Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Этот метод демонстрируется визуализировать возбудителя вторжения в насекомое клетки с трехмерной (3D) модели. Hemocytes от дрозофилы личинки были инфицированы вирусных или бактериальных патогенов, ex vivo или в естественных условиях. Зараженных hemocytes были затем фиксированной и витражи для изображений с конфокального микроскопа и последующих клеточных 3D реконструкции.

Abstract

Во время патогенной инфекции Drosophila melanogaster, hemocytes играют важную роль в иммунной реакции на протяжении инфекции. Таким образом цель настоящего Протокола заключается в разработке метода для визуализации возбудителя вторжения в конкретных иммунной отсеке мух, а именно hemocytes. С помощью метода, представленные здесь, до 3 × 10⁶ живой hemocytes можно получить из 200 дрозофила 3^rd instar личинок в 30 минут для ex vivo инфекции. Кроме того hemocytes может быть зараженных в естественных условиях путем инъекций личинок 3^rd instar следуют кровяные добычи 24 ч после инфекции. Эти зараженные клетки первичной были исправлены, витражи и образы с помощью конфокальной микроскопии. Затем 3D представлений были созданы из изображений, чтобы окончательно показать возбудителя вторжения. Кроме того, можно получить РНК высокого качества для qRT ПЦР для выявления возбудителя мРНК следующие инфекции и достаточно белка могут быть извлечены из этих клеток для Западный анализ помаркой. Взятые вместе, мы представляем метод определенное согласование возбудителя вторжения и подтверждения инфекции, используя типы бактериальных и вирусных патогенов и эффективный метод для извлечения кровяные для получения достаточно живой hemocytes от дрозофилы Личинки для ex vivo , так и в естественных условиях инфекции экспериментов.

Introduction

Drosophila melanogaster это организм устоявшихся моделей для изучения врожденного иммунитета¹. Во время врожденный иммунный ответ hemocytes играют важную роль в ответ на вызов возбудителя. Hemocytes являются критическими для инкапсуляции паразитов, а также важную роль в борьбе против возбудителя через фагоцитарной действий во время грибковые, вирусные и бактериальные инфекции^2,3.

Для того чтобы лучше понять врожденный иммунный ответ хозяина патогенные микробные инфекции, важно для визуализации, как возбудитель поражает клетки хозяина во время инфекции. Эта визуализация способствует пониманию механизма вторжения. Вместе с детали внутриклеточной локализации возбудителя и клеточного ответа эти данные могут предоставить подсказки о принимающей реакции на инфекции и клеточных органелл, с которыми взаимодействует микроба. Таким образом 3D-модель восстановления после съемки по микроскопии может быть полезно определить точное местоположение патогенов в клетки хозяина. В этом исследовании мы визуализирована вторжения Coxiella burnetii (C. burnetii), возбудитель Ку-лихорадки, зоонозные болезни, которая представляет собой серьезную угрозу для здоровья человека и животных, в первичной Drosophila hemocytes. Недавно было продемонстрировано, что дрозофилы восприимчивы к биобезопасности уровня 2 9 км фаза II (NMII) клон 4 штамм C. burnetii и что этот штамм имеет возможность реплицировать в дрозофилы⁴, указанием что Дрозофила может использоваться в качестве модельного организма для изучения патогенеза C. burnetii .

Предыдущие исследования использовали hemocytes для изучения врожденный иммунный ответ хозяина. Hemocytes были использованы для морфологических замечания^5,6,7, морфометрический анализ^2,8, фагоцитоз анализ^2,3, qRT ПЦР^{2 , 9}, иммунопреципитация^10,11, immunofluorescent анализ^10,12, иммуноокрашивания¹³,^{, immunoblotting3,10 11} и иммуногистохимии^9,14. Хотя дрозофилы S2 клетки также доступны для различных экспериментов в пробирке , увековечении и потенциальных существующей вирусной инфекции изменить их поведение^15,16. Использование первичных элементов увековечен клеток линии, таких как S2 клетки, в отличие от позволяет для изучения врожденной иммунной функции в системе более представителя всего организма. Кроме того инфекции hemocytes в естественных условиях, до извлечения, позволяет клетки взаимодействуют с другими принимающей белков и ткани, преимущество над добычей hemocytes до ex vivo инфекции. Получить достаточное количество hemocytes в течение короткого времени, чтобы сохранить hemocytes жив^8,,1718,19были использованы несколько различных методов.

В этом исследовании мы представляем метод для извлечения hemocytes из дрозофила 3^rd instar личинки патогенные микробные инфекции с C. burnetii, листерий (листериоз) или беспозвоночных радужные вирус 6 (IIV6). Мы описываем методы как в естественных условиях , так и ex vivo кровяные инфекций. В естественных условиях– и ex vivo-зараженных hemocytes были визуализируется с помощью конфокальной микроскопии и используется для создания 3D-моделей C. burnetii вторжения. Кроме того, используя протокол извлечения, ex vivo-зараженных hemocytes были использованы для выражения генов и белков анализов. В частности изучить масштабы инфицирования с IIV6 и Listeria, всего RNA или протеина был изолирован от клеток для qRT ПЦР или Западный анализ помаркой. Взятые вместе, протокол предоставляет методы быстро собрать большое количество hemocytes от 3^rd instar личинок и доказательства того, что основной hemocytes, инфицированных в vivo или ex vivo, являются подходящей платформой для микробной возбудитель инфекции исследования и применимым течению анализы микроскопии, transcriptomics и протеомики.

Protocol

1. ex vivo инфекции

1. Средний и оборудование
   1. В стерильных условиях, подготовить Свежая дрозофилы кровяные изоляции среднего (DHIM) содержащие 75% Шнайдер дрозофилы средних с 25% плода Bovine сыворотки (ФБС) и фильтр стерилизовать его.
   2. Слой 2-3 куска пленки парафин 10 см х 10 см под стереомикроскопом.
   3. Подготовьте стеклянный капилляр. Установите нагреватель капиллярного съемник до 55% от максимума. Вытяните капиллярной трубки острием приблизительно 10 мкм.
   4. Засыпки капилляра с минеральным маслом.
   5. Соберите заполненные капилляр на nanoinjector (рис. 1А) и открыть плавленого капилляр наконечник, облом кончик с щипцами (рис. 1Б). Наружный диаметр кончика должно быть 100 мкм для легко поглощения hemocytes.
   6. Извлечь столько нефти как можно дальше от кончика капиллярной трубки, а затем заполнить с DHIM. Для легкой визуализации границы до получения гемолимфа и масла, включают пузырек воздуха между нефтью и DHIM (рис. 1Б‘).
2. Гемолимфа добыча
   1. Выберите 3^rd Инстар дрозофилы личинки изнутри стена пищи флакон осторожно с помощью щипцов и поместите их в 100 мкм фильтр (рис. 1C). 3^rd instar личинки находятся 3-6 дней после плодородные откладки взрослой самки.
      Примечание: Эти эксперименты используемые генотип, w¹¹¹⁸; P {w^{+ mC}= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w^{+ mC}= бла 2xEGFP} AH2, так как hemocytes от этих животных Экспресс расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) для оказания помощи в идентификации клеток при микроскопии.
   2. Залить 5 мл стерильной воды личинки и встряхните сетчатый фильтр для 5 s. место сетчатый фильтр на задачи очистки, чтобы удалить излишки воды (рис. 1C‘).
   3. Переноса личинок в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Анестезировать их с газом CO₂ для 5 s (рис. 1D).
   4. Место личинки на парафин фильм под стереомикроскопом, с спинной стороне, обращенной вверх(рис. 2).
   5. Место стеклянный капилляр слегка на личиночной задней тела чтобы удерживать его на месте и сорвать задняя кутикулы открыть, с помощью тонкой острые щипцы (рис. 2B).
   6. Разрешить гемолимфа поступать на фильм парафина (рис. 2C).
   7. Чтобы пул гемолимфа, включая hemocytes от 20-50 личинок одновременно на фильм парафина.
   8. Занять до пула гемолимфа, используя стекло капилляров на nanoinjector (рис. 2D).
      Примечание: Там должно быть примерно 10-20 мкл гемолимфа.
   9. Извлечь гемолимфа в 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 500 мкл DHIM (2 рисунокE).
   10. Повторите шаги 1.2.4) – 1.2.9) для каждого пакета личинок.
3. Подсчитать количество hemocytes.
   1. Пипетка 5 мкл раствора Трипановый синий 0,4% в пробки microcentrifuge 0,6 мл пятно мертвые клетки. Осторожно смешать DHIM и hemocytes в 1,5 мл трубку с помощью пипетки и передача 5 мкл DHIM, включая hemocytes пробки microcentrifuge 0,6 мл и осторожно перемешать.
   2. Пипетка 10 мкл клеток от 1:1 смесь Трипановый синий: кровяные в Горяева.
   3. Подсчитать количество живой hemocytes, которые не запятнаны с Трипановый синий в каждом из 4 угла поля hemocytomter и рассчитать концентрацию hemocytes на миллилитр, используя формулу:
      
      где X — концентрация живой hemocytes на миллилитр; а, b, c и d являются количество живых клеток (как определено исключение Трипановый синий) в каждом 4 полей учитываются в Горяева. Деление на 2 общего числа клеток насчитал объясняется разбавления 1:1 клеток с Трипановый синий. Клетки окрашивали Трипановый синий считается мертвым.
4. Ex vivo Инфекции
   1. Определите количество скважин для заполнения с клетками, основанные на timepoints и биологического реплицирует необходимые для каждого эксперимента. 5,0 × 10⁴ hemocytes желательны для очистки РНК и белка, после инфицирования.
   2. Рассчитайте объем запасов возбудителя быть разведен с DHIM для инфекции, с использованием следующей формулы:
      
      где обилие инфекции (мои) — это количество вирусных или желаемого бактерии в клетку.
      Примечание: MOI используется зависит от индивидуальных эксперимент и выполненных анализов. Здесь, 10 генома эквиваленты (GE) / клеток C. burnetii, 10 кое/ячейки листерийили 1 TCID₅₀/cell от IIV6 было использовано.
   3. Подготовьте 500 мкл возбудителя среднего для каждой скважины 24-ну плиты, добавив надлежащего объема DHIM вирусной или бактериальной громкости в трубке.
   4. Место 12 мм круглые Стекло покровное (№ 1 толщина) в хорошо 24-ну плиты.
   5. Разделение DHIM, включая hemocytes в скважины 24-ну плиты.
   6. Добавьте 500 мкл возбудителя среднего hemocytes в колодец.
   7. Центрифуга пластину на 1000 x g за 5 мин.
   8. Инкубировать пластину за 1 час на 28 ° C. Каждые 15 мин, нежно наклона пластины от задней стойки, а затем слева направо для 5 s вручную.
   9. После 1 h вторжения/вложение шаг 1.4.8) аккуратно Пипетка от возбудителя среднего и мыть hemocytes с свежими DHIM и пополнить его с 500 мкл свежих DHIM.
   10. Инкубируйте зараженных hemocytes на требуемое время. В этих экспериментах, C. burnetii– или IIV6-инфицированных hemocytes инкубируют 24 h, и Listeria-зараженных hemocytes инкубируют для 1, 2 или 4 h.

2. в естественных условиях инфекции

1. Инфекции
   1. Теплый, агар сок дрозофилы фрукты при комнатной температуре 15 мин пластины сделаны ранее описал²⁰.
      1. Добавьте 30 г агара 700 мл воды и автоклав для 40 мин.
      2. Растворите 0,5 г метил paraben в 10 мл абсолютного этанола.
      3. Метил парабена решение добавьте 300 мл фруктовый сок.
      4. Быстро смешать сок концентрат в раствор ячеистого агар и распределить 5 мл на 10 × 35 мм Петри.
      5. После того, как пластины остыли 15 мин, храните их на 4 ° C.
   2. Подготовка 3^rd instar личинки следующие шаги 1.2.1) – 1.2.3).
   3. Место вставки дрожжей на плите агар. Сделайте прекрасный разрез в пластину агар, где личинки можно перенести во избежание высыхания (рисA). Соберите иглы указал вольфрама 0,001 мм с проведением щипцы с использованием парафина фильмов (Рисунок 3B, C).
   4. Пипетка 50 мкл высокого титра mCherry выражая –C. burnetii (5,95 × 10⁹ GE/мл) на парафин фильм под стерео микроскоп и личинки в бассейн бактерий.
   5. Поместите личинки в бассейн бактерий. Укол личинки с вольфрамовой иглой (рис. 3D). Переноса личинок на агаре пластину (рис. 3E).
   6. Переносить оставшиеся среды патогена на пластину агар и печатью пластины с парафином фильм.
   7. Держите личинки на плите в влажный воздух до желаемого времени послеоперационные инфекции (рис. 3F). В этом эксперименте, C. burnetii-зараженные личинки находятся на табличке на 24 часа.
2. Гемолимфа добыча и покрытием hemocytes
   1. Подготовка среднего и оборудование после шага 1.1).
   2. Место 12 мм круглые Стекло покровное (№ 1 толщина) в хорошо 24-ну плиты. Пипетка 500 мкл DHIM в колодец.
   3. Извлечение гемолимфа из зараженные личинки, следующие шаги 1.2.4) – 1.2.8).
   4. Извлечь гемолимфа в хорошо после шаг 2.2.2).
   5. Повторить 2.2.3) и 2.2.4) для нескольких пакетов личинок.
   6. Центрифуга пластину на 1000 x g за 5 мин.

3. Визуализация

1. Фиксации и окраски
   1. После позволяя hemocytes поселиться на круглые Стекло покровное в колодец, аккуратно извлеките носитель из каждой скважины.
   2. Аккуратно добавьте 200 мкл параформальдегида 4% (PFA) для каждой скважины поселились hemocytes. Инкубируйте hemocytes 20 минут при комнатной температуре.
   3. Удалите 4% PFA и аккуратно 200 мкл PBS, содержащие 0,1% тритон X-100 и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) для каждой скважины. Инкубируйте hemocytes 10 мин при комнатной температуре.
   4. Удаление PBS и аккуратно добавить 200 мкл 1 × 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для каждой скважины. Инкубируйте hemocytes 10 мин в темноте при комнатной температуре.
   5. Удаление решения DAPI и осторожно добавить PBS в каждой скважине. Инкубируйте hemocytes 5 минут при комнатной температуре.
   6. Падение 10 мкл среднего antifade монтажа на стекло микроскопа.
   7. После удаления PBS из каждой скважины, удалите крышку стекла из 24-ну пластину, используя штраф отметил пинцет. Осторожно поместите крышку стекла на носитель antifade монтажа на слайде стекла, с hemocytes вниз.
   8. Разрешить на слайд, чтобы высушить, поместив его в темной ночи.
2. Конфокальная томография
   1. Настройка Конфокальный микроскоп для трех изображений цвета DAPI, EGFP, и mCherry. Используйте следующие настройки: DAPI возбуждения (бывших) 405 нм, выбросов (ЭМ) 415-480 Нм; EGFP ex 488 нм, Эм 493-564 Нм; mCherry ex 587 Нм, Эм 597-700 Нм.
   2. Поместите образец на Микроскоп и сосредоточиться на образце с помощью 63 X / 1.4 Цель числовой апертуры (NA). Найдите нужную hemocytes в поле зрения для воображения.
   3. Отрегулируйте лазер мощности и детектор выгоды для достижения соответствующей экспозиции образца. Проверьте несколько z самолеты, чтобы убедиться, что уровень воздействия подходит для толщины весь пример.
   4. Найти верхней и нижней позиции по оси z весь кровяные. Задайте эти позиции как начальную и конечную позиции для z резании.
   5. Используйте только сканирование масштаб изображение области, содержащей кровяные. Часто используются факторы зум 3 X.
   6. Соберите изображения серии в соответствующей резолюции, например, 1024 x 1024 пикселей в плоскости x-y и 0,3 мкм интервалов в измерении z.
3. 3D модель восстановления
   Примечание: С открытым исходным кодом существует, выполняет многие из описанных ниже функций 3D модель восстановления.
   1. Импортируйте файл серии z секционного изображения в программное обеспечение, связанное с Конфокальный микроскоп для 3D модель восстановления.
   2. Выберите показаны совместно локализации ядер, окрашенных с DAPI и mCherry, выражая C. burnetii в EGFP, выражая кровяные клетки. Обрезка изображения серии содержат только одну ячейку.
   3. Выберите параметр просмотра 3D, который реконструирует 3D-модели с использованием алгоритма расфасованных программного обеспечения. Выберите требуемый тип 3D представительства среди смесь, поверхности и смешанные варианты. В этом методе hemocytes, ядер и C. burnetii указаны с использованием моделей поверхности.
   4. Наблюдать за 3D реконструированный ячейки с различных позиций, просмотра, удерживая кнопку мыши и перетащив курсор вокруг экрана. Измените ячейки ориентации и положение моделируется источника света для оптимизации изображения. Существуют и другие варианты для непрозрачности, минимального и максимального порога, зеркальные, Ambient, Shineness и гамма для оптимизации изображения.
   5. Возьмите сечения с помощью модели, с помощью команды срезания и резания для визуализации интерьера содержимое кровяные.

4. Заявка на ген и/или белка анализа

1. После инфекции с IIV6 и Listeria, лизировать клетки для последующего qRT ПЦР или Западный анализ помаркой как описано ранее²¹ и следующими инструкциями.
   Примечание: Приведена Таблица материалов для грунтовки для qRT-PCR и антитела для западной помарки.
2. Анализ продуктов ПЦР электрофорезом геля агарозы, как описано выше²², для обеспечения надлежащей длины амплифицированного продукта.

Representative Results

Discussion

Чтобы лучше понять, как инфицированных клеток хозяина, важно уточнить локализации возбудителя в клетках, особенно когда эксперименты на ранее непроверенных возбудителя и ячейки типа комбинации⁴. Во время учебы Каскад клеточный ответ, после инфицирования может указывать продуктивной возбудителя вторжения, сочетание данных изображений и клеточного ответа необходимо продемонстрировать возбудителя вторжения и инфекции. В то время как отчеты, показывающие 2D изображения возбудителя вторжения в клетки хозяина, как правило, указывают продуктивной инфекции, некоторые вопросы могут оставаться относительно сроков первоначальных возбудителя вторжения в клетки хозяина. Таким образом 3D модели, реконструированный из z раздел сканирование 2D изображения можно решить эти вопросы и указать расположение возбудителя в клетки хозяина (рисунки 4 и 5). Однако ограничение использования первичных hemocytes является их долговечность в клеточной культуре. Предыдущем докладе говорится, что кровяные выживания в средства массовой информации культуры клеток является всего лишь 8 h¹⁸, и в нашей инфекции протокол, мы были в состоянии выполнять анализы до 24 ч, но не больше. Таким образом невозможно соблюдать высокий уровень репликации C. burnetii , или формирование вакуоль parasitophorous, которые не начинают формироваться до 2 дней после инфицирования и не observably большой до 4-6 дней после инфицирования³⁰ .

Для многих экспериментов, где конечной анализов используют белка и РНК для анализа большое количество клеток обычно требуется для производства достаточного материала для допроса. Например здесь, мы используем конечной точки анализа, таких, как Западный blotting и qRT ПЦР для проверки степени возбудителя инфекции в первичной hemocytes, производные от 3^rd Инстар дрозофилы личинки. Таким образом метод представлен здесь сосредоточена на быстрой личиночной диссекции и коллекции гемолимфа, содержащие достаточно живой hemocytes ex vivo возбудителя инфекции. Этот метод вводит использование nanoinjector принять гемолимфа и hemocytes быстро. Размещение hemocytes в DHIM, содержащих 25% FBS имеет важное значение для выживания кровяные. Кроме того для инфекций ex vivo , представленные здесь, необходимо большое количество hemocytes. Чтобы избежать melanization^31,,3233, рассечение и кровяные коллекции должно произойти быстро. В то время как другие методы для извлечения кровяные существует^18,19,23, продолжительность этих методов, чтобы собрать достаточно большое количество hemocytes ex vivo инфекции был слишком долго. Штрафа отзыв 100 мкм выгодно для поглощения гемолимфа не занимая другие органы, которые могут привести к засорению капилляров иглы. Использование nanoinjector также могут быть автоматизированы, когда он присоединен к стадии микроманипулятор и педаль, позволяя пользователю сосредоточиться на быстрый рассечение личинок дрозофилы и уменьшить время, hemocytes без окружающих личинок ткани или клетки культуры СМИ. Тем не менее использование пипетки также предлагается занять гемолимфа для передачи DHIM. Кроме того наш метод использует газ CO₂ чтобы анестезировать личинки до вскрытия; использование холодного блока с покрытием фильм парафин является еще жизнеспособный метод²³. Наконец рассечение личинок в капле DHIM во время выпуска гемолимфа может уменьшить количество hemocytes, которые потеряли от прилипания к фильму парафина, но увеличит время, необходимое для поглощения капиллярного иглой.

Общий иммунный ответ у дрозофилы травмы, которая происходит во время открытия и рассечение личиночной кутикулы, является melanization^,3132,33. Во время извлечения hemocytes мы бы наблюдать за melanization hemocytes в DHIM уже как 10 мин, после извлечения. Как melanization это быстрый процесс, эти клетки будут исключены из экспериментов возбудителя инфекции. Кроме того, анти коагулянт фенилтиомочевины могут добавляться к DHIM ингибировать phenoloxidase активации системы и melanization во время ранены⁹. Тем не менее как melanization и апоптоз innate иммунных реакций дрозофилы, их уровень может быть количественных следующие кровяные добычи и стимуляции с помощью методов, описанных здесь.

В то время как восстановление большое количество белка и РНК материала является обязательным требованием для методов, таких как Западная помарка и qRT-PCR, новые методы, такие как RNAseq требуют гораздо меньше материала, как мало, как 10 pg высокого качества всего РНК от одноклеточного³⁴. Эксперименты, такие как эти поднять интересующие вопросы экспериментальной, и так как дрозофила hemocytes гетерогенных населения, содержащие кристалл клетки, plasmatocytes и lamellocytes⁷, одно может начать допросить транскрипционный анализ ответов каждой ячейки типа³⁵. Например, Kurucz et al., разработали антитела, которые могут быть использованы для изоляции подмножеств кровяные дрозофилы , которые могут быть использованы для транскрипционный анализ или proteomic профилирования после различные стимулы. Кроме того недавнее развитие одной ячейки RNAseq технология может определить transcriptomes каждого типа клеток без использования антител к первоначально отдельно каждой ячейки типа^{36,,3738, 39}. Кроме того, можно спросить вопросы, касающиеся регулирования гена в кровяные подмножеств, которые могут помочь нам понять, как человеческие линий клеток крови возникла и развивалась от древних организмов через сравнительной геномики усилия. Решение проблем таких требует сочетания широкого круга экспериментальных методов, и метод, описанный здесь может быть полезным для таких усилий, когда необходима изоляция большое количество hemocytes из беспозвоночных личинки.

Здесь мы предлагаем сочетание 3D моделей с числовой, биохимические данные для подтверждения инфекции. В будущем исследования, мы можем использовать методы, описанные здесь соблюдать иммунных реакций и механизм возбудителя вторжения в клетки хозяина путем совместного пятнать хост белков для микроскопии анализа.

Materials

Schneider's <em>Drosophila</em> Medium&nbsp;	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	21720024	1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences&nbsp; (HyClone)	SH30070.03HI	1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 &micro;L)	RESTEK	26158	1.1.1)
Strainer (100 &micro;m)	Greiner bio-one	542000	1.2.1), 2)
Stereo microscope	Amscope	SM-1BSZ-L6W	1.2), 2)
Glass capillary	Fisher Scientific	21-171-4	1.1), 1.2), 2)
Capillary puller	Narishige International USA, Inc.	PC-10	1.1.3)
Mineral oil	Snow River Products		1.1.4)
Nanoinjector	Drummond Scientific Company	3-000-204	1.1), 1.2), 2.2)
Forceps	VWR	82027-402	1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO<sub>2 </sub>delivery apparatus	Genesee Scientific	59-122BC	1.2), 2)
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15250061	1.3)
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	1.3)
24 well plate	Greiner bio-one	662160	1.4), 2.2)
<em>Coxiella burnetii</em> – mCherry	Dr. Heinzen, R.		1.4), 2.2)
<em>Drosophila</em> fruit juice plates	Cold Spring Harbor Protocols		2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar	Fisher Bioreagents	BP1423-500	2.1.1.1)
Methyl paraben	Amresco	0572-500G	2.1.1.2)
Absolute ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818-500	2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL	Amazon	B0025UJVGM	2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A	2.1.1.4)
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-545-80	1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active	MP Biomedicals	0210140001	2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle	Fine Science Tools	10130-20	2.1)
Holding forceps	VWR	HS8313	2.1)
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	FLO4042-500	3.1.3)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	3.1.3)
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100	3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole	Thermo Fisher Scientific	62247	3.1.4)
Antifade mounting medium	Thermo Fisher Scientific	P36930	3.1.6)
Confocal microsope	Leica	TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope	3.2)
3D imaging reconstruction software	Leica	LASX with 3D visualization module	3.3)
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-3	3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)	Dr. Teixeria, L.		4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
<em>Listeria monocytogenes</em>	ATCC	strain: 10403S	4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 &micro;g/ml streptomycin at 30 &deg;C.
DNase I	Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)	18068015	gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
IIV6_193R_F	IDT		qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R	IDT		qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent	Thermo Fisher Scientific	K0251, K0252, K0253	qRT-PCR
Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107, 7500 Software v2.0	qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody	abcam	ab35132	Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit	SIGMA-ALDRICH	A2066	Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate	Promega	W4011	Western blot