Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации chromatin о модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ДНК впоследствии используется для количественного PCR допросить изобилия и локализации столб-поступательные изменения гистона на протяжении всего генома.

Abstract

Столб-поступательные изменения гистона (PTMs), такие как ацетилирования, метилирование и фосфорилирования, динамически регулируется ряд ферментов, которые добавить или удалить эти знаки в ответ на сигналы, полученные в ячейке. Эти PTMS являются важнейшими действующими лицами для регулирования процессов таких как выражение гена управления и ремонта ДНК. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) был инструментальный подход для рассечения изобилия и локализации многих гистона PTMs на протяжении всего генома в ответ на разнообразные возмущений в ячейку. Здесь описан универсальный способ выполнения чип post-translationally модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Этот метод полагается на сшивки белков и ДНК, используя формальдегида лечения дрожжевых культур, поколение лизатов дрожжей, бисера, избиение, солюбилизация фрагментов хроматина, Микрококковая Нуклеаза и иммунопреципитации гистон-ДНК комплексы. ДНК, связанные с гистонов Марк интерес очищается и подвергается количественной ПЦР-анализа для оценки ее обогащения на нескольких локусов на протяжении всего генома. Представитель эксперименты зондирующего локализация меток гистона H3K4me2 и H4K16ac в wildtype и мутанта дрожжей обсуждаются продемонстрировать анализа и интерпретации данных. Этот метод подходит для различных гистона PTMs и может выполняться с различными мутантных штаммов или в присутствии различных экологических подчеркивает, что делает его отличным инструментом для изучения изменений в динамике хроматина в различных условиях.

Introduction

Динамического столб-поступательные изменения гистонов (ПТМ) является ключевым механизмом регулирования для многих ДНК шаблонного процессов, в том числе транскрипции и репликации ДНК ремонт^1,2. Возможность определить изобилие и точной локализации модифицированных гистонами сочетанной с этими процессами таким образом имеет решающее значение для понимания их регулирования в различных условиях в ячейке. Развитие иммунопреципитации chromatin (обломока) как метод, во многом обусловлены биохимических исследований взаимодействия белков с ДНК, особенно в vitro методы с использованием химических сшиватели, наряду с необходимостью оценки Динамическая природа ДНК белковых взаимодействий в естественных условиях и в отдельных регионах генома^3,4,5. Улучшения количественного PCR (ПЦР) и технологий виртуализации также расширил возможность выполнения чип эксперименты с количественных сопоставлениях и через весь геном, что делает его мощным инструментом для рассечения ДНК белковых взаимодействий на несколько уровней.

В настоящее время чип является необходимый метод для любой исследовательской группы заинтересованы в хроматина опосредованное регулирование генома, как есть без сопоставимых методов непосредственно допроса физической связи между изменение гистона и конкретных геномной Локус в VIVO. Хотя имеются вариации этого метода, с помощью следующего поколения последовательности для сопоставления изменения гистона на протяжении всего генома^6,7 , эти подходы могут обращаться различные научные вопросы и их масштаба, стоимость и технические ресурсы могут ограничения для некоторых исследовательских групп. Кроме того, целевые чип ПЦР необходимых для дополнения этих подходов, предоставляя методы как оптимизировать чип протокола до начала последовательности и проверить результаты от epigenomic наборов данных. Масс-спектрометрия основанные подходы для выявления бессепараторные гистонов, марки, связанные с геномной регионы имеют также появились^8,9,10,11, однако, эти подходы имеют некоторые ограничения относительно того, какие регионы генома может быть исследован и они требуют технических знаний и инструментария, которые не будут доступны для всех исследовательских групп. Таким образом чип остается основополагающий метод для анализа изобилия и распределение изменения гистона при различных условиях для всех исследовательских групп, заинтересованных в эпигенетики, хроматина и регулирование геномной функций.

Здесь мы описываем метод чип с использованием дрожжей начинающих модель Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) для изучения распределения гистона PTMs на хроматина. Этот подход основывается на ряде ключевых компонентов чип протоколов, разработанных в дрожжей и применяется также к разнообразной модели систем^12,13. Взаимодействие между ДНК в клетке и модифицированных гистонами сохраняются сшивки с формальдегидом. После lysate подготовки хроматина фрагменты являются солюбилизирован в равномерно размера фрагментов, пищеварение с Микрококковая нуклеиназы. Иммунопреципитация модифицированных гистонами выполняется с коммерческой или генерируемые лаборатории антител и любые связанные ДНК изолирована и проанализированы для обогащения в конкретных регионах геномной, с помощью ПЦР (рис. 1). Для многих гистона модификаций количество ДНК, полученных из настоящего Протокола является достаточным для тестирования более чем 25 различных локусов генома, ПЦР.

Этот метод чип универсальный для контроля за распределением одного гистона модификации нескольких мутантных штаммов или условий окружающей среды, или для тестирования нескольких изменения гистона wildtype клеток на количество локусов генома. Кроме того многочисленные компоненты протокола легко регулируемая оптимизировать обнаружение либо высоко – или смирен обильные меток гистона. Наконец выполняя чип модифицированных гистонов в многообещающий дрожжей обеспечивает возможность использования ключевых элементов для специфичность антитела, которые в основном недоступны в других системах. А именно, штаммов дрожжей могут быть созданы, которые носят точечные мутации в гистона остатков, которые предназначены для изменения, и, в некоторых случаях, есть только один фермент, который катализирует модификации на конкретной гистона остатков (например. лизин гистона methyltransferases). Таким образом чип может выполняться либо гистона мутанта или фермента удаления штаммов для анализа степени неспецифической Связывание антитела могут происходящих и генерации ложных положительных результатов. Этот элемент управления является особенно ценным для разработанной антител и даже могут быть использованы для проверки специфичность антитела для изменения гистона сохраняется до их использования в других системах. Этот подход дополняет другие методы для тестирования специфичность антитела, которые отличают между государствами различных изменений (таких как моно-, ди – и tri метилирование), включая зондирующего массивы модифицированных пептидов и выполнение западных помарках гистонами или нуклеосом с определенными изменениями. В целом чип в многообещающий дрожжей является мощный метод для оценки динамики гистона PTMs на протяжении всего генома и пройдя через механизмы, регулирующие их регулирования.

Protocol

1. предварительно связывать антител к магнитной бусины Хорошо перемешайте протеина A/G магнитные бусы и передать 1,5 мл 20 мкл магнитных шариков на сэмпл один иммунопреципитации (IP).Примечание: При закупорить бусы, используйте широкий родила, низкий сохранение советы. Положите трубку с бисером в магнитного стенд и позволяют бусы для сбора на стороне трубки. Удалите супернатант. Вымойте бисер 3 раза с 1 мл холодного трис буфер солевой раствор (TBS) (50 мм трис-HCl рН 7,5, 150 мм NaCl). 200 мкл TBS, бусины и соответствующее количество антител. Поверните на 8 об/мин на ночь при 4 ° C.Примечание: Для многих гистона PTM антител, 1-3 мкг антител на IP является достаточным. Однако титрование эксперименты, рекомендуется определить соответствующие концентрации. Рекомендуемые концентрации для хорошо изученных, коммерческие гистона PTM антитела часто являются точными и можно найти в опубликованных докладах или литературу. Бисер в магнитного стенд и удалить супернатант. Вымыть их с 1 мл раствора TBS. Ресуспензируйте бисер в 20 мкл TBS на IP сэмпл плюс дополнительные 5 мкл (в случае дозирования ошибка) TBS.Примечание: Бисер может храниться краткосрочных при температуре 4 ° C до использования. 2. растут дрожжи клетки Прививок 10 мл YPD (экстракт дрожжей 10%, 20% Пептон и 20% декстрозы) с одной колонии штамма соответствующие и расти при 30 ° C ночь в тряску инкубатор на 220 об/мин. Измеряют оптическую плотность на 600 Нм (600OD) культуры дрожжей, используя спектрофотометр. Разбавить культуры ОД600 = 0,2 в 100 мл YPD в новом колбе. Рост клеток при 30 ° C в тряску инкубатор на 220 об/мин, до тех пор, пока они достигают середины журнала фазы (OD600 = 0,6-0,8). 3. в естественных условиях сшивки белков, ДНК Когда культур достигают стадии середине журнала, добавьте 2,7 мл 37% формальдегида непосредственно в среде, для окончательного концентрации 1% формальдегида. Фляга передать шейкер при 25 ° C (или комнатной температуры) и встряхните его на 50 об/мин, 15 мин. Добавьте 5 мл 2,5 метров глицина на носитель и продолжайте встряхивания на 50 об/мин при комнатной температуре на 5 минут, чтобы утолить формальдегида. Передача клетки центрифуга бутылки и спина клетки на 5800 x g 5 мин при 4 ° C. Декант супернатант. Вымыть клетки, resuspending их в 45 мл холодного TBS и передачи подвеска в 50 мл Конические трубки. Спиновые трубки на 2800 x g 3 мин при 4 ° C. Удалите супернатант. Вымыть клетки в 10 мл холодного чип буфера Lysis (рН 50 мм трис-HCl 7.5, 150 мм NaCl, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 1% nonidet октиловый phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), температуре 4 ° C). Спиновые клетки на 2800 x g 3 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.Примечание: Клетки могут быть заморожены жидким азотом и хранятся при температуре-80 ° C до дальнейшей обработки. 4. сделать лизатов дрожжей Ресуспензируйте клеток в 1 мл холодного буфера Lysis чип с 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) и разведение 1:1,000 ингибитор протеазы дрожжи коктейль. Передать 2.0 мл колпачок трубка, содержащая 200 мкл стеклянные бусины подвеска. Передача клетки шарик, победив аппарат для высокой скорости агитации на 4 ° C и шарик бить 6 раз за 30 s каждый. Держите клетки на льду, по крайней мере 1 мин между каждой шарик избиение. Трансфер lysate 1,5 мл трубку с помощью геля загрузки советы. Центрифуга lysate на 15500 g x 20 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 250 мкл буфера MNase пищеварения (10 мм трис-HCl pH 7.5, 10 мм NaCl, 3 мм MgCl2, 21 мм CaCl2, 1% NP-40, хранить при 4 ° C), осторожно закупорить вверх и вниз. Добавьте 2.5 мкл MNase реакций. Аккуратно перемешать, инвертирование 4 – 6 раз и сразу же инкубировать в ванну воды 37 ° C 20 мин.Примечание: Дайджест условия должны быть оптимизированы, когда используется новый запас MNase. Смотрите Шаг 10 для протокола. Сразу же место трубы на льду для остановки реакции и 5 мкл ЭДТА 0,5 М для конечной концентрации 10 мм ЭДТА. Смешайте их нежно инверсии. Центрифуга для реакции на 15500 g x 15 мин при температуре 4 ° C и передачи супернатант новой 1,5 мл трубки.Примечание: В надосадке будет Soluble (переваривается) хроматина. Гранулы содержит ничего непереваренной и нерастворимых ячейки мусор. 5. Immunoprecipitate (IP) изменение гистонами Определите концентрацию белка каждой фракции выпустила MNase хроматина, используя assay Брадфорд. Добавьте 1 mL реагента Брэдфорд каждому из 8 одноразовые кюветы плюс 1 дополнительные кюветы для каждого образца протеина для проверки. Подготовьте Стоковый раствор 2 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА). Добавьте соответствующий объем для достижения следующих концентрации BSA в 1 мл реагента Брэдфорд: 0 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 6 мкг/мл, 8 мкг/мл и 10 мкг/мл. Добавьте 2 мкл фракции выпустила MNase хроматина в дополнительных кюветы. Крышка в верхней части каждого кювета с небольшой кусок парафина и инвертировать кюветы 4 – 6 раз хорошо перемешать раствор. Инкубируйте кюветы при комнатной температуре в течение 15 мин. Использование видимый свет спектрофотометр, измерения поглощения в 595 Нм для стандартной кривой и экспериментальных образцов.Примечание: Используйте кювет без BSA (0 мкг/мл) в пустой спектрофотометр до первого измерения. Участок калибровочной кривой с помощью значения поглощения для различной концентрации BSA на программное обеспечение, связанное с спектрофотометра или электронную таблицу. На основе стандартной кривой и используемый коэффициент разрежения (1: 500), используйте значения поглощения для расчета концентрации белка для каждого из образцов фракция хроматина. Для каждого IP-адреса добавьте 50 мкг общего белка из фракции выпустила MNase хроматина буфера Lysis чип для достижения окончательный объем 1 мл.Примечание: Если создание более чем одного IP в lysate, сделать мастер смесь lysate и чип литического буфера и аликвота 1 мл в отдельные Пробирки для IP. Удаление 100 µL из смеси IP для обработки как образца ввода. Заморозить входной выборки при-20 ° C до шага 7.1.Примечание: Любые оставшиеся хроматина образец может быть заморожены при-20 ° C и использоваться для последующих IP, при желании. 20 мкл магнитной бусины A/G белка предварительно связаны с антителами к каждому образцу IP.Вращать образец на 8 об/мин для 3 h (стандарт) или на ночь (по желанию) при 4 ° C. 6. Промойте IPs и элюировать гистон ДНК комплексы Место труб в магнитных стоять и пусть бусы собирать на стороне трубки. Удалите с помощью пипетки супернатант. Вымойте бисер последовательно с 1 мл каждого из буферов ниже. Выполнение каждого мытья, вращающихся на 8 об/мин за 5 мин при температуре 4 ° C, размещение бусины в магнитного стенд, удаление супернатант и добавление следующего буфера: 2 x – чип литического буфера, 2 x – высокая соли мыть буфера (50 мм трис-HCl рН 7,5, 500 мм NaCl, 1 ЭДТА 1% NP-40, хранить при 4 ° C), 1 x – LiCl/стирального порошка стирка буфера (10 мм трис-HCl рН 8,0, 250 мм LiCl, 1 мм ЭДТА, 1% NP-40, Дезоксихолат натрия 1%, температуре 4 ° C), 1 x – TE (10 мм трис-HCl рН 8,0, 1 мм ЭДТА, температуре 4 ° C) и 1 x – TE. С последней TE мыть передать новой трубки с помощью 0,5 мл TE перенести большую часть бусины, потом еще 0,5 мл TE Промойте трубку и передать оставшиеся бусины бусины. 250 мкл свежеприготовленные чип Элюирующий буфер (1% SDS, 1 мм NaHCO3). Вихрь решение кратко. Поворот образцов 8 об/мин, 15 мин при комнатной температуре. Трубка в магнитного стенд и собирать шарики. Тщательно супернатант передать новой трубки и избежать бисер.Примечание: Элюата содержит связанные ДНК и immunoprecipitated белков. Добавьте еще один 250 мкл чип Элюирующий буфер бусины. Поворот образцов 8 об/мин, 15 мин при комнатной температуре. Тщательно передать трубка, содержащая первый элюции супернатант. При необходимости удалите меньший объем (240 мкл) для всех IP-адресов чтобы не мешать шарики. 7. обратный протеин дна сшивки Оттепель ввода образцов и 400 мкл чип Элюирующий буфер для каждого входа. Для ввода, так и IP образцов мкл 20 5 М NaCl, 5 мкл гликогена 20 мг/мл и 12,5 мкл 20 mg/ml протеиназы K. смесь хорошо, инвертирование или стряхивая трубы. Проинкубируйте образцы в ванне с водой 65 ° C на ночь. 8. очищения и концентрации ДНК Добавьте 10 мкл 10 мг/мл РНКазы A для ввода и IP образцов. Проинкубируйте образцы в ванну воды 37 ° C за 30 мин. 600 мкл фенола: chlorofrom:isoamyl алкоголя (25:24:1 PCI) водный раствор и хорошо перемешайте. Спина их на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре. Удаление водный слой к новой пробке. 600 мкл PCI и хорошо перемешайте. Вращайте трубу на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре. Передача водный слой к новой пробке.Предупреждение: Работа в зонта и носить соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с PCI. Утилизация жидких и твердых отходов, по указанию институциональных руководящих принципов. Добавьте 0,1 x объем ацетат натрия 3M и 1 мл холодного 100% этанола ускорять ДНК. Инвертировать трубка 4 – 6 раз хорошо перемешать раствор. Инкубируйте в-20 ° C на ночь. Спиновые трубки на 15500 g x 20 мин при 4 ° C. Осторожно удалите супернатант с пипеткой. Помыть лепешка в 1 мл холодного 70% этанола. Его спина на 15500 g x 10 мин при 4 ° C. Осторожно удалите супернатант с пипеткой. Просушите окатышей в капот для примерно 20 мин (до полного высыхания). Ресуспензируйте IP образцов в 50 мкл нуклеиназы свободной воды и Ресуспензируйте ввода образцов в 100 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Храните образцы ДНК при-20 ° C до проведения ПЦР. 9. Количественная ПЦР (ПЦР) для выявления обогащенный геномной регионов Сделайте ПЦР мастер смесь для каждого набора грунтовки. Одна реакция содержит 5 мкл 2 x qPCR смеси, 0,25 мкл 20 мкм вперед грунтовка и 0,25 мкл 20 мкм обратный праймера.Примечание: Надлежащего грунт проектирование и тестирование для ПЦР экспериментов описанных в других14,,1516. Сделайте главной смеси ДНК для каждого образца ДНК. Одна реакция содержит 0.5 мкл ДНК и 4.0 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Добавьте 5.5 мкл мастер смесь соответствующей грунтовки и 4,5 мкл соответствующий мастер смеси ДНК в каждой скважине на тарелку, 384-ну ПЦР.Примечание: Начать с добавлением 5.5 мкл смеси праймера для каждой скважины. Спиновые пластину на 200 x г за 1 мин при комнатной температуре перед добавлением 4.5 мкл, комплекса ДНК. Придерживайтесь печать к пластине и спина на 200 x г за 1 мин при комнатной температуре. Выполнять ПЦР с помощью системы ПЦР в реальном времени с соблюдением следующих условий: 95 ° C 3 мин; 40 циклов 95 ° c 10 s, 55 ° C за 30 сек; кривую плавления 65 ° C до 95 ° C с шагом 0,5 ° C, 5 s. Для каждой пары праймера Вычислите процент ввода IP образца относительно образца ввода 5% используемых в ПЦР. Используйте средства технического triplicates ПЦР для выполнения вычислений.Примечание: Если существенные различия наблюдаются в triplicates ПЦР, лучше повторить ПЦР с вниманием к мастер смесь состава, дозирования ошибок и перекрестное загрязнение между скважинами в пластину 384-Ну. Настройте значения Cq для ввода до 100% путем вычитания числа циклов, представляющее коэффициент разрежения из необработанных значений Cq.Примечание: Пять процентов ввода представляет коэффициент разбавления 20 раз, который равняется 4,32 циклов (вход2 20 = 4.32). Рассчитать процент ввода как 2 ^ (Cqввода – овIP) умножается на 100. 10. Определите MNase дайджест условия (рекомендуется до первый полный чип эксперимент) Выполните шаги 2.1 через 4.4 предыдущего протокола. Масштабирование протокол для создания достаточно lysate несколько образцов MNase пищеварения пеллетные chromatin содержащих. На шаге 4.4 Ресуспензируйте гранулы в 1,25 мл MNase пищеварение буфера. Алиготе, образцы до 5 трубок так что каждый содержит 250 мкл Пелле хроматина, высокомобильна в буфер MNase пищеварение. Добавьте 0, 1,5, 2,5 или 5 мкл MNase к каждой трубе. Аккуратно перемешать, инвертирование 4 – 6 раз и сразу же инкубировать труб в ванну воды 37 ° C 20 мин. Остановите реакции немедленно размещение труб на льду и добавляя 5 мкл ЭДТА 0,5 М для 10 mM концентрации выпускных экзаменов.Осторожно перемешать раствор путем инверсии. Центрифуга для трубы на 15500 g x 15 мин при температуре 4 ° C и передачи супернатант новой 1,5 мл трубки. Добавьте SDS в конечной концентрации 1% (25 мкл раствора 10% акций) и3 NaHCO до конечной концентрации 0,1 М (25 мкл Стоковый раствор 1 М) для образцов в 1,5 мл пробирок. Добавьте 20 мкл 5 М NaCl, 5 мкл гликогена и 12,5 мкл 20 мг/мл протеиназы K образцы в 1,5 мл пробирок. Инкубируйте их при температуре 65 ° C на ночь. 10 мкл 10 мг/мл RNaseA. Инкубируйте при 37 ° C за 30 мин. Добавить 300 мкл PCI в водный раствор и хорошо перемешайте. Спина на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре. Удаление водный слой к новой пробке. Добавить 300 мкл PCI и хорошо перемешать. Спина на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре. Передача водный слой к новой пробке. Добавьте объем 0.1 x 3 M натрия ацетата (обычно ~ 30 мкл) и 1 мл холодного 100% этанола ускорять ДНК. Инвертировать трубка 4 – 6 раз в хорошо перемешайте. Инкубируйте трубку-80 ° C за 1 ч или от-20 ° C на ночь. Спиновые трубки на 15500 g x 20 мин при 4° C. Тщательно удалите супернатант с пипеткой. Вымойте гранулы в 1 мл холодного 70% этанола. Спина на 15500 g x 10 мин при 4 ° C. Пусть гранулы воздушно-сухой вытяжки примерно 20 мин (или пока не полностью сухой). Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Добавьте ДНК, Загрузка красителя и запуск 20 мкл на агарозе 2% гель для визуализации переваривается ДНК.

Representative Results

Одним из ключевых компонентов этого протокола оптимизация концентрация Микрококковая Нуклеаза (MNase) используется для дайджест хроматина в растворимые фрагментов, как указано в шаге 10. Это критически важно для получения данных с высоким разрешением в отношении распре…

Discussion

Процедура, описанная здесь позволяет для эффективного восстановления ДНК, связанные с гистонами изменение в клетках дрожжей по иммунопреципитации. Это сопровождается ПЦР с праймерами, которые усиливают областей, представляющих интерес для определения местных обогащения или истощен?…

Materials

Yeast Extract	Research Products International (RPI)	Y20025-1000.0
Peptone	Research Products International (RPI)	P20250-1000.0
Dextrose	ThermoScientific	BP350-1
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Glycine	Fisher Scientific	AC12007-0050
Tris	Amresco	0497-5KG
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758-500G
NaCl	ThermoScientific	BP358-10
4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	74385	Equivalent to NP-40
MgCl	ThermoScientific	S25533
CaCl2	Sigma-Aldrich	20899-25G-F
LiCl	ThermoScientific	AC413271000
Sodium Dodecyl Sulfate	Amresco	M107-1KG
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970-100G
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889
NaHCO3	ThermoScientific	S25533
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626-5G
Yeast protease inhibitor cocktail	VWR	10190-076
25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol	VWR Life Science	97064-824
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Nuclease-Free Water	VWR	100720-992
Micrococcal Nuclease	Worthington Biochemical	LS004797
Glycogen	ThermoScientific	R0561
Proteinase K	Research Products International (RPI)	P50220-0.1
RNase A	Sigma-Aldrich	R6513-50MG
Bradford Assay Reagent	ThermoScientific	23238
BSA Standard 2 mg/mL	ThermoScientific	23210
α H4	EMD Millipore	04-858
α H4K16ac	EMD Millipore	ABE532
α H3	Abcam	ab1791
α H3K4me2	Active Motif	39142
High Rox qPCR Mix	Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix	ACC-PR2000-L-1000
Protein A/G Magnetic Beads	ThermoScientific	88803
magnetic stand for 1.5mL tubes	Fisher Scientific	PI-21359
Acid-Washed Glass Beads	Sigma-Aldrich	G8772
Microtube Homogenizer	Benchmark	D1030
2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings	Sigma-Aldrich	Z763837-1000EA
Gel loading tips	Fisher Scientific	07-200-288
Cuvettes	Fisher Scientific	50-476-476
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
384-Well PCR Plate	Fisher Scientific	AB-1384W
Gyratory Floor Shaker	New Brunswick Scientific	Model G10
Spectrophotometer	ThermoScientific	ND-2000c
Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855485