Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57067

⸱

14 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Fribourg

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе мы описываем протоколы для расследования роли внеклеточных везикулы (EVs) выпущен в эритроцитах Plasmodium falciparum инфицированных. В частности мы сосредоточены на взаимодействии EVs с эндотелиальных клеток.

Аннотация

Малярия — это болезнь, угрожающих жизни, вызванной Plasmodium паразитов, с P. falciparum наиболее распространенных на африканском континенте и ответственность за большинство случаев смерти, связанных с малярией во всем мире. Эволюция заболевания малярии инфицированных людей влияют несколько факторов, включая поглощение паразита в тканях, сосудистые дисфункции и воспалительные реакции. P. falciparum-зараженные красные кровяные клетки (iRBCs) релиз малых внеклеточного везикулы (EVs), содержащие различные виды грузов молекул, которые посредником патогенеза и сотовой связи между паразитов и хост. EVs, эффективно поглощаются клетки, в которых они модулировать их функции. Здесь мы обсуждаем стратегии для рассмотрения роли EVs в паразита хост взаимодействий. Во-первых мы опишем простой метод для маркировки и отслеживания EV интернализации эндотелиальных клеток, использованием компоновщика красителя Зеленые ячейки. Во-вторых мы приводим простой способ измерения проницаемости через эндотелиальные клетки однослойная с помощью дневно обозначенные декстрана. Наконец мы покажем, как расследовать роль малых молекул РНК-кодирования в функции эндотелиальных клеток.

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения там были 212 миллионов новых случаев заболевания малярией во всем мире к 2015 году и приблизительно 429,000 человек погибло, главным образом детей младше пяти лет возраст1. Механизмы, ведущие к тяжелой болезни, которая часто ассоциируется с сосудистой дисфункции, остаются нечетко2. Plasmodium- iRBCs выделяют небольшие Би липидные мембраны сферах, известный как внеклеточного везикулы (EVs). Известно, что эти EVs потенциально имеющих отношение к процесс инфицирования и иммунного ответа к инфекции; Однако мало что известно о точной функции этих мелких пузырьков во время малярия инфекции3. Вполне возможно, что они играют две важные функции: с одной стороны, они могли бы содействовать патогенеза, активизируя макрофаги4,5; и с другой стороны, они могут быть посредником сотовой связи между паразитов и паразитов и разместить6,7. В самом деле паразиты могут передавать белки и нуклеиновые кислоты между друг с другом через EVs. К примеру Trypanosoma brucei rhodesiense EVs могут передавать фактор вирулентности Serum Resistance-Associated (SRA) и можно ориентировать другие т. brucei и принимающих эритроцитов8. Кроме того P. falciparum- iRBCs общаться друг с другом путем передачи нуклеиновых кислот в EVs. Это позволяет паразитов для оптимизации и синхронизировать ее роста. В самом деле EVs могут быть основной регулятор gametocyte преобразования и поэтому способствуют регуляции передачи этап7.

Не только сделать EVs регулировать паразитов, они также посредником паразит хост взаимодействий. Недавно мы обнаружили, что EVs от iRBCs содержат хост производные микроРНК (интерферирующим; малые РНК видов в диапазоне 21-25 нуклеотидов9), которые были приняты эндотелиальных клеток человека. Адаптивной в EVs образуют прочную комплекс с давности2 (членом РНК индуцированной глушителей комплекс), который после доставки на получателя ячейки, способен специально подавления экспрессии генов и затрагивающих барьерные свойства ячейки10. Были разработаны стандартные протоколы исследовать функцию EVs. Здесь мы сначала описать протокол, который позволяет люминесцентные маркировки EVs расследовать их усвоение клетками получателей. Кроме того с помощью конфокального микроскопа, можно проследить судьбу EV внутри клетки. Несколько флуоресцентных красителей могут использоваться для отслеживания EVs. Амин реактивных красителей, 5-(and-6)-Карбоксифлуоресцеина диацетата Succinimidyl эфира (CFSE) и Флуорексон-ам становится люминесцентные раз внутри везикул. Мы предпочитаем использовать метку амфифильных PKH, потому что он дает сигнал ярче и более равномерным. Этот подход обеспечивает важную информацию, чтобы понять взаимодействие между EVs и получателей клетки. Хотя в некоторых случаях EVs привязать к поверхности клеток, некоторые везикулы быстро take up. После поглощения EVs доставки их грузов в клетки, в которых они оказывают свои нормативные функции.

Здесь мы описываем протокол для измерения барьерной функции эндотелиальных клеток в пробирке путем определения количественных показателей передачи флуоресцентные декстран через сотовый монослоя. Более чувствительные Трейсеры может использоваться как radiolabeled маркеров. Однако они требуют особых мер предосторожности для использования. Другие анализы существуют для оценки функции барьера в пробирке , например трансэндотелиальной электрическое сопротивление (ТЕЕР), который измеряет туго Джанкшен целостности. Наконец визуализации ZO-1, белок плотный узел, с помощью иммунофлуоресцентного позволяет оценку целостности жесткие соединения как хорошо10. Так как EVs сложной и разнородной сущности, содержащие несколько грузов с потенциальными нормативной характеристикой, полезно overexpress конкретные РНК для изучения его воздействия на получателей ячейки. Таким образом мы также определить протокол, который направлен на создание стабильных клеточных линий, выражая Мирна интерес10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Человека эритроциты были получены от крови здоровых доноров, в соответствии с руководящими принципами Swissethics (swissethics.ch).

Примечание: P. falciparum паразита культур (3D 7) и EV производства были ранее описанные в Mbagwu, и др. 11 потому что P. falciparum человеческий патоген, консультироваться местные правила для обработки. Культуры должны храниться стерильные весь время.

1. флуоресценции маркировки EVs

Примечание: Следующая процедура использует маркировки технологии для стабильно включения зеленого флуоресцентного красителя (PKH67) с большими алифатических хвосты в регионе липидные мембраны EV. Реакция проводится в 200 мкл окончательный пятнать тома, содержащие PKH67 конечная концентрация 20 мкм. Выполните все шаги при температуре (20-25 ° C)

  1. Место 100 мкг EVs в 1 мл PBS в пробки microcentrifuge.
  2. Центрифуга EVs в пробки microcentrifuge на максимальной скорости (20000 x g) за 7 мин в гранулах.
    Примечание: Поскольку гемин присутствует в EVs, красный темно коричневого Пелле должны соблюдаться. Если супернатант красноватые, лизированы EVs.
  3. После центрифугирования аспирационная супернатант тщательно, чтобы избежать удаления любых EVs.
    Примечание: Минимизируйте количество оставшихся буфера перед resuspending EVs в разбавителя C с целью повышения эффективности окрашивание и повторяемость.
  4. Ресуспензируйте Пелле EV в 100 мкл разбавителя C (2 X EV подвеска) и аккуратно пипетки для обеспечения полной дисперсии.
  5. Подготовить новые пробки microcentrifuge и добавить 4 мкл раствора обколоть красителя PKH67 100 мкл растворителя C. Vortex хорошо перемешать. Подготовьте этот раствор красителя 2 x (40 мкм) немедленно до окрашивания.
    Примечание: Чтобы избежать гетерогенных окрашивания, не добавляйте раствор спиртовой красителя PKH67 непосредственно в Пелле EV.
  6. Быстро объединить 100 мкл 2 X подвеска EV (шаг 1.4) с 100 мкл 2 X раствор красителя (шаг 1.5). Затем смешайте образца, закупорить вверх и вниз по 10 раз.
  7. Инкубируйте EV/краска подвеска из шага 1.6 5 мин защищены от света и микс vortexing 3 - 4 раза в течение 5 минут инкубации.
    Примечание: Инкубации подвеска EV/краска для больше раз обеспечивает никакое преимущество, потому что окрашивание происходит настолько быстро.
  8. Остановите окрашивание реакции путем добавления равного объема (200 мкл) сыворотки и инкубировать 1 мин разрешить связывание избыточного красителя.
    Примечание: Перед остановкой окрашивание, разрушающим сыворотки от EVs центрифугированием в 20,000 g x 20 мин.
  9. Вымойте 3 раза с PBS и спин вниз на 20000 x g 5 мин Ресуспензируйте EVs в 100 мкл PBS до конечной концентрации 1 мкг/мкл.

2. Визуализируйте поглощение EVs, конфокальная микроскопия

Примечание: Следующий протокол описывает отслеживания EV интернализации эндотелиальных клеток, выращенных на стекло coverslips. Эндотелиальные клетки являются полу увековечен костного эндотелиальных клеток человека, как описано в12.

  1. Работая в стерильных условиях, пальто coverslips с избытком 0,01% поли L-лизин за 10 мин при комнатной температуре (RT).
  2. Аспирационная поли L-лизин решения и позволяют coverslips полностью высохнуть.
  3. Выполните жизнеспособной эндотелиальных клеток игр, с помощью исключения Трипановый синий и Горяева.
  4. Передача 1 х 105 эндотелиальных клеток в 1 мл полной эндотелиальных клеток роста средних содержащие дополнения смесь поли L-лизин покрытием coverslips и пусть растут в монослое клеток.
    Примечание: Средство содержит факторы роста, которые позволяют клеткам формировать монослоя и формируют плотные соединения.
  5. После того, как клетки формируют монослоя, тщательно аспирационная среды и добавьте 1 mL свежих средних вымыть клетки. Повторите еще раз мыть. Добавьте 50 мкг PKH67-меченых EVs и проинкубируйте 4 ч.
    Примечание: Чтобы найти оптимальный момент для поглощения, время курс может быть проведена.
  6. После 4 ч аспирационная среднего и мыть ячейки 3 раза с PBS для удаления избыточных и несвязанных EVs. Исправьте клетки с 3% раствором параформальдегида в PBS на 15 мин.
    Примечание: Метанол может нарушить актина во время процесса фиксации; Таким образом это лучше, чтобы избежать любых метанола, содержащие фиксативов или других растворителей фиксаторы. Рекомендуется использовать метанол свободного формальдегида в качестве фиксатором.
  7. Вымойте клетки 3 раза с PBS. Добавьте тщательно 250 мкл 0,1% тритон X-100 в PBS для разрушения клеток. Инкубируйте на RT на 5 мин.
  8. Вымойте 3 раза с PBS. 400 мкл блокировки буфера (5% BSA в PBS), за 30 мин при RT блокировать неспецифической привязки.
  9. Вымойте клетки один раз с PBS. Подготовьте окрашивание раствора путем разбавления 5 мкл Фаллоидин Стоковый раствор в 200 мкл PBS/1% BSA за каждую крышку выскальзования. Накапайте 200 мкл окрашивание раствора на coverslip и проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
  10. Вымойте 3 раза с PBS. Counterstain ДНК для 30 s с Hoechst 33342 в конечной концентрации 2 мкг/мл в 200 мкл PBS.
  11. Вымойте 2 x coverslip, добавляя 400 мкл PBS. Тщательно захватить coverslip пинцетом и инвертировать его на вершине капля antifade монтаж СМИ на стеклянное скольжение. Осторожно удалите избыток средств массовой информации с ткани и печать каждой стороне с ногтей.
  12. Хранить слайды, защищенный от света при 4 ° C.
  13. Визуализировать клетки с помощью Конфокальный микроскоп лазера возбуждений 405, 488 и 543 Нм и 63 X, 1.3 цель нефти NA с Флуоресцентные выбросов на 450-470 Нм (синий), 505-530 Нм (зеленый) и 620 Нм.
    Примечание: Типичный F-актина окрашивание результаты показаны на рисунке 1.

3. эндотелиальных клеток проницаемость

Примечание: Эндотелиальных клеток проницаемость оценивается путем измерения передачи родамин B Изотиоцианаты декстрана (средняя 70 000 МВт) по всему монослою эндотелиальных клеток. Декстран обеспечивает отличный инструмент для изучения сосудистой проницаемости.

  1. Количество жизнеспособных эндотелиальные клетки, с помощью исключения Трипановый синий 0,4% и Горяева.
  2. Пластина эндотелиальных клеток на плотности тарелок 0,6 x 105 клеток до впадения в 24-ну тканевые культуры вставок (размер пор 0,4 мкм) и оставить нетронутыми для по крайней мере 5 дней сформировать дифференцированной монослои. Обновление среды каждый второй день.
  3. После того, как клетки достигают однослойные, нагрузка EVs (50 мг в 1 мл) на верхней палаты. Добавьте родамин декстран верхнего колодца в конечной концентрации 20 мг/мл. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
  4. Контролировать передачу флуоресцентные декстрана в нижней хорошо путем измерения флуоресценции выбросов от 40 мкл средних аликвоты. Настройка Считыватель микропланшетов мульти лейбл на 544 Нм возбуждения и 590 нм выбросов для измерений.
    Примечание: Количество рассеянного декстрана может быть определена количественно с помощью калибровочных кривых с Стоковый раствор. Кроме того может быть кинетическая эксперименты, удалив небольшие образцы средство внешней камеры во время курса (рис. 2). Даже без лечения через монослое клеток будет диффузный декстрана.

4. Определите Puromycin чувствительность

Примечание: Прежде чем преобразователя клеточных линий с человека, важно определить убить кривой выбранного препарата для этой конкретной ячейки строки. Чтобы определить минимальное количество концентрации препарата необходимо убить всех клеток, выполните дозы ответ эксперимент с использованием дополнительных доз выбранного препарата. Потому что каждая линия клеток млекопитающих имеет различную чувствительность, прежде чем эксперименты, оптимальная концентрация антибиотика должны определяться путем разработки кривой титрования убить как описано ниже.

  1. Подсчет количества ячеек, используя Горяева. Ресуспензируйте эндотелиальных клеток в концентрации 1 х 105 клеток/мл в полной эндотелиальных клеток роста носитель, содержащий дополнения микс.
  2. Пластина 1 x 104 клетки в 96-луночных плиту в окончательный объем 100 мкл эндотелиальных клеток среднего роста.
  3. 100 мкл среды, содержащие антибиотики для получения концентрации 0,1-10 мкг/мл (см. рис. 3).
  4. Изучите жизнеспособность клеток каждые 2 дня под микроскопом света, с использованием 20 X цель. Культура клетки для 10-14 дней и заменить средства массовой информации, содержащие puromycin каждые 2-3 дня в зависимости от роста клеток.
  5. Добавить 10 мкл/хорошо МТС реагента в каждую лунку, перемешать и проинкубируйте 4 ч при 37 ° C в условиях стандартной культуры.
  6. Коротко встряхнуть пластину на шейкер и измерения оптической плотности обработанных и необработанных клеток с помощью пластины читателя на 490 Нм (рис. 3).

5. трансдукции эндотелиальных клеток с лентивирусные вектор

  1. Пластина 1 х 105 эндотелиальных клеток в 1 мл полного среднего за день до трансдукции. Выполните трансдукции, когда клетки достигли 50-80% confluency.
  2. Оттепель человека на льду и сделать аликвоты вирусный запасов, чтобы избежать циклов замораживания оттаивания. Спин вниз материал на 200 x g 30 s, в трубы перед открытием чтобы избежать разлива.
  3. Добавьте hexadimethrine бромид к ячейкам в конечной концентрации 8 мкг/мл.
    Примечание: Hexadimethrine бромид помогает электромеханической эффективности, однако в некоторых случаях могут быть токсичны для клеток. Таким образом оптимальная концентрация должна определяться путем выполнения убийство кривой до трансдукции.
  4. Вихрем пластину осторожно, чтобы перемешать. Добавьте соответствующее количество вирусных частиц (между частицами6 0,5-2 x 10) на разносторонности подходит инфекции (МВД) и вихрем пластины слегка за 30 s смешивать.
  5. Центрифуга смесь клеток вирусных частиц в центрифуге на RT 45 мин на 300 x g для повышения эффективности трансдукции. Инкубируйте смесь клеток вирусных частиц при 37 ° C на ночь.
  6. Тщательно удалите вирусных частиц содержащих среднего и утилизируйте надлежащим образом. Замените его свежие, подогретым полной питательной среды.
  7. Начать выделение с puromycin на второй день: удалить носитель и заменить его с свежей средой, содержащей правильную концентрацию puromycin как определено ранее в разделе 4 (рис. 3).
  8. Урожай клетки после выбора puromycin и изолировать РНК с помощью РНК изоляции комплект следуя инструкциям производителя.
  9. Синтез cDNA с выбранной адаптивной, с помощью обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалов).
  10. Настройка реакции ПЦР согласно цитируется протокол13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы описываем протоколы для изучения взаимодействия EVs с клеток хозяина. Поглощение дневно обозначенные EVs контролируется confocal микроскопии (рис. 1). Эндотелиальных клеток эффективно рассматривать EVs, однако время инкубации с EVs могут быть оптимизированы для отслеживания поглощение. Для лучшей локализации EVs внутри клетки пятно актина с Фаллоидин. Далее мы используем мембране фильтра, на вершине которой растет монослоя эндотелиальных клеток. Рода...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Некоторые паразиты, включая Токсоплазма, Трипаносомы, лейшмании и трихомонады вызвать освобождение EVs зараженных принимающей ячейки. В зависимости от патогенов выпущенные EVs можно модуляции иммунного ответа или посредником сотовой связи между паразитов6. Тем не менее существует мало свидетельств о том, как эти небольшие пузырьки способствуют заболевания малярией. Здесь мы описали несколько способов, чтобы исследовать функцию EVs во время инфекции плазмодия . Например поглощение EVs полу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование финансово поддержали частично Фондом Новартис лечебно - и биологических исследований (для ПИМ), Готфрид и Джулия Бангертера-Rhyner-Stiftung (чтобы МВт и ПИМ), и исследования пул Фрибургского университета (для ПИМ). Дополнительные гранты включают швейцарского правительства Excellence стипендии для иностранных ученых (ЗСБ и SM). Мы благодарим Isabelle Fellay и Соланж Kharoubi Hess за технической поддержкой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini KitSigma-AldrichMINI67-1KT
Diluent CSigma-AldrichG8278
поли-L-лизинSigma-AldrichP8920
PBSThermoFisher - Gibco10010023
фаллоидин CF594Biotium#00045
Hoechst 33342ThermoFisherH3570
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
Родамин B изотиоцианат– DextranThermoFisherR9379-250MG
Вставка с ПЭТ мембраной прозрачная Falcon  для планшета 24 лункиFalcon353095
Endothelial Cell Growth  Medium MVPromocellC-22020
Puromycin dihydrochlorideSigma-AldrichP9620-10ML
MTS Пролиферация клеток Колориметрический наборBiovisionK300-500
гексадиметрина бромидSigma-Aldrich107689-10G
MISSION  Ленти микроРНК, Человеческий has-miR-451aSigma-AldrichHLMIR0583
MISSION Lenti микроРНК, ath-miR416, негативный контроль 1 Частицы трансдукцииSigma-AldrichNCLMIR001
MISSION  Lenti microRNA, HumanSigma-AldrichNCLMIR0001
Leica TCS SP5Leica Microsystems
miRNeasy mini KitQiagen217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 реакцийThermoFisher4366597
has-mir-451a  RT/750 PCR rxnsThermoFisher001141
U6 snRNAThermoFisher001973
TaqMan Universal Master Mix II, с UNGThermoFisher4440038
StepOnePlus Real-Time PCR SystemThermoFisher4376600

Ссылки

  1. WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727(2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PKH67
Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.