционной среды / хорошо в 48-хорошо пластины и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 КК, 5% CO2).
  2. Оттепель флаконы вируса для трансдукции, позволяющие 50 евро концентрированного вируса для трансдукции каждой скважины в 48-ну хорошо пластины или 100 евро концентрированного вируса на хорошо в 24-наилучшим пластин.
  3. Инкубировать вирус с 12 л раствора магнитных наночастиц в течение 15 мин на RT в трубке 1,5 мл(таблица 3).
  4. Добавьте раствор магнитной наночастицы/вирусную смесь к клеткам, которые будут транс-индуцированы.
  5. Поместите пластину культуры клеток на магнитную пластину и инкубировать, по крайней мере 2 ч (и до 6ч) в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).

6. Посев инфицированных фрагментов органоидов

  1. Перенесите зараженные кластеры органоидных клеток и трансдукционные носители из каждой скважины в трубку 1,5 мл.
  2. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
  3. Откажитесь от супернатанта нежным всасыванием и охладите трубку, содержащую гранулы на льду в течение 5 мин.
  4. Добавьте 120 кл. мембранной матрицы подвала и resuspend гранулы труба медленно вверх и вниз.
  5. Семя 30 капель мматрицно-клеточной смеси в новую 48-колодую пластину.
  6. Инкубировать пластину при 37 градусах По цельсии в течение 5'u20121in мин до тех пор, пока матрица затвердеет.
  7. Добавляйте трансдукционную среду к каждой скважине и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей в течение 3-х u20124 дней (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
  8. После 3-х 20124 дней, проверить культуры под легким микроскопом (10x), чтобы обеспечить организацию клеточных кластеров в органоидных структур. Затем аккуратно замените трансдукционные носители на среду 250 Л. ENR.
  9. Заменяйте средства массовой информации каждые 3-й день20124 дней.

7. Выбор (если применимо)

  1. После 2'u20123 дней, добавить соответствующие антибиотики или гормоны для отбора в трансдукции среды, если это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали пуромицин (2 мкг/мл) для выбора лентивной трансдукции, потому что плазмиды укрывали ген сопротивления пуромицин2,14.

8. Подтверждение успешного трансдукции и экспрессии генов или замалчивания

  1. При использовании FUGW lentivirus2,14, оценка эффективности трансдукции путем измерения сигналов GFP с помощью флуоресцентного микроскопа или цитометрии потока.
  2. Проверка переэкспрессии гена или заглушения с помощью количественной обратной транскриптазной цепной реакции (РТ-ПЦР) для количественного сравнения мРНК в контрольных и экспериментальных органоидных культурах.
  3. Подтвердите уровень белка для белково-кодирующего выражения генов илизаглушения Западным пятном или иммуностоингом 2.

9. Органоидный криосекция в подвале Мембраны Матрица

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите рисунок 3.

  1. Удалите ENR среды нежным всасыванием, стараясь не возмущать матрицу мембраны подвала и осторожно мыть один раз с 500 Зл Л PBS.
  2. Исправьте органоиды с 1,0 мл 4% параформальдегида (PFA) раствор(Таблица материалов) на RT в течение 30 мин.
  3. Удалить PFA путем всасывания, и осторожно мыть дважды с 1 мл PBS.
  4. Удалите PBS путем всасывания и добавьте 1,0 мл 30% сахарозного буфера к каждому образцу. Инкубировать фиксированные органоиды в сахарозе по 1 ч при 4 градусах по Цельсию в холодной комнате, холодильнике или на льду для обезвоживания образцов.
  5. Удалите сахарозу буфера всасывания и добавить достаточно встраивания соединения (Таблица материалов), чтобы покрыть матричного слоя (300 л /хорошо) в каждом колодце.
  6. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
  7. Поместите образцы в морозильную камеру -80 градусов в течение 10 минут, или до тех пор, пока встраивающее соединение не станет твердым и белым.
  8. Поместите блюдо с замороженным встраивающим соединением на RT, чтобы обеспечить минимальное плавление соединения по краям. Используйте скальпель, чтобы отделить блок от стенок колодца.
  9. Удалите матричную встраивающую сяпонический блок с помощью щипц и поместите его в блок образца (например, криомольд), быстро работая, чтобы предотвратить таяние.
  10. Заполните форму полностью с встраиванием соединения и заморозить на -80 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  11. Используйте блок для секции или хранения в морозильной камере -80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем быструю и высокоэффективную технику трансдукции, которая использует магнитные наночастицы, подвергающиеся воздействию магнитного поля, чтобы доставить лентивирус к клеткам, представляющим интерес. С легкодоступными инструментами, мы применили этот подход не только для преобразовывания свежеизолированных клеток крипто(рисунок 1A),но и для органоидов (Рисунок2)и других клеток, которые огнеупорные к более рутинным...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичная культура эпителия кишечника у взрослых в качестве органоидов обеспечивает мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов, участвующих в функции стволовых клеток, эпителиального гомеостаза кишечника и патологии1,2, 4. Хотя технология CRISPR/Cas9 может быть использованадля генетически инженерных органоидов 9, она ограничена необходимостью обширного скрин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами От Национального института здравоохранения (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Мэриленд Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Американской ассоциации легких, Allegheny Health Network - Johns Научно-исследовательский фонд Хопкинса и Центр основных исследований в области заболеваний пищеварения Хопкинса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMThermo Fisher Scientific11965092Базовая среда для 293Т-клеток
DMEM/F12+Thermo Fisher Scientific12634010Базовая среда для органоидных культур и буфера для разложения органоидов
OPTI-MEMThermo Fisher Scientific11058021Вирусные плазмиды среда для трансфекции
Фетальная бычья сывороткаCorning35-011-CVКомпонент среды для сбора вирусов и среды 293T
Pen/StrepThermo Fisher Scientific15140122Компонент среды для органоидных культур и буфера диссоциации крипты
PBS (без Ca2+, Mg2+)Thermo Fisher Scientific10010049Промывочный буфер и компонент буфера диссоциации крипты
Mem-NEAAThermo Fisher Scientific11140050Компонент органоидной питательной среды
GlutamaxIIThermo Fisher Scientific35050061Компонент органоидной питательной среды
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Компонент органоидной питательной среды
EGFMillipore SigmaE9644Компонент органоидной питательной среды
NogginPeprotech250-38 BКомпонент органоидной питательной среды
R-спондинR& D7150-RS-025/CFКомпонент органоидной питательной среды
Человеческий рекомбинантный инсулинMillipore SigmaI9278-5mlКомпонент органоидной питательной среды
НикотинамидMillipore SigmaN3376-100GКомпонент трансдукционной среды
Wnt3AR& D5036-WN-010Компонент трансдукционной среды
Y27632Millipore SigmaY0503-1MGКомпонент трансдукционной среды
0,5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020Компонент буфера диссоциации крипт
DTT (дитиотреит)Thermo Fisher ScientificR0861Компонент буфера диссоциации крипт
Dispase IMillipore SigmaD4818-2MGКомпонент буфера для разложения органоидов
DNase IMillipore Sigma11284932001Компонент буфера для разложения органоидов
matrigel (Сниженный фактор роста)Corning356231Используется в качестве матрицы для встраивания органоидов
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Среда для трансфекции в вирусную продукцию
ViralMag R/LOz BiosiencesRL40200Магнитные частицы вирусной трансдукции
Магнитная пластинаOz BiosiencesMF10000Магнитная пластина для облегчения вирусной трансдукции
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Агент для трансфекции в вирусном производстве
Poly-D-лизинMillipore SigmaA-003-EПокрытие для планшетов перед посевом 293T клеток
4% раствор формальдегидаBosterAR1068Раствор для фиксации органоидов
O.C.T встраиваемый компаундThermo Fisher Scientific4583SДля встраивания органоидов
5 мл Falcon полистирольные трубкиCorning352054
50 мл Falcon TubesSarstedt62.547.100
Orbitron rotator II Rocker ShakerBoekel Scientific260250
Olympus Инвертированный микроскоп CK30OlympusCK30для сканирования и подсчета крипт
Zeiss Axiovert 200 инвертированный флуоресцентныйNikonAxiovert 200для просмотра флуоресценции в криптах
Amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блок с мембраной Ultracel-100Milipore SigmaUFC910024Для концентрации вирусов
pluriStrainer 20 &микро; m (Cell Sither)pluriSelectАртикул 43-50020Для приготовления органоидных фрагментов
Falcon Cell Sither FisherScientific352340Для приготовления цирптов аналогичного размера после выделения крипты
Greiner CELLSTAR  многолуночные культивальные планшеты 48 лунок (ТС обработаны крышкой)Millipore SigmaM8937-100EAForD2:D37+D16:D37g Фрагменты органоидов
Животный штамм: C57BL/6JJackson Lab#000664Для культуры органоидов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи