Методическая статья

Imaging промежуточных филаментов и микротрубочек с 2-мерной прямой стохастических оптических реконструкции микроскопия

DOI:

10.3791/57087

⸱

6 марта 2018 г.

 ,  ,  , 
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая цель этой методологии является дать оптимальных экспериментальных условиях от Пробоподготовка для захвата изображений и восстановления для выполнения 2D двойной цвет изображения dSTORM микротрубочки и промежуточные филаменты в фиксированных ячейках

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цитоскелет, состоящий из актина микрофиламенты, микротрубочки и промежуточные филаменты (КРП), играет ключевую роль в элементе управления формы клеток, полярности и подвижности. Организация сетей актина и микротрубочек широко изучены, но что IFs не еще характеризуется полностью. МФСМЦ имеют средний диаметр 10 Нм и формы сеть расширения всей цитоплазме клеток. Физически они связаны с актина и микротрубочек через молекулярные моторы и цитоскелета компоновщики. Этот плотный Ассоциация находится в центре регулирующих механизмов, обеспечивающих скоординированного регулирования трех цитоскелета сетей, необходимых для большинства функций клеток. Поэтому важно визуализировать IFs самостоятельно, а также совместно с каждой из других сетей, цитоскелета. Однако, если сети являются чрезвычайно плотной в большинстве типов клеток, особенно в глиальных клеток, что делает ее резолюции очень трудно достичь с стандартным флуоресцентной микроскопии (боковые резолюции ~ 250 Нм). Прямые стохастических оптической микроскопии реконструкции (dSTORM) — это метод, позволяя получить в боковых резолюции один порядок величины. Здесь мы показывают, что боковой dSTORM резолюции достаточно для устранения плотной Организации если сетей и, в частности, если пучки окружающих микротрубочек. Такая жесткая ассоциация может участвовать в координации регулирования этих двух сетей и Май, объяснить как виментин IFs шаблон и стабилизировать микротрубочек Организации, а также могут влиять микротрубочек зависимых везикулярного людьми. В целом мы покажем, как наблюдение за два цитоскелетных компонентов с двойной цвет dSTORM техника приносит новое понимание их взаимодействия.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10 Нм диаметр гомо - или heteropolymers клетки типа определенное подмножество если белков цитоплазматического промежуточные филаменты (IFs). МФСМЦ участвовать в большой спектр клеточных функций, таких как клетки моторики, распространением и стресс ответы. Их ключевая роль выделяется тот факт, что более чем 90 заболеваний человека вызваны непосредственно мутации в если белки; например изменения в составе если сопровождает роста опухоли и распространение1,2,3. Существует растущий доказательства того, что три цитоскелета системы работают совместно для клеточных функций управления таких клеток поляризации, отдел и миграции2,3. Поскольку нет жесткой связи между функциями и пространственных архитектуры, важно получить понимание структурной организации, если с другими волокнами и лучше понять цитоскелета кросс talk. Эта статья предоставляет протокол для выполнения суперразрешением технику двойной цвет dSTORM (прямая стохастических оптической реконструкции микроскопии)4 и как она используется для изучения взаимодействия между если и микротрубочек в фиксированной, культивированный клетки в 2 размерах (2D).

Несколько методов супер резолюции были разработаны в последние десятилетия и там открытий были на происхождение Нобелевской премии по химии в 2014-5. Среди всех этих методов лежит методы, основанные на локализации одной молекулы, как PALM6 (Photo-Activated локализации микроскопии) который использует фотопереключаемых флуоресцентных белков,7 ШТОРМА с парами флуорофоров или dSTORM4 с обычными флуорофоров. Все эти методы основаны на тот же принцип, который состоит из (i переключатель большинства флуоресцентные репортеров в состояние «Выкл»» (non люминесцентные), (ii) стохастические активации подмножество их в люминесцентных государства для того, чтобы локализовать их пространственное положение с нанометровой точностью и (iii) повторение этого процесса с тем, чтобы активировать столько подмножеств флуорофоров как можно скорее. Окончательное изображение восстанавливается с помощью всех локализаций Активированные молекулы, обеспечивая латеральное разрешение до ~ 20-40 Нм. Несколько коммерциализированной оптических систем, позволяя PALM/шторм теперь доступны для биологов для обычных экспериментов. Здесь одна такая система была использована для изучения структурных ассоциации микротрубочек и IFs. Среди всех сингл молекула локализации на основе методов, был выбран метод двойной цвет dSTORM, потому что это хорошо подходит для наблюдать очень тонкий пластинчатый регионов (< 1 мкм) адэрентных клеток и может обеспечить значительное улучшение разрешения изображения с минимальные инвестиции времени и денег. Действительно dSTORM-это очень удобный и универсальный метод, который совместим с стандартной органические красители, обычно используются для пятнать клеточных и иммунофлюоресценции.

В то время как один цвет dSTORM изображения относительно просто можно получить с помощью Флюорофор Alexa6478, двойной цвет dSTORM требует, чтобы оптимизировать экспериментальных условиях, так что две краски может мигать правильно выбранного буфера, особенно когда есть ограниченное мощность лазера. Отличные документы уже доступны на методы для установки многоцветные изображения с dSTORM9,10,11,12,13, и эти документы подробно объяснить все возможные источники артефакты и деградированных изображения резолюции и как их преодолеть. В этой статье, оптимальные экспериментальных условий с точки зрения фиксации клетки, иммуноокрашивания, подготовка образца описаны изображений приобретение и реконструкции изображения для того чтобы получить изображения плотной цитоплазматической сети если и микротрубочек в Глиальные клетки с двойной цвет dSTORM. Кратко добыча/фиксации метода, описанного в Chazeau et al12 был адаптирован к глиальных клеток и используется с шагом после фиксации, оптимизированный антитела концентрации, шторм буфера с 10 мм МПС описаны в Демпси9 et al., который был установлено оптимальное для экспериментальной установки и образец типа.

Глиальные клетки главным образом выразить три типа если белков: виментин, Нестин и СВМС (глиальные кислой фибриллово белка). Эти три белки были показаны совместно полимеризоваться в астроциты14. Ранее мы показали, с помощью структурированных суперразрешением освещения микроскопии (SR SIM) что эти три если белки можно найти в же одной если нити накала и что они показывают аналогичные распределение и динамика в глиальных клеток 15. Из-за сходства между тремя если белки виментин пятнать был использован как репортер для всей сети если. С помощью dSTORM, нам удалось решить как если форма связок вдоль микротрубочек, которых не было возможности с дифракции ограниченный микроскопии методы15. Эти замечания могут помочь понять, как виментин IFs может шаблон микротрубочек и регулировать их траектории роста, содействия поддержанию полярности оси во время миграции клеток16. Супер-разрешением ключевую информацию о взаимодействия двух цитоскелета подсистем и принес понять связь между пространственной ассоциации и местные функции, которая может быть типа клеток конкретных17. В общем двухцветный dSTORM может использоваться для изучения перекрестных помех между цитоскелетных элементов или других видов органеллы, при том условии, что хорошо иммуноокрашивания условия достигаются с точки зрения плотности и специфичности. Этот метод будет полезным для лучше характеризуют изменения цитоскелета, наблюдаемые во время astrogliosis и глиобластома, наиболее распространенных и наиболее злокачественной опухоли центральной нервной системы, где это выражение IF белков изменены 18 ,19,,2021.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Coverslips подготовка (1 день, 30 мин)

  1. Место coverslips стекло 18-мм nº1.5H (170 мкм +/-5µm) на пластиковые стойки.
  2. Положите решетку в 100-мл стакан, наполненный ацетон и Выдержите в течение 5 мин.
  3. Трансфер стойки в 100-мл стакан, наполненный абсолютного этанола и Выдержите в течение 5 мин.
  4. Передать новые 100 мл стакан, наполненный абсолютного этанола стойки и стакан в ультразвуковой очиститель устройства (см. таблицу материалов) при комнатной температуре. Нажмите кнопку «вкл.» и подождите 10 минут.
  5. Поставить стойку под капотом ламинарного потока и пусть coverslips сухой или сухой coverslips подача фильтрованного воздуха.
  6. Положите решетку с coverslips в плазмы чистой устройство. Включите вакуумный насос, закрыть дверь, подождите 3 минут, чтобы сделать вакуум и переключиться на плазме за 1 мин использования coverslips вскоре после очистки. Не хранить их.

2. ячейки покрытия (1 день, 20 мин)

  1. Растут глиальных клеток линии U373 в минимум основных средних (MEM) с 10% плода Bovine сыворотки, 1% пенициллина и стрептомицина и 1% несущественные аминокислот в 10 см диаметр пластиковых Петри.
  2. Coverslips чистого стекла в 12-ну пластины под капотом ламинарного потока и добавьте 1 mL разогретой клеток средних за хорошо.
  3. Возьмите блюдо, содержащие клетки от клеток инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
  4. Удаление среды и добавляют 10 мл PBS.
  5. Удаление PBS и добавить 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА.
  6. Поместите блюдо обратно в инкубаторе для 2-3 мин.
  7. Добавить 10 мл теплой среде, разогретую при 37 ° C на блюдо и Ресуспензируйте клетки.
  8. Семян около 100 000 ячеек на колодец (~ 150 мкл клеток) в 12-ну пластины, которые содержат coverslips.
  9. Подождите по крайней мере 6 часов (или ночь) разрешить распространение клеток.

3. клетки фиксации (день 2, ч. 2)

  1. Подготовить цитоскелета буфер с трубы 80 мм, 7 мм MgCl2, 1 мм EGTA, 150 NaCl и скорректировать рН 6,9.
  2. Вымойте клетки один раз с PBS.
  3. Удаление PBS и аккуратно добавить 1 мл на хорошо извлечения/фиксации раствора (0,25% глютаральдегид, 0,3% Тритон X-100 в буфере цитоскелета) разогретую на 37 ° C.
  4. Инкубируйте 60 s при комнатной температуре.
  5. Удаление решения и осторожно добавьте 1 мл на хорошо разогретой и свежеприготовленные PFA (параформальдегида) 4% раствор разбавляют в буфере цитоскелета.
    Осторожностью: Использовать перчатки и работать под химические вытяжки.
  6. Место пластину 12-Ну обратно в инкубаторе при 37° C за 10 мин.
  7. Удаление ППД и добавить 3 мл PBS на хорошо.
    Примечание: Работать под химические вытяжки с перчатками и поставить рециркулированных ПФА в конкретной ячейке.
  8. Мыть дважды с PBS.
  9. Удаление PBS и добавить свежеприготовленные 10 мм NaBH4 раствор разбавляют в PBS для того, чтобы утолить аутофлюоресценция, откуда глютаральдегид.
  10. Инкубируйте 7 мин при комнатной температуре.
  11. Положите вторичного NaBH4 в конкретной ячейке.
  12. Промойте трижды 5 мин с PBS.
  13. Удаление PBS и добавить блокирование раствор (5% BSA в PBS).
  14. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре (или на ночь при 4 ° C).
    Примечание: Цитоскелет буфер может храниться при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. PFA, NaBH4 и глутаровый должны рассматриваться с особой осторожностью (капот, перчатки и конкретных утилизации бункеров). Решения должны добавляются и удаляются нежно для того чтобы сохранить целостность клеток. Важно, чтобы не позволить сухие клетки.

4. иммуноокрашивания (день 2, 5h)

  1. Приготовляют раствор первичных антител с использованием анти виментин и анти тубулин разбавления 1: 500 в решении блокировки.
  2. Накапать 100 мкл разбавленного первичных антител на фильм слой парафина и место coverslips Na górze их с клетками вниз.
  3. Инкубируйте клетки с первичного антитела для 2 h. Put coverslips обратно в тарелку 12-ну заполнены с PBS. Промыть трижды за 5 мин каждый раз в PBS при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
  4. В то же время готовить вторичные антитела решения с помощью мыши против Alexa647 и Alexa555 против крыс при разбавлении 1:1, 000 в решении блокировки. Инкубируйте клетки с вторичные антитела для 1 ч при комнатной температуре. Действовать как 4.2. защиты клеток от света.
  5. Поставьте coverslip обратно в тарелку 12-ну заполнены с PBS. Промыть трижды за 5 мин каждый раз в PBS при комнатной температуре на орбитальный шейкер. Удаление PBS и добавить 0,5 мл PBS, смешанного с 1 мкл 0,1 мкм tetraspeck бусины.
  6. Положите скважин на орбитальный шейкер для 30 минут промыть с PBS. Удаление PBS и инкубации клеток на 5 мин с 4% раствор ПФА в PBS. Промыть трижды в PBS.
    Примечание: Фиксированные клетки могут храниться на пару недель в PBS на 4° C. Иммуноокрашивания должно быть сделано в последнюю минуту.

5. Пробоподготовка (день 3, 5 мин)

  1. Положите аликвоты Меа (cysteamine, 1 M, рН 8.3), оксидаза глюкозы (100 x, 50 мг/мл), каталазы (500 x, 20 мг/мл) в корзину льда.
  2. Подготовка 50 мл буфера Tris-NaCl (50 мм трис, 10 NaCl, рН = 8) с 10% глюкозы (100 мг/мл).
  3. Подготовьте 1,2 мл визуализации буфера перед изображений с 10 мм МПС, глюкозооксидаза 0.5 мг/мл (75 ед/мл), каталазы 40 мкг/мл (80-200 ед/мл) в буфер Tris-NaCl с 10% раствор глюкозы.
  4. Маунт coverslip, содержащей помеченные клетки на держатель магнитный образца (например, chamlide палата) и добавьте изображения буфер полностью заполнить камеры. Наденьте крышку и убедитесь, что нет пузырьков воздуха между буфере визуализации и крышку.
  5. Чистота в нижней части образца с абсолютного этанола и убедитесь, что нет утечки. Используйте смазку для герметизации держателя образца должным образом, в случае необходимости.
    Примечание: Подготовить 1 М складе МПС раствор (pH 8.3 скорректированы с помощью HCl), запас оксидаза глюкозы в 50 мг/мл и запас каталазы в 20 мг/мл в воде, сделать аликвоты и хранить их при-20 ° C до один месяц для МПС и в год для глюкозооксидазы и каталазы. Не заморозить аликвоты. Заранее подготовить буфера Tris-NaCl и хранить его при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Добавление глюкозы в день эксперимента (шаг 5.3).

6. изображения приобретение (день 3, ~ 1 ч в клетку)

  1. Переключитесь на микроскопе. Переключиться на приобретение программного обеспечения и нажмите кнопку старт системы.
  2. Выберите приобретение Tab. средство Визуализации установки в группе Диспетчер установки инструмента. Выберите режим лазерный WF (широкое поле) приобретения. Выберите цель NA 100 X 1,46 . Выберите режим TIRF u-HP , который использует коллиматора, чтобы уменьшить поля зрения подсветкой и концентрировать энергию лазера в меньшей площади. Используйте optovar объектив 1.6 x который дает размер пикселя 100нм.
  3. Выберите инструмент временных рядов и настроить промежуток времени с 50 000 рамами и 0.0 мс между кадрами. Разверните узел инструмент каналов в группе средство приобретения параметр и выберите «Показать все».
  4. Установите Alexa647 трек: Проверьте 642 и 405 лазерные линии для возбуждения и принимать их включить. Выберите фильтр выбросов «655 LP» в программе Imaging установки. Переименование «647».
  5. Нажмите на «+» в средстве каналы , чтобы добавить еще один проход света и выберите режим «переключатель трек каждый: кадр» в средстве Настройки визуализации . Проверьте 561, 488 и 405 лазерные линии и принимать их включить. Выберите «BP 570-650 + LP750» выбросов фильтра и его использование optovar объектив 1.6 x. Проверьте, что выбран режим TIRF-uHP. Переименуйте трек «555».
  6. Выберите средство приобретения режим и установить размер кадра до 200 x 200 пикселей. Выберите инструмент фокус устройства и стратегию и установить определенный фокус 1 000 кадров (если существует система блокировки фокуса).
  7. Положить масло на цель и надел образца. Выберите вкладку Поиск и откройте затвор люминесцентная лампа. Найдите фокус и ячейки для изображений с помощью окуляра. Положите его в центре поля зрения с помощью джойстика.
  8. Выберите вкладку приобретения , чтобы вернуться в режим приобретения. Выберите «647» трек, задать мощность 642-лазера на 0,2%, равным 0 мощности 405-лазера, равным 50 мс и получить 50 время экспозиции. Выберите режим приобретения непрерывно наблюдать ячейка на экране. Отрегулируйте фокус. Убедитесь, что есть по крайней мере один tetraspeck шарик в поле зрения, увеличить контраст, чтобы увидеть их при необходимости. Используйте режим auto масштаб для отображения. Поля эпифлуоресцентного образ виментин сети, нажав на оснастку , сохраните его. Чтобы проверить TIRF освещения, нажмите на TIRF, отрегулировать угол освещения и/или коллиматор, если необходимо иметь однородное поле освещения и сохраните его.
    Примечание: Это важно, что TIRF и epifluorescent изображения высокого качества, прежде чем начать сбор необработанных данных. Разрывные, неравномерно помечены нитей вызовет плохое качество изображения dSTORM.
  9. Снимите трек «647» и выбрать и проверить «555» трек. Возьмите изображение эпифлуоресцентного сети микротрубочек и сохраните его. TIRF образ и сохранить его тоже.
  10. Снимите трек «555», выбрать и проверить «647» трек, затем нажмите непрерывный. Положить прибыль до 0 и время экспозиции до 10 г-жа установить мощность лазера 642-Нм до 100% для того, чтобы насос большую часть Alexa647 красителей в темное состояние (~ 2 кВт/см2). После того как флуорофоров начнут мигать, положить подверженности 15 мс и получить до 300. Выберите режим TIRF освещения. Используйте Индикатор диапазона режим без авто шкала для проверки, что сигналы одной молекулы не насыщают камеры (обозначен красным цветом). В этом случае уменьшите прибыль до насыщения исчезает. Бусы Tetraspeck будет оставаться насыщенных в начале приобретения. Нажмите Stop остановить непрерывное наблюдение ячейки.
  11. Разверните узел инструмент онлайн обработки и проверить онлайн обработка PALM для визуализации изображения шторм во время приобретения. Используйте следующие параметры: 9 размер маски пик (диаметр 9 пикселей), и 6 для пика интенсивности шума. Диссертации параметры будут определять молекулы, которые принимаются во внимание в процессе обработки (достаточно ярко и не перекрывающихся). В PAL-статистика инструмент, выберите тип участка: гистограммы, а гистограмма источник: точность. Нажмите начать приобретение.
  12. Во время приобретения переориентировать при необходимости (если устройство не блокировки фокуса). Отрегулируйте параметры (экспозиции, лазерной полномочий) и в конечном итоге перейти на линии лазера 405 нм (начиная 0,001%) сохранить средней плотности флуорофоров с минимальным расстоянием между одной молекулы 1 мкм (> 9 пикселей 100 Нм, размер маски пик) ( Рисунок 1A-B). Если плотность молекулы немного слишком высоко, используйте режим HILO (весьма склонны и ламинированные оптических листа) освещения вместо TIRF. Это позволит увеличить мощность лазера на 20%. Убедитесь, что пик точностью локализации на гистограмме реконструированный изображение ниже центрируется вокруг или ниже 10 Нм.
    Примечание: Обычно количество молекул уменьшается со временем, и медленно соответственно увеличивается мощность лазера 405 нм. Целью является уменьшение точность локализации (гистограмма отображается под изображением суперразрешением) насколько это возможно с пика ниже 10 Нм (рис. 1 c). Увеличиваете контрастность изображения PALM, при необходимости, если слишком много ярких бусин присутствуют в поле.
  13. Нажмите Stop остановить фильм достижении более 106 локализации (обычно после 40 000 кадров). Положить лазеры 0,2% (642 Нм) и 0 (405 нм). Сохраните необработанные данные приобретения шторм в .czi формате. Снимите трек «647» в средстве каналы и выберите проверить трек «555».
  14. Установите время экспозиции до 25 мс и получить 0. Нажмите на кнопку непрерывной и установить 488 и 561 лазеры на 100% для насоса Alexa555 красителей в темное состояние (~ 2 кВт/см2 ). Как только флуорофоров начнут мигать, положить прибыль до 250, используйте режим освещения HILO и проверьте, что одной молекулы не насыщают камеру в режим индикатора диапазона. Если это так, уменьшите прибыль. Нажмите стоп. Уменьшение мощности 488-лазера до 50%.
  15. Нажмите начать приобретение. Во время приобретения постепенно увеличьте прибыль всегда быть на пределе насыщения. Шаг за шагом Увеличьте мощность лазера 405 нм держать в поле зрения (см. шаг 6.18) средней плотности одной молекулы. Уменьшение мощности 488 лазера до 20-30%, когда 405 лазер является более чем на 15%. Затем постепенно уменьшаться 488 увеличивая 405 лазерной линии для того чтобы держать мигает молекул как можно быстрее. 488 лазерной линии в сочетании с лазерной 561 возбуждения при максимальной интенсивности увеличивает как на и вне ставки флуорофоров, тогда как 405 лазерной линии только увеличивает на скорость.
  16. Остановка на приобретение достижении более чем 500 000 локализации (после около 20 000 кадров), или более мигание не больше молекул. Сохраните необработанные данные приобретения шторм в .czi формате.
    Примечание: Всегда начинайте с более высокой волны во избежание обесцвечивания (или активации) других цветов. Поскольку камеры chamlide не запечатан, его можно изменить буфере визуализации регулярно, например для проверки условий различные буфера. С помощью 488 лазерной линии к разрушающим Alexa 555 красители необходим только тогда, когда мощность лазера 561 ограничен (с 100 МВт лазеры).

7. изображение реконструкция (5 мин)

  1. В средстве PAL-дрейф используйте тип коррекции на основе модели с автоматической сегментов с максимальным размером 8. Нажмите Применить несколько раз подряд до исправлениями дрейфа. Это на основе модели коррекции применяется алгоритм, основанный на анализе кросс корреляции, которая исправляет дрейфа.
  2. С помощью PAL-фильтр инструменты, улучшить внешний вид изображения, шторм, выбрав только молекулы, которые лучше всего были локализованы. К примеру, ограничить локализации точностью до 30 Нм и ПСФ 120-180 Нм.
  3. Используйте пикселей 5 или 10 Нм в инструмент PAL-визуализации , а также режим отображения Гаусса, с фактором расширения 1 PSF. Выберите отображать автоматического динамического диапазона HR с 95% значение и Render auto динамический диапазон SWF со значением 90%. Выберите лучшее качество рендеринга.
  4. Выберите преобразовать PALM, PALM меню Закладка Обработка (постобработки режим). Нажмите кнопку выбрать , а затем Применить. Сохраните созданный образ в формате. LSM (и не .czi, очень важно).
    Примечание: Реконструкции изображения может быть выполнена сразу после приобретения или более поздней версии в режиме обработки изображений приобретение программного обеспечения. В строке покинуть пост режим обработки можно повторно проанализировать стеки с разными значениями параметров (размер маски пик, пик интенсивности шума). Всегда выберите «удалить перекрывающиеся молекул» и не «средняя до локализации».

8. Оценка точности локализации изображения шторм (10 мин)

  1. Откройте ваш шторм необработанных данных и обработки изображений tab. Выберите метод PALM и затем PALM снова. Нажмите выбрать.
  2. Нажмите Применить , чтобы начать реконструкцию с помощью маски размера пик 9 и пика интенсивности шума 6 (или параметры, которые вы выбираете для изображения).
  3. Выберите инструмент прямоугольник графики и нарисуйте прямоугольник на raw изображений вокруг одной молекулы на поверхности стекла. Как правило, есть несколько одной молекулы там.
  4. Будут проанализированы пресс Применить снова и только молекулы внутри прямоугольника области.
  5. В PAL-статистика инструмент, выберите тип участка: гистограммы, а гистограмма источник: X или Y позиции, чтобы визуализировать позиции гистограммы.
  6. Сохраните таблицу с перечнем локализаций слева ниже изображения.
  7. Используя программное обеспечение анализа данных, Создание гистограммы X и Y позиции (рис. 1 d).
  8. Соответствовать распределений по Гауссу и сохранить значенияY X и σ σ. Σ точность локализацииSMLM оценивается (σX *Yσ) ^ 0.5.
  9. Повторите шаг 8.3-8.8 на столько молекул как можно скорее и среднее σSMLM

9. канал регистрации (5 мин)

  1. Откройте изображение шторм каждого цвета с помощью программного обеспечения Фиджи (изображение J).
  2. Выберите палочки инструмент для измерения позиции каждого tetraspeck бусины.
  3. Рассчитать смены X и Y для каждой шарик и в среднем их.
  4. Используйте команду «Перевести» перевести второе изображение с рассчитанной X и Y смены.
  5. Слияние двух изображений, используя команду Объединить каналы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскоп оснащен 50 МВт 405 нм и 100 МВт, 488, 561 и 642 Нм Лазеры твердотельные, EMCCD 512 x 512 камеры, альфа план АПО 100 X / 1,46 цель и группы проходят 570-650 / длинный пас 655 фильтры выбросов был использован для представителя результаты, представленные ниже.

Рисунок 1A дает пример молекулы плотности и сигнал шум, который должен использоваться при приобретении raw изображений. Хорошее качест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важнейшие шаги в протоколе

Мы представляем здесь протокол, который минимизирует артефакты в образах dSTORM микротрубочки и IFs в глиальных клетках. Артефакты могут быть созданы на каждом этапе подготовки проб и изображений: фиксации, блокировки, immunolabeling, дрейф во время приобретения, неоптимальные мигающий условий23. Мы перечислим ниже важнейшие шаги.

Очистка coverslips представляет собой важный шаг, ограничить неспециф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Mickael Лелек, Orestis Faklaris и Nicolas Бур для плодотворного обсуждения, Аристов Андрей и Елена голландской компании Rensen за помощь с суперразрешением техникой и Shailaja Сиитараман для внимательного прочтения рукописи. Мы с благодарностью признаем фотонные BioImaging UtechS (Imagopole) Citech Институт Пастера (Париж, Франция), а также сети инфраструктуры Франции-BioImaging, поддерживаемых Агентством исследований национального французского (АНР-10-INSB-04; Инвестиции в будущем) и округов Иль (программа Domaine d'Intérêt мажорных-Malinf) для использования в Микроскоп Elyra. Эта работа была поддержана Лига Contre le рака и французского национального исследования агентства (АНР-16-CE13-0019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Минимальная незаменимая среда (MEM)Gibco41090-028клеточная культура
заменимая аминокислотаGibco1140-050клеточная культура 1/100e
пенициллин-стрептомицинGibco15140-122клеточная культура 1/100e
Fœ тал бычья сывороткаGibco10270-106клеточная культура 1/10e
0,05 % Трипсин-ЭДТА (1X)Gibco25300-054клеточная культура
PBS 10xfischer научная11540486
покровное покрытие клеточной культуры 18 мм n° 1,5HMarienfield/Dominic dutsher900556покровные стекла
раствор параформальдегида (PFA)SigmaF8775клеточная фиксация
глутаральдегидаSigmaG5882клеточная фиксация
тритон X100SigmaT9284неионогенное поверхностно-активное вещество. Используется для фиксации клеток
борогидрид натрия (NaBH4)Sigma452904-25MLфиксация клеток
BSASigmaA7906пассивация образца 3% в PBS
Моноклональное антитело против виментина (V9) вырабатывается у мышиSigmaV6630первичные антитела
Крыса против альфа-тубулинаBioradMCA77Gпервичные антитела
Goat anti-Rat IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 555Fisher scientific10635923вторичные антитела
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 647Fisher scientific10226162вторичные антитела
TetraSpeck Microspheres, 0,1 &микро; m, флуоресцентный синий/зеленый/оранжевый/темно-красныйFisher scientificT7279флуоресцентные шарики
магнитная камера Chamlide магнитная клеточнаякамера Live Cell InstrumentCM-B18-1магнитный держатель образца, максимальный объем 1,2 мл
цистеамина (MEA)Sigma30070для мигающего буфера
глюкозооксидазы из Aspergillus nigerSigmaG0543для мигающего буфера
глюкозасигмадля мигающего буфера
каталаза из бычьей печениSigmaC9322для мигающего буфера
Tris (тризма)SigmaT1503для мигающего буфера
Wash-N-Dry покровный стеллажSigmaZ688568
парапленкаSigmaP7793-1EAпарафиновая пленка
ультразвуковой очистительFisher scientific15-335-6
Harrick плазменный аппаратPDC-32G-2
Очиститель плазмы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878(2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756(2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924(2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004(2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933(2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

dSTORMSTORM

Похожие статьи