Этот метод демонстрируется визуализировать возбудителя вторжения в насекомое клетки с трехмерной (3D) модели. Hemocytes от дрозофилы личинки были инфицированы вирусных или бактериальных патогенов, ex vivo или в естественных условиях. Зараженных hemocytes были затем фиксированной и витражи для изображений с конфокального микроскопа и последующих клеточных 3D реконструкции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Во время патогенной инфекции Drosophila melanogaster, hemocytes играют важную роль в иммунной реакции на протяжении инфекции. Таким образом цель настоящего Протокола заключается в разработке метода для визуализации возбудителя вторжения в конкретных иммунной отсеке мух, а именно hemocytes. С помощью метода, представленные здесь, до 3 × 106 живой hemocytes можно получить из 200 дрозофила 3rd instar личинок в 30 минут для ex vivo инфекции. Кроме того hemocytes может быть зараженных в естественных условиях путем инъекций личинок 3rd instar следуют кровяные добычи 24 ч после инфекции. Эти зараженные клетки первичной были исправлены, витражи и образы с помощью конфокальной микроскопии. Затем 3D представлений были созданы из изображений, чтобы окончательно показать возбудителя вторжения. Кроме того, можно получить РНК высокого качества для qRT ПЦР для выявления возбудителя мРНК следующие инфекции и достаточно белка могут быть извлечены из этих клеток для Западный анализ помаркой. Взятые вместе, мы представляем метод определенное согласование возбудителя вторжения и подтверждения инфекции, используя типы бактериальных и вирусных патогенов и эффективный метод для извлечения кровяные для получения достаточно живой hemocytes от дрозофилы Личинки для ex vivo , так и в естественных условиях инфекции экспериментов.
Введение
Drosophila melanogaster это организм устоявшихся моделей для изучения врожденного иммунитета1. Во время врожденный иммунный ответ hemocytes играют важную роль в ответ на вызов возбудителя. Hemocytes являются критическими для инкапсуляции паразитов, а также важную роль в борьбе против возбудителя через фагоцитарной действий во время грибковые, вирусные и бактериальные инфекции2,3.
Для того чтобы лучше понять врожденный иммунный ответ хозяина патогенные микробные инфекции, важно для визуализации, как возбудитель поражает клетки хозяина во время инфекци....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. ex vivo инфекции
- Средний и оборудование
- В стерильных условиях, подготовить Свежая дрозофилы кровяные изоляции среднего (DHIM) содержащие 75% Шнайдер дрозофилы средних с 25% плода Bovine сыворотки (ФБС) и фильтр стерилизовать его.
- Слой 2-3 куска пленки парафин 10 см х 10 см под стереомикроскопом.
- Подготовьте стеклянный капилляр. Установите нагреватель капиллярного съемник до 55% от максимума. Вытяните капиллярной трубки острием приблизительно 10 мкм.
- Засыпки капилляра с минеральным маслом.
- Соберите заполненные капилляр на nanoinjector (рис. 1
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Собирать жить hemocytes ex vivo инфекции, до 3 × 106 hemocytes были извлечены из 200 дрозофила 3rd instar личинки. Развивать наш метод, были попытки ряда различных методов. Индивидуальные личиночной рассечение примет до 1,5 ч, и в среднем ~ 8000 клетки были получены с помощью этого метода18, большинство из которых не были живы в конец коллекции. Далее мы попытались извлечь гемолимфа, который содержит hemocytes, от 20 личинок .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Чтобы лучше понять, как инфицированных клеток хозяина, важно уточнить локализации возбудителя в клетках, особенно когда эксперименты на ранее непроверенных возбудителя и ячейки типа комбинации4. Во время учебы Каскад клеточный ответ, после инфицирования может указывать продуктивной возбудителя вторжения, сочетание данных изображений и клеточного ответа необходимо продемонстрировать возбудителя вторжения и инфекции. В то время как отчеты, показывающие 2D изображения возбудителя вторжения в клетки х.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарны д-р Роберт Heinzen для обеспечения запасов выражая mCherry Coxiella burnetii. Мы благодарим д-р Луис Тейшейра за предоставление беспозвоночных радужные вирус 6 и фондового центра Bloomington для предоставления летать запасов. Этот проект частично финансировался NIH Грант R00 AI106963 (A.G.G.) и университета штата Вашингтон.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Фетальная бычья сыворотка | Healthcare Life Sciences (Хайклон) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Фильтр (0.22 &; L) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Сетчатый фильтр (100 & микро; m) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Стереомикроскоп | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Стеклянный капиллярный | Fisher | Scientific 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2)2) |
| Капиллярный пуллер | Narishige International США, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Минеральное масло | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Наноинъектор | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Щипцы | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery аппарат | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Трипан Блю | Thermo Fisher Scientific (Gibco | )15250061 | 1.3) |
| Гемоцитометр | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 луночный планшет | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2 |
| )Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila тарелки фруктового сока | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Биореагенты Агара Фишера | BP1423-500 | 2.1.1.1) | |
| Метилпарабен | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Абсолютный этанол | Биореагенты | Фишера BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Замороженный концентрат 100% виноградного сока Welch's, 340 мл | амазонки | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Чашки Петри, 10 x 35 мм | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Защитное стекло микроскопа | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Дрожжи, высушенные активные | активные MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Добавьте 2 части воды в 1 часть дрожжей (v/v) |
| Вольфрамовая игла | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Удерживающие щипцы | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Параформальдегид | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Бычья сыворотка альбумин | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-диамидино-2-фенилиндол | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Антивыцветающий монтажный носитель | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Конфокальный микроскоп | Leica | TCS SP8-X Белый свет Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | 3.2) |
| Программное обеспечение для реконструкции 3D-изображений | Leica | LASX с модулем | 3D-визуализации3.3) |
| Предметные стекла микроскопа | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Беспозвоночный радужный вирус 6 (IIV6) | Д-р Тейшерия, Л. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenesATCC | штамм: 10403S | 4) Штамм Listeria monocytogenes 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) был выращен в бульоне Difco Brain-heart Infusion (BHI) (BD Biosciences), содержащем 50 &; г/мл стрептомицина при 30°С. | |
| ДНКаза I | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 18068015 | набор для синтеза гДНК деградации |
| кДНК | Bio-Rad | 1708891 | синтез кДНК |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R | |
| IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC-TG | ||
| SYBR Зеленый реактив qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Система ПЦР в реальном времени | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes антитела | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-actin антитело вырабатывается у кролика | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
Ссылки
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
