Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57082

⸱

27 февраля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Для фракционирования растворимых и нерастворимых мутант гентингтина видов от мыши мозга и клетки культуры описан метод. Метод, описанный полезен для характеристик и количественной оценки потока белок гентингтин и СПИДа в анализе белка гомеостаза в патогенезе заболевания и при наличии возмущений

Аннотация

Накопление смятых протеинов имеет центральное значение для патологии в болезни Гентингтона (HD) и многих других нейродегенеративных расстройств. В частности ключевой особенностью патологических HD это ненормальное накопление Мутантный белок HTT (mHTT) в высокой молекулярной массой комплексов и внутриклеточные включения органы, состоящие из фрагментов и других белков. Традиционные методы измерения и понять, что вклад различных форм mHTT содержащих агрегаты включают микроскопии флуоресцирования, Западный анализ помаркой и фильтра улавливания анализов.

Однако большинство из этих методов являются конформации конкретным и поэтому не может разрешить полное состояние потока белка mHTT из-за сложного характера агрегатные растворимость и резолюции.

Для определения совокупных mHTT и различных модифицированных форм и комплексов разделения и солюбилизация клеточных агрегатов и фрагменты является обязательным. Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и визуализировать растворимых mHTT, мономеры, олигомеры, фрагменты, и нерастворимые высокомолекулярные (HMW) накопленных mHTT видов. HMW mHTT треки с прогрессирования заболевания, соответствует мыши поведения отсчетов и было выгодно модулированные некоторых терапевтических вмешательств1. Этот подход может использоваться с мыши мозга, периферических тканях и культуру клеток, но могут быть адаптированы к другие модели систем или болезни контекстах.

Введение

Разрушение белка контроля качества сетей, которые обеспечивают надлежащего складные и деградации клеточных белков — вероятно, центральное место в патологии в болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Гентингтона (HD) и другие «сворачиванию белков» расстройства,2,3. Глубокое понимание proteostasis сетевые компоненты и их вклад в патологии Поэтому решающее значение для разработки более терапевтических вмешательств. HD это вызвано ненормальное расширение CAG повторять в течение HD гена, что приводит к расширенный участок polyglutamines (polyQ) в белок гентингтин (НТТ)4. Последовательное патологических особенностью патогенеза HD является полученный сворачиванию, накопление и агрегирования HTT в регионах мозга и периферических тканях, который был показан несколькими способами мешать нормальной клетки гомеостаза и функции 5 , 6. Хотя HTT повсеместно выражается, средний колючий нейронов в стриатума выборочно уязвимых и наиболее открыто пострадавших с заметных корковой атрофии, также связанные с HD патогенеза.

Формирование агрегатов HTT в мозге животных моделей и HD пациентов обычно служил прокси маркера для прогрессирования заболевания и Доминант отрицательный прирост функции для mHTT7. Хотя конкретные механизмы, которые белка сворачиванию и агрегирование может способствовать mHTT индуцированной токсичности остаются неясными, инвариантная и неизбежной особенностью является формирование этих включений в мозге пациентов HD и различных животных моделей. Включений появляются состоять главным образом из накопленных HTT фрагменты, содержащие N-терминальный расширил polyQ, указывающее, что Протеолиз и обработку полноразмерных HTT, а также альтернативного сплайсинга8,9 может играть важную роль в патогенезе HD. N-терминальный HTT фрагментов могут представлять собой патологические формы HTT, который может быстро объединять, nucleate и ускорить или распространять процесс агрегации10.

Однако присутствие этих включений не обязательно коррелирует с НТТ индуцированной токсичности или клеток смерть11. HTT было предложено пройти процесс агрегации из растворимых мономера через растворимых олигомерных видов и β-лист фибриллами нерастворимых агрегатов и включений12. Урегулирование этих различных видов белков через стандартный биохимических анализов был вызов в области из-за их стабильность, низкая-моющее средство литического буфера и сложности в визуализации с помощью стандартных биохимических анализов. Таким образом методологические соображения имеют решающее значение в выявлении степени и шаблон накопленные и агрегированных mHTT.

Протокол, представленные здесь предоставляет метод для визуализации несколько промежуточных HTT, специально образование нерастворимых HMW HTT видов, который появляется внимательно отслеживать с HD патогенеза и болезнь прогрессии1,13 ,14. Будучи в состоянии решить и отслеживать несколько видов mHTT обеспечивает исследователей биохимических инструмент для изучения патогенеза заболевания и оценки потенциальных терапевтических вмешательств через их модуляции и влияние на патогенез болезни.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

-Животных этики заявление эксперименты проводились в строгом соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных протокола институциональный уход животных и использование Комитета (утвержденных исследований на животных и национальных институтов здравоохранения IACUC) Калифорнийского университета в Ирвине, АААЛЖ аккредитованные учреждения. Были предприняты все усилия для сведения к минимуму страдания животных.

1. Подготовка буфера Lysis

  1. Подготовка «Растворяется» буфера lysis (10 мм трис рН 7,4, 1% тритон-X 100, 150 мм NaCl, 10% глицерина) и стерильного фильтра через 0,22 мкм фильтром.
    1. Для работы «Растворяется» литического буфера, измерить N-Ethylmaleimide (NEM) и тщательно растворяют в 100 мм phenylmethysulfonyl фтора (PMSF) растворяют в 100% EtOH.
      Примечание: Ингибиторы буфера Lysis: (i) 20 мм N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0,2 мм PMSF; (iii) 1 мм Ортованадат натрия (Na3VO4); (iv) 1 мкг/мл leupeptin; (v) 1 мкг/мл Апротинин; (vi) 20 мм фторид натрия (NaF).
      Предупреждение: Носите маски, при работе с NEM во всем протокол. Рабочая литического буфера должны быть сделаны свежие для обеспечения активных ингибиторов.
    2. Для растворимых литического буфера с ингибиторами протеаз, добавить ингибиторы в следующем порядке: фторид натрия (NaF), до объема с холодной литического буфера, Ортованадат натрия (Na3VO4), Апротинин и Leupeptin.
  2. Для «Нерастворимых» буфера lysis дополнение к 4% SDS, добавив 500 мкл 20% SDS 2 мл буфера lysis «Жидкого». Оставьте при комнатной температуре.
    Примечание: SDS будет выпадать в осадок при хранении при температуре 4 ° C; Учитывайте это при комнатной температуре. Окончательный состав литического буфера: 10 мм трис (рН 7,4); 1% тритон X-100; 150 мм NaCl; 10% глицерина; 4% SDS (только нерастворимые).

2. растворимые/нерастворимый фракционирование протокол

Примечание: Рис. 1 приведена схема.

  1. Ярлык два комплекта трубок для каждого образца: «Жидкого» и «Нерастворимых.»
  2. Мкл X-ледяной рабочей растворимых литического буфера дополняют ингибиторы протеазы (см. 1.1.1) ткани.
    Примечание: X = объем варьируется в зависимости от количества ткани; Приведены в таблице 1.
  3. Для мыши мозговой ткани (то есть, Полосатое тело) dounce медленно 30 раз в 1 мл douncer стекла и пипетки в «Нерастворимые» помечены трубка (держать на льду).
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не сломать поверхности жидкости после запуска douncing, как пузыри будут формы и может привести к неполной гомогенизации.
  4. Для клеток (т.е., HeLa, HEK293T) промойте клетки один раз с холодной, ПБС. Удалить PBS и применяются минимальный объем буфера lysis клетки и снять с ячейки скребок.
    Примечание: Для выше линии клетки, клетки были покрытием на 5 x 105 клеток на 6 хорошо пластины и вырос почти до confluency. Один хорошо сравнима с томов, используемых для мыши стриатума.
  5. Передача огневки или в lysate клетки помечены, «Нерастворимых» трубы и лизируют на льду 1 h (начало часов после обработки окончательный трубки).
    Примечание: Для lysates клетки, нарезанных несколько раз, чтобы разрушить скопления клеток до начала инкубации. Избегайте образования пузырьков. Кратко вихря пульс каждый образец для 1 s на полпути через лизировать.
  6. Центрифугуйте образцы на 4 ° C на 15 000 g x 20 мин.
  7. Восстановите супернатанта как фракция «Жидкого».
    1. Удалить с пипетки, будьте осторожны, чтобы не нарушить Пелле/облачный слой, как это будет загрязнять дроби. Накапайте растворимая фракция в «Жидкого» помечены трубы. Держите на льду.
  8. Помыть лепешка с 500 мкл буфера lysis (x2) и центрифуги на 4 ° C на 15 000 x g 5 минут после каждого мытья; Это нормально, если некоторые из облачный слой накапаны выкл.
  9. После окончательного вымыть удалите все оставшиеся мыть буфера, оставив только ткани Пелле.
    Примечание: С этой точки, нерастворимый образцы теперь должны храниться при комнатной температуре.
  10. Ресуспензируйте лепешка с X-мкл буфера lysis дополнена 4% SDS (объем может корректироваться в зависимости от размера гранул; см. таблицу 1).
  11. Sonicate каждый образец для 30 s при комнатной температуре с sonicator зонд (125 Вт, 20 кГц, пульс, амплитуда 40%, смотрите Таблицу материалы).
  12. Образцы (Роллинг кипения) Варите 30 мин; Центрифуга кратко (15 s) на 6000 x g а не теряют любой образец.
  13. Выполнять assay протеина DC (детергент совместимый) (см. Таблицу материалов) или assay протеина Lowry для измерения концентрации протеина (рекомендуется начал разведениях 1/5 образца соответствующих литического буфера для культуры клеток и 1/10 для лизатов ткани).
    Примечание: Концентрации белка придется читать с помощью DC или Лоури пробирного благодаря высокой концентрации моющего средства.
  14. Аликвота образцов на 50 мкл пакеты, чтобы избежать проблем замораживания оттаивания.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь до дальнейшего биохимический анализ путем сохранения обеих фракций при-20 ° C.

3. Западная помарка и количественная оценка

  1. Выполните западных помарках как сообщалось других1,13 , разбавления 30 мкг образца 1:1 в загрузке буфера (1.6 x загрузки краска, 1 x сокращения).
    Примечание: 30 мкг белка на фракции достаточно, но может быть скорректирована для оптимального разрешения. 3 - 8% трис-ацетат Полимерность гелей должен использоваться для нерастворимых дроби. 4 - 12% бис-трис гели рекомендуются для растворимых фракций.
  2. Варить 5 мин центрифуги образцы (кипения) кратко (15 s) на 6000 x g для сбора образцов.
  3. Анализируйте фракций SDS-PAGE и Западная помарка, по словам производителя протокол для сокращенных проб.
    Примечание: Не растворимой фракции устраняет лучше всего, когда переносится на 0,45 мкм нитроцеллюлозную мембрану. 0,45 или 0,2 мкм нитроцеллюлозы могут использоваться для растворимых фракций, в зависимости от размера протеина интереса. За лучший перевод HMW материалов могут потребоваться некоторые оптимизации.
  4. Пятно мембраны с пятна (например, MEMcode, см. Таблицу материалы) общий белок визуализировать загрузки эффективности белка.
    Примечание: Западных помарках могут быть проанализированы по интенсивности среднее пикселей. Растворимых фракций могут быть нормированы домоустройства белка лучший подходит для экспериментальной системы. Нерастворимые дроби как относительная белка изобилие проверялось реверсивные белка окраски или нормализации гистона 3 на отдельных помаркой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Резолюция растворимых и нерастворимых lysates клетки после фракционирование могут быть обнаружены с помощью западных анализа и фильтрации отсталости анализов (рис. 2). Например, HEK293T клетки были transfected с помощью трансфекции реагента (например, lipofectamine 2000), с HTT экзона 1 кодирования cDNA, содержащие 97 глютамина повторяет15 следуют поли пролина богатый регион, и эти клетки было разрешено Экспресс для 44 h. клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Некоторые меры предосторожности необходимы для вышеуказанных протоколов для обеспечения последовательного и количественных результатов. Во-первых, mHTT в обеих фракций спонтанно образуют агрегаты со временем на несколько циклов замораживания-оттаивания, особенно когда в высокой концентрации. Таким образом, имеет решающее значение для замораживания аликвоты парфюмерные белка и размораживать только необходимый объем до запуска assay, как описано в протоколе выше. Кроме того если нерастворимых фракция дает белый осадителя п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH (RO1-NS090390). Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Джоан Steffanfor технической помощи и обсуждения в ходе разработки этот assay.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стерильный фильтрMilliporeSCGP505REЗавинчивающаяся крышка, стерильный вакуумный фильтр
1 мл Тканевый измельчитель, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModel Q125
DC Protein AssayBiorad5000111сравним с анализом Lowry Tris
1M буферный растворAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M растворTeknovaS0251
ГлицеринFisherBP229-1
20% SDS растворTeknovaS0295
N-этилмалеимидSigmaE1271
Фенилметилсульфони фторидSigmaP7626создать 100 мМ стоковый раствор в 100% EtOH, хранить по адресу 4° C
Ортванадат натрияSigmaS6508Создать 0,5М стоковый раствор в воде
ЛейпептинSigmaL2884Создать 10 мг/мл стоковый раствор в воде
АпротининSigmaA1153Создать 10 мг/мл стоковый раствор в воде
Фторид натрияSigmaS4504Создать 500 мМ стоковый раствор в воде
Anti-HTTMilliporeMAB5492Используйте 1:1000 для вестерн-блоттинга, 1:500 для анализа задержки фильтра
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Используйте 1:1000 для растворимого вестерн-блоттинга

Ссылки

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73(2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710(2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SDS
Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.