Методическая статья

Мультиплексированных изотермической амплификация на основе диагностики платформы для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1

DOI:

10.3791/57051

⸱

13 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий мультиплексированных диагностики для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге вирусов требуется Комплекс пробоподготовки и дорогой аппаратуры и трудно для использования в условиях ограниченных ресурсов. Мы покажем диагностики, который использует изотермической амплификация с целевыми стренги переносные датчики для обнаружения и дифференцировать эти вирусы с высокой чувствительностью и специфичностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зика, денге и чикунгунья вирусы передаются комарами, вызывая заболевания с похожими симптомами пациента. Однако они имеют различные течению пациента к пациенту передачи потенциалы и требуют весьма различные лечения пациентов. Таким образом недавние вспышки Зика делают настоятельно необходимым разрабатывать инструменты, которые быстро дискриминацию этих вирусов в больных и ловушку комаров, чтобы выбрать правильное лечение пациентов и чтобы понять и управлять их эпидемиологии в режиме реального времени.

К сожалению, текущие диагностические тесты, включая те принимающей 2016 чрезвычайной использовать разрешения и фаст трек статус, выявления вирусной РНК обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая требует инструментария, обучение пользователей, и значительные пробоподготовки. Таким образом они должны быть отправлены в «утвержденных» эталонных лабораторий, требует времени. Действительно, в августе 2016, центр по контролю за заболеваниями (CDC) спрашивал беременных женщин которые были укусил комар и разработал Зика показывая сыпь ждать неприемлемым 2 до 4 недель до обучения, ли они были инфицированы. Нам очень нужны тесты, которые можно сделать на сайте, с мало ресурсов и подготовленных, но не обязательно лицензированным персоналом.

Это видео демонстрирует assay который удовлетворяет эти спецификации, работа с мочой или сыворотки (для пациентов) или щебень комаров туши (для экологического наблюдения), все без много пробоподготовки. Комаров тушки фиксируются на бумаге, перевозящих четвертичных аммониевых групп (Q-бумага) следуют аммиака лечения для управления биологической опасности. Эти затем непосредственно, без изоляции РНК, помещаются в Пробирной пробирки, содержащие лиофилизированной реагенты, которые нужно не цепи охлаждения. Изменение формы обратной транскрипции цикла опосредованной изотермической амплификация с целевой объект специфического дневно тегами переносные датчики производит индикация, в 30 мин, как сигнал трехцветной флуоресценции. Это визуализируется с КПК, аккумуляторный устройство с фильтром оранжевый. Форвард загрязнение предотвращается с герметичных труб и использование термолабильных урацила ДНК glycosylase (ПХГ) в присутствии dUTP в смеси амплификации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Москиты вирусных инфекций, включая денге и чикунгунья Зика вирусы находятся на стратегии немедленного управления ростом и спросом. Денге и чикунгунья вирусы уже являются эндемичными во многих тропических регионах, где Зика сейчас распространяется в Западном полушарии1. Зика вирус, как лихорадка денге, является членом семейства Flaviviridae и родной Африке с одной азиатской и два африканских генетических линий2. Даже несмотря на то, что выявление вируса Зика восходит к 1947, Зика инфекции в организме человека оставалась спорадические за полвека до возникающих в Тихоокеанском регионе и в Америке. Первая вспышка сообщил Зика, лихорадка произошло на острове Яп Федеративных Штатов Микронезии в 2007 году, затем Французской Полинезии в 2013 и 2014. Первая крупная вспышка в Америке произошло в 2015 году в Бразилии.

Зика, чикунгуньи и денге вирусы передаются главным образом Aedes aegypti и Aedes albopictus. Однако Зика имеет возможности дополнительных течению передачи от человека, скорее всего распространяются через половой контакт, мать плод взаимодействия и через кормление грудью3,4,5. Зика лихорадка была впервые считается, вызывают только легкую форму заболевания. Однако, позже он стал связанных с синдром Гийена-Барре в взрослых, микроцефалия в новорожденных и хронических заболеваний опорно-двигательного аппарата, которые могут последних месяцев до лет. Диагноз болезни Зика может быть сложным, так как симптомы инфекции Зика, аналогичны другим комаров распространение вирусов6. Общие коинфекций этих вирусов сделать дифференциальный диагноз, даже более сложной,7,8. Таким образом быстрое и надежное обнаружение нуклеиновых кислот от Зика и других вирусов необходима для понимания эпидемиологии в режиме реального времени, начать контроля и превентивных мер, а также управлять ухода за пациентами9.

Текущий диагностические тесты для этих вирусов включают серологических тестов, изоляции вируса, вирус последовательности и реверс транскрипция ПЦР (RT-PCR). Стандартные серологические подходы часто страдают от недостаточной чувствительности и результатов может быть осложнено перекрестной реактивности у больных, которые ранее были заражены другими flaviviruses.

Таким образом тестирование нуклеиновой кислоты остается наиболее надежным способом обнаруживать и различать эти вирусы. Обнаружение Зика и других вирусов, переносимых комарами обычно выполняется с помощью ПЦР- или RT-ПЦР в реальном времени в различных биологических жидкостях, например сыворотки крови, мочи, слюны, Семен, грудное молоко и мозговой жидкости10,11. Пробы мочи и слюны предпочтительней как правило крови, так как они обладают менее ПЦР ингибирование, высоких вирусных нагрузок, присутствие вирусов на более длительные периоды времени и увеличение облегчения сбора и обработки12,13. Диагностические тесты, основанные на RT-PCR, однако, включают действия по подготовке обширной выборки и дорогих термического Велоспорт оборудования, что делает его менее оптимальных для точки обслуживания.

Обратная транскрипция, петля опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) стала мощной альтернативой RT-PCR из-за его высокой чувствительности и специфичности14, его терпимость ингибирующих веществ в биологических образцов15, и операция на одной температуры, что значительно снижает пробирного сложность и связанные с этим расходы, что делает его пригодным для ограниченных ресурсов сред. RT-лампа, классически реализованное состоит из шести грунты, которые связывают с восьми различных регионов в рамках целевого РНК. Он запускается при постоянной температуре от 60 ° C до 70 ° C и использует обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы с сильным нити, вытесняя деятельности.

На начальных этапах RT-лампа вперед и назад внутренней грунтовки (МФП и BIP, рис. 1A) наряду с внешней вперед и назад грунтовки (F3 и B3) образуют структуру Гантель, семя структура экспоненциального Усилительная лампа. Результаты в формировании concatemers с несколькими повторяющимися циклы16, и усиления далее ускорить цикл вперед и назад грунтовки (LF и LB), которые предназначены для связывания одного мель регионах Гантель. Классическая LAMP assays зависимости мутности или индикации ДНК, интеркалирующие красители не совсем подходит для обслуживания точки обнаружения Зика, где некоторый уровень мультиплексирования является желаемой17,18,19. Мультиплексирование не получается легко в этих системах, поскольку они склонны к генерации ложных срабатываний из-за уточнениями пробить.

Чтобы управлять этими вопросами, литературе добавляет дополнительный компонент в виде «Стрэнд вытесняя зонд» классическая RT-лампа архитектуры20,21,22. Каждый датчик имеет последовательность специфичных двухручьевой региона и региона одноцепочечной грунтовки. Зонд с регионом одноцепочечной маркирован с 5'-Флюорофор, и дополнительных зондов изменяется с 3'-конце утоления. В отсутствие целевого объекта не флуоресценции наблюдается за счет гибридизации взаимодополняющих зонд нитей, который приносит Флюорофор и утоления в непосредственной близости. При наличии цели одноцепочечной части флуоресцентного зонда связывается с его дополнением на цель и затем продлен на прядь, вытесняя полимеразы. Дальнейшее расширение полимеразы на обратный грунтовки причины разъединения утоления прядь от его взаимодополняющих дневно обозначенные strand, позволяя выбросов флуоресценцииРисунок 1B) (). С этой конструкции сигнал генерируется после формирования Гантель, уменьшая шансы ложных сигналов.

Double-stranded часть зонд прядь вытесняя может быть любой последовательностью, и когда применяется мультиплексирование, та же последовательность может использоваться с различными Флюорофор утоления парами. С этой архитектуры, загрязненных вирусом мочи, сыворотки или комаров образцы сплющенным на бумаге непосредственно были введены в assay без предварительной подготовки образца. Трехцветная флуоресценции read-outs видна человеческому глазу были получены в течение 30-45 мин, и сигналы были визуализированное окно 3D-печати наблюдения, которое использует синий светодиод и оранжевый фильтр. Паром для лиофильной сушки реагенты RT-лампа включена развертывания этого комплекта для снижения параметров ресурсов без необходимости охлаждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Комаров были единственные животные, которые непосредственно используются в настоящем исследовании. Процедуры по управлению кур, чья кровь была использована кормить инфицированных комаров, были одобрены как протокол IACUC #201507682 университета Флориды институционального ухода за животными и использование Committee.Virus распространения и комаров инфекции исследования были выполняется на объекте BSL-3 Флорида медицинская лаборатория энтомологии в Веро-Бич, FL. RT-лампа эксперименты были проведены в лаборатории BSL-2, совместно FfAME и Firebird биомолекулярных наук ООО в Алачуа, Флорида.

1. дизайн праймеров и Strand вытесняя зонды

  1. Извлечь вирусный последовательности для денге 1 из Института широкой базы данных23; последовательности для Зика и чикунгунья NIAID патогенный вирус базы данных и анализ ресурсов24.
    1. Создание множественных выравниваний последовательности (СУУ) для последовательностей интерес с помощью программного обеспечения мышц v3.8.3125. Использовать сгенерированный СУУ для поиска лампа грунтовки наборы сохраненных региона цели и избежать не соответствующим или непредвиденных целей, таких как различия между подтипы целевого объекта.
  2. Следовать правилам дизайн для грунтовки лампа как описано онлайн (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) и разрешить использование смешанных баз в грунтовки для покрытия вирус расхождение26. Чтобы избежать перекрестной реактивности грунтовка наборов, Сравните созданные лампа грунтовки базу данных NCBI РНК вируса, с помощью NCBI взрыва27. Сравните каждый набор для устранения грунты, которые будут dimerize в мультиплексированном assay, а также используя NCBI взрыва.
  3. Экран double-stranded часть зонд прядь вытесняя против любого вирусного генома и комаров геномные последовательности. Измените 5'-концы целевого объекта привязки зонда с флуоресцеин amidite (FAM), краситель HEX и 5-carboxytetramethylrhodamine (ТАМРА) краситель для Зика, чикунгуньи и денге 1, соответственно.
    1. Включать положительный контроль грунтовка для мочи. Дизайн лампы грунтовки целевой митохондриальной ДНК человека. Этикетка зонд прядь вытесняя с TET на 5'-конце. Зонды утоления метки, которые частично дополняют каждому дневно помечены зонд с утоления (например, Айова черно-FQ) на 3'-конце (Таблица 1).

2. вирус изолирует и инфицированных комаров образцов

  1. Использование изолирует Зика вирус (Пуэрто-Рико штамм), вирус чикунгуньи (штамм La Réunion или Британские Виргинские острова) и вирус денге серотип-1 (Ки-Уэст штамм). Определите вирусную титры с помощью налета пробирного28 или количественной ПЦР-29. Экстракт вирусной РНК, использование коммерчески доступных РНК добыча комплекты.
    Примечание: Таблица 2 представляет вирусная титры каждого изолят вируса, используемые в данном исследовании.
  2. Последующие статьи, опубликованной Yaren et al. для подробного протокола о заражении А.е. aegypti самок с Зика и чикунгунья вирусов20. Для вирусный титр образца комаров, инфицированных вирусом Зика см. таблицу 2 .

3. Наряду с термолабильных урацила ДНК Glycosylase RT-лампа

  1. 10 x приготовления раствора грунт.
    1. Подготовить раствор 100 мкм каждого праймера и зонд (см. шаг 1), добавив нуклеиназы свободной воды. Вихревой хорошо и хранить при температуре-20 ° C до использования.
    2. 10 X грунтовка смеси для каждой Зика, денге 1 или митохондриальной ДНК мишени, смесь 16 мкл МФП, 16 мкл BIP, 2 мкл F3, 2 мкл В3, 5 мкл LF, 2 мкл LB, 3 мкл LB-люминесцентные помечены зонд, 4 мкл утоления зонда и 50 мкл нуклеиназы свободной воды дать в общей сложности 100 мкл тома.
    3. Для 10 X грунтовка микс для чикунгунья, смешать 16 мкл МФП, 16 мкл BIP, 2 мкл F3, 2 мкл В3, 5 мкл LB, 2 мкл LF, 3 мкл LF-люминесцентные помечены зонд, 4 мкл утоления зонда и 50 мкл нуклеиназы свободной воды дать в общей сложности 100 мкл тома.
      Примечание: Зонд концентрация описанных выше использует 300 Нм окончательный флуоресцентного зонда и 400 Нм утоления зонда. Кроме того, использование 80 Нм дневно обозначенные зонд и 200 Нм ее утоления зонд для реального времени анализа.
  2. 5 мкл 10 X смеси праймера (для 3-plex, добавить 5 мкл каждого 10 X грунтовка микс), 5 мкл 10 X буфер изотермической амплификация (1 X буфер состав: 50 мм KCl, 10 мм (NH4)220 мм трис-HCl буфере рН 8,8, т4, 8 мм MgSO4 0.1% Tween-20, 1 мм DTT), 7 мкл dNTP смеси (10 мм dATP, дЦТФ и dGTP, 5 мм dTTP и dUTP), 16 единиц ДНК-полимераза, 15 единиц обратной транскриптазы, 80 единиц ингибитора рекомбинантных рибонуклеаза, 2 единицы термолабильных UDG, 1-2 мкл различное количество vi RAL РНК и воды, довести объем до 50 мкл в 0,25 мл ПЦР трубки (см. Таблицу материалы).
  3. Включите анализы отрицательного контроля на данном этапе, заменив вирусной РНК тома с водой. Проинкубируйте образцы между 65-68 ° C за 45 минут до 1 часа, а затем анализировать, выполнив 5 мкл каждого образца на 2,5% агарозном геле в 1 X TBE буфер, содержащий бромид ethidium (0,4 мкг/мл). Используйте 25 bp или 50 bp лестница ДНК как маркер на геле.
    Примечание: Добавление непромысловых конкретного шаблона является необязательным.
  4. Чтобы обнаружить присутствие патогенных РНК, проверьте каждого набора грунта и его нет шаблон управления, различной температуры и/или магния концентрации, так как каждый набор грунтовка RT-лампа была разработана для работы в различной температуры (65 ° C до 68 ° C) или магния концентрации (окончательный 6-10 мм). Подготовьте экспериментов при комнатной температуре.

4. RT-лампа с использованием вирусной РНК шипами мочи

  1. Теста RT-лампа грунтовки в различных окончательный концентрации мочи (0%, 10%, 20% и 50%) по 50 мкл объема общей реакции. Для 10% концентрации окончательной мочи добавьте 1 мкл вирусной РНК 5 мкл мочи. Для 20% концентрации окончательной мочи добавьте 1 мкл вирусной РНК в 10 мкл мочи. Для концентрации 50% окончательной мочи добавьте 1 мкл вирусной РНК в 25 мкл мочи.
  2. Для реального времени наблюдения за RT-лампа в 10% мочи, используйте инструмент ПЦР в реальном времени (см. Таблицу материалы) с различными Флюорофор фильтрами.
    1. Для чтения флуоресценции сигналы от FAM-меченых ампликонов для Зика, используйте фильтр от 483 до 533 Нм; для HEX-меченых ампликонов для чикунгунья, используйте фильтр от 523 до 568 Нм; для ТАМРА меченых ампликонов денге 1, используйте фильтр от 558 до 610 Нм; и для тет меченых ампликонов митохондриальной ДНК, используйте фильтр от 523 до 568 Нм.
      Примечание: FAM имеет возбуждения и выбросов Максима 495 нм и 520 Нм, соответственно. HEX имеет возбуждения и выбросов Максима 538 Нм и 555 Нм, соответственно. ТАМРА имеет возбуждения и выбросов Максима 559 Нм и 583 Нм, соответственно. Тэт имеет возбуждения и выбросов Максима 522 Нм и 539 Нм, соответственно.
  3. Использование 96-луночных пластины и уплотнение пластину с прозрачной пластиковой листа, затем Проинкубируйте образцы на 65-68 ° C 60-90 мин и записывать флюоресценция каждые 30 сек с использованием света cycler. Первоначально используйте 80 Нм дневно обозначенные зондов, а затем испытания 300 Нм дневно обозначенные зондов.
    1. Определите, что предел обнаружения для каждого целевого компьютера, добавляя серийно разбавленный вирусной РНК в окончательной мочи 10% концентрации.
      Примечание: Используйте реального времени RT-лампа для определения оптимальной температуры, концентрации магния, дневно обозначенные зонд концентрация и время реакции.
  4. Чтобы визуализировать флуоресценции, порожденных стренги переносные датчики на глаз, используйте голубой светодиодный источник света от света циклователь с возбуждением в 470 Нм (любое поле электрофореза геля с встроенным синий источник света будет работать, см. таблицу материалов) и записать образ с камерой мобильного телефона при комнатной температуре в темноте.
    Примечание: Использование 300 Нм дневно обозначенные зондов, когда требуется визуализация всех трех цветов от глаз, используя синий светодиод.

5. RT-лампа на обнаружение Зика инфицированных комаров с помощью Q-бумажной технологии

  1. Подготовьте четвертичного аммония изменение фильтра бумаги (Q-), согласно опубликованной ранее методы с незначительными изменениями30.
    1. Погружайте 1 g целлюлозы Бумага фильтровальная кругов (см. Таблицу материалы) диаметром 3,5 см в 50 мл 1,8% водного раствора NaOH 15 мин для активации.
    2. Собрать активированные бумаге круги путем вакуумной фильтрации и затем погрузить их в 40 мл водного раствора хлорида (2,3-epoxypropyl) триметиламмония (0,28 g) на ночь при комнатной температуре.
      Примечание: Держите массе хлористого триметиламмония (2,3-epoxypropyl) фильтр-бумаги на 0.28 до 1.
    3. Собирать результате Катионный бумаги, вакуумной фильтрации и нейтрализовать с 50 мл 1% уксусной кислоты.
    4. Вымойте бумаги три раза с этанолом и просушите под капотом с постоянным потоком воздуха.
  2. Вырежьте Q-бумажные листы в небольшие прямоугольники (3 x 4 мм) с использованием бумаги удар или ножницы. Раздавить А.е. aegypti женского комаров, потенциально инфицированных Зика на каждом бумаге с микро пестиком.
  3. Добавить каждой бумаги 20 мкл раствора 1 М Водный аммиак (≈ 12 рН) и подождать 5 мин. Затем промывайте каждый документ раз с 20 мкл 50% EtOH и один раз с 20 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Воздушно-сухой бумаги в области биобезопасности BSL-2 кабинета для около 1 ч.
    Примечание: В этой точке, образцы могут храниться при температуре-20 ° C ночь до использования.
  4. С помощью пинцета, каждый документ в 100 мкл реакционной смеси RT-лампа и Инкубируйте на 65-68 ° C на 45 мин убедитесь, что полностью погрузите бумаги в решении; она не должна плавающей. Чтение и запись флуоресценции, вытекающих из Зика вирус, используя синий светодиодный источник света и оранжевый или желтый фильтр.

6. лиофилизация реагентов RT-лампа для 100 мкл реакции тома

  1. Подготовка 10 X лампа грунтовка смеси согласно разделу 3.1 и подготовить dNTP смесь, содержащую dUTP согласно статье 3.2. Хранить смесь грунт и дНТФ при-20 ° C до использования.
  2. Подготовка 10 мл фермента диализа буфера для удаления глицерина, смешивая 100 мкл 1 М трис-HCl рН 7,5, 500 мкл 1 м KCl, 2 мкл 0,5 М ЭДТА, 100 мкл 10% Тритон X-100, 100 мкл 0,1 М DTT и 9.198 мл воды, свободной от нуклеиназы. Магазин в буфер диализа при 4 ° C.
    Примечание: Убедитесь, что фильтр (фильтры 0,2 микрон) всех буферных растворов реагентов до использовать и хранить их на 4 ° C.
    1. Используйте ультрафильтрационные мембраны с 10 кДа пороговое предельное (см. Таблицу материалы). Место 350 мкл буфера диализа, 4 мкл 32 единиц ДНК-полимеразы, 2 мкл 30 единиц обратной транскриптазы и 2 мкл 80 единиц АБС битор РНКазы ультрафильтрационные мембраны и центрифуги в 14.000 x g 5 мин при 4 ° C.
    2. Добавьте еще 350 мкл буфера диализа ультрафильтрационные мембраны и центрифуги (14.000 x g) для еще 5 мин пустой коллекции трубки и повторите этот шаг, затем центрифуги (14.000 x g) 3 мин.
    3. Для элюции инвертировать мембраны и место в новой коллекции трубки. Спина на 1000 x g на 2 мин мера элюции тома; Если меньше, чем 8 мкл, доводят объем до 8 мкл, добавив диализа буфера. Хранить элюции при температуре 4 ° C и сразу же переходите к следующему шагу.
      Примечание: Этот протокол для однотрубных лиофилизации, но подготовить по крайней мере 10 реакции трубы одновременно с помощью же ультрафильтрационные мембраны и использовать то же количество диализа буфера.
  3. Смешайте 10 мкл 10 X лампа грунт, если singleplex (для 3-plex, добавить 10 мкл каждого 10 X грунтовка микс), 14 мкл dNTP смеси, 8 мкл dialyzed фермента смеси, 2 мкл 2 единиц термолабильных UDG и 66 мкл нуклеиназы свободной воды (для 3-plex Используйте 46 мкл) в пробки microcentrifuge 0,5 мл и оставьте крышку открытым. Вместо этого добавьте другой крышкой прокола иглой, чтобы позволить паров бежать.
  4. Немедленно заморозить трубы на-80 ° C 2 h и lyophilize трубки для 4 ч. Обложка лиофилизации камеры с алюминиевой фольги для защиты от света. Когда сушеные реагентов, удалите прокалываться крышки, закройте крышку оригинальный и хранить трубы с лиофилизованным реагентов при температуре 4 ° C в темноте.
    Примечание: Реагентов может быть лиофилизованный препарат на ночь, при необходимости.

7. Тестирование лиофилизированный RT-лампа реагентов на мочу и комаров образцы, содержащие Зика

  1. Используйте следующие элементы из комплекта (см. Таблицу материалов) для Зика: окно наблюдения 3D-печати с оранжевый фильтр (длинный пас, вырезать на ~ 540 Нм), 2 батареи AAA для наблюдения за окно, лиофилизированный реакции трубки помечены ZV для обнаружения Зика, и 1.1 X регидратации буфера в завинчивающейся крышкой 1,5 мл пробирок.
  2. Подготовка 50 мл 1.1 X регидратации буфера путем смешивания 5,5 мл 10 X буфер изотермической амплификация, который поставляется вместе с ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалы), 3,3 мл 100 мм MgSO4, 110 мкл 0.5 м DTT и 41.09 мл воды, свободной от нуклеиназы. Перемешать, аликвота 1 мл этого раствора для 1.5 мл пробирок завинчивающейся крышкой и хранить при 4 ° C до использования.
  3. Мкл 90 1.1 X регидратации буфера к каждой пробке реакции (0,5 мл). Убедитесь, что жидкость заполняет в нижней части трубки, содержащую лиофилизированные реагентов (растворить их с смешивания путем встряхивания, затем кратко вращаться вниз (1000 x g)). 10 мкл мочи шипами с вирусной РНК в реакции труб (см. раздел 4.1 для подробной информации).
    1. Если тестирование комаров, добавить прямоугольник Q-бумаги Холдинг комаров туши (как подготовленные в шаги описаны в разделах, 5.2 и 5.3), наряду с 10 мкл очищенной воды вместо мочи.
      Примечание: в качестве альтернативы, 10 мкл образцов слюны или сыворотки вместо мочи. Если образцы имеют извлечения ДНК или РНК, 2-5 мкл пример в регидратированных смесь и в комплекте с свободной от нуклеиназы водой до 10 мкл объема окончательного образца.
  4. Закройте крышку трубки реакции. Поместите их в тепла блок/ванна (или инкубатор) предварительно установить на 65-68 ° C. Инкубируйте 30-45 мин, но не более чем 1 час. После инкубации извлеките трубку от жары. Чтобы предотвратить загрязнение будущих анализов, убедитесь, что эти трубы остаются закрытыми.
  5. Место труб реакции в поле наблюдения; температура упадет до температуры окружающей среды (предпочтительно 25 ° C). Включите переключатель на задней части поле наблюдения. Наблюдать за образец через оранжевый фильтр и захватить изображение на камеру мобильного телефона, которая проходит на расстоянии, где изображение заполняет 80% поле зрения.
    Примечание: Лучше визуализация достигается в средах с низкой света.
  6. После завершения визуализации, выключите выключатель. Храните герметичные трубы в темноте, предпочтительно с охлаждением, если позднее визуализации требуется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первоначально выступления каждого праймера RT-лампа (таблица 1) с его соответствующего вирусной РНК субстрата, а также негативный контроль были оценены электрофорезом геля. RT-лампа грунтовки были разработаны для целевого региона NS5 (РНК зависимой РНК-полимеразы) для Зика и денге 1 и nsP2 региона (структурно-белка P2) для чикунгунья. Шаблоны были всего РНК, извлеченные из вирусного запасов культивировали в африканских зеленых мартышек почек (Vero) клеток. В одном случае,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Москиты вирусов, включая Зика, чикунгуньи и денге угрожают общественного здравоохранения и недавние вспышки голы Зика потребность в лоу кост обслуживания точки обнаружения альтернатив для диагностики пациентов, а также для наблюдения комаров. Изотермическая амплификация методы были разработаны доступные альтернативы для систем на базе ПЦР. В частности RT-лампа-платформ были применены к обнаружить широкий спектр патогенных микроорганизмов. Однако использование изотермический платформ был главным образом ограничивается одн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько авторов и их институтов владеть интеллектуальной собственности, связанные с этот assay.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа частично поддержали FDOH-7ZK15 и NIAID 1R21AI128188-01. Исследования в этой публикации было поддержано в части национальных институтов аллергии и инфекционных заболеваний и в части биомедицинских исследований программы из Флорида Департамента здравоохранения. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения низ или Флорида Департамента здравоохранения. Динамический Комбинаториальная химия ООО признается за их поддержку и вклад в этот проект.

Вирус денге 1 (штамм Бол-KW010) был любезно представил Флорида Департамент здравоохранения бюро лабораторий. Зика вирус и азиатских lineage вирус чикунгуньи любезно предоставил центрами по контролю и профилактике заболеваний. Индийского океана lineage вирус чикунгуньи была любезно предоставленных Роберт Теш (Всемирный консультационный центр для новых вирусов и арбовирусов, через университет Техаса Медицинское отделение в Галвестон, штат Техас) для UF-FMEL. Мы благодарим S. Беллами, B. Истмонд, S. Ортис, D. Велес, K. Уиггинс, р. ZimLer и K. Zirbel за помощь с исследованиями инфекции. Мы также благодарим м. S. Ким за предоставление Q-бумаги.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система осветителя / электрофореза SafeBlue, MBE-150-PLUSMajor ScienceMBE-150Гель для электрофореза
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-луночныйRoche Applied Science05 015 278 001Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Центробежный фильтрующий блок с мембраной Ultracel-10Millipore SigmaUFC501096ультрафильтратон мембрана для диализа
Eppendorf 5417C ЦентрифугаMarshall ScientificEP-5417CЦентрифуга
Myblock Mini DrybathBenchmark ScientificBSH200drybath
FreeZone Plus 6 литров Каскадная консоль Система сублимационной сушкиLabconco7934020лиофилизатор
все приеры и зондыIDTcustomRT-LAMP праймеры и зонды
набор dNTPBiolineBIO-39049
Дезоксиуридин трифосфат (dUTP)PromegaU1191
Bst  2.0 WarmStart  ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0538Lфермент
WarmStart RTx Обратная транскриптазаNew England BiolabsM0380Lфермент
РНКаза Ингибитор, мышьEngland BiolabsM0314Lфермент
Антарктический термолабильный UDGNew England BiolabsM0372Lфермент
50bp ДНК стремянкаPromegaG4521маркер
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, белыйRoche Прикладная наука4729692001анализ RT-LAMP в реальном времени
New

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636(2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685(2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295(2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065(2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605(2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22(2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226(2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Multiplexed Isothermal AmplificationPoint of Care DiagnosticsRT LAMP AssayZika Virus DetectionChikungunya Virus DetectionDengue Virus DetectionQ Paper TreatmentFluorescent Probe ReadoutHandheld Observation DeviceThermolabile UDG Prevention

Похожие статьи