Изоляции и культуры грызунов микроглии для поощрения динамичного разветвленная словотолкование в среде Serum-free

Краткое содержание

Усилия, чтобы понять микроглии функции подробно препятствовало отсутствие микроглии культуры моделей, которые пилки свойства зрелых в vivo микроглии. Этот протокол описывает изоляции и культуры подхода, призванного поддерживать надежные выживания микроглии весьма разветвленной зрелых крыс в условиях определенных средний.

Аннотация

Микроглии представляют собой 5-10% от всех клеток центральной нервной системы (ЦНС) и все чаще обращают внимание из-за их вклад во время разработки, гомеостаза и болезни. Хотя макрофаги были изучены подробно на протяжении десятилетий, специализированные особенности микроглии, ткани резидентов макрофаги ЦНС, остаются во многом загадочный, отчасти из-за ограничений в способность резюмировать Зрелые микроглии свойства в культуре. Здесь мы иллюстрируем простой процедуры для быстрой изоляции чистого микроглии от зрелого грызун мозга. Мы также обсудим условия сыворотки свободной культуры, которые поддерживают высокий уровень жизнеспособности микроглии со временем. Микроглии, культивируемых в этих условиях определяется средний exhibit сложной разветвленной процессы и поведение динамического наблюдения. Мы иллюстрируют некоторые последствия воздействия сыворотки на искусственный микроглии и обсудить, как эти сыворотки свободной культуры по сравнению с сыворотка облученных культур, а также микроглии в естественных условиях.

Введение

Как макрофаги паренхимы ЦНС микроглии взаимодействуют с огромным набором схем нейронов и глиальных сигнальной сети. Они играют жизненно важную роль в развитии и гомеостаза головного мозга через синаптических обрезки, Распродажа apoptotic клеток и переходных взаимодействия с нейрональные процессы^1,2. Микроглии являются раннего реагирования неврологических травм, расширяя их длинные, тонкие процессы для поражения сайтов для координации воспалительных реакций и ограничить кровотечение^3,4. Изменения в микроглии морфологии и функции являются вездесущими в острых и хронических травм ЦНС, и микроглии экспонат изменения морфологии, локализации и проявление воспалительных медиаторов в разнообразных заболеваний Штатов¹. Человеческие генетические исследования показывают, что мутации, которые изменяют риска для нейродегенеративные заболевания часто преимущественно или исключительно выражаются микроглии в неповрежденной ЦНС, указывая на важную роль для микроглии в патогенезе заболевания или прогрессирование⁵ . Учитывая их известность в травм и болезней, углубление понимания биологии микроглии является приоритетной для разработки новые терапевтические подходы.

Многие критические достижения понимания биологии микроглии возникли путем экстраполяции методы и механизмы, обнаружили в исследованиях других групп населения макрофагов, включая методы культуры, профили выражение гена и определения функциональных / Морфологические государств. Хотя обобщенные макрофагов, функции часто разыгрывают неожиданными способами в пределах ландшафта ЦНС, микроглии сами по себе являются узкоспециализированными, выставляют разветвленной морфологии и уникальный ген выражение подпись, которая отличает их от других тканей макрофаги⁶. Микроглии есть линия, которая отличается от большинства других тканевых макрофагов; они колонизировать ЦНС во время ранних эмбриональных волны примитивных кроветворения и самостоятельно обновить на протяжении всей жизни, независимо от взносов от окончательного кроветворения⁷. Полностью зрелые ген выражение подпись взрослого микроглии достигается не до второго послеродовой неделю⁸. Экологические сигналы от окружающих тканей играют важную роль в диктует макрофагов ткани специфических особенностей⁶, которая в ЦНС включает ограниченное воздействие факторов кровь, предоставленные blood - brain барьер⁹.

Одним из препятствий для полного понимания микроглии вклад ЦНС гомеостаза и болезней является сложность изложив специализированные свойства зрелых микроглии видели в vivo с очищенной ячейки в пробирке. Многие методы были разработаны для изоляции и культуру нетронутыми микроглии, но большинство подходов полагаться на сыворотке поддержать выживание клетки. Мы показали, что добавление сыворотки, которая по своей сути переменной реагента, содержит широкий спектр биологически активных молекул, особенно проблематичным, когда работа с микроглии потому, что он способствует Саркодовые морфологии, увеличение распространения, и увеличение фагоцитоза⁹ часто видели в естественных условиях , когда Микроглия подвергаются воздействию факторов кровь после нарушения blood - brain барьер. От этих показателей, сыворотка подвергается клетки напоминают травмы или заболевания государств микроглии, но такие изменения уменьшаются когда Микроглии являются культивировали в определенный рост среднего, содержащий РСУ-1 (или IL-34), TGF-β, холестерин и селенит.

Этот протокол обеспечивает детали для культивирования несовершеннолетних крыса микроглии сыворотки свободных условиях, связанных с недавно опубликованной работе⁹. Этот протокол упрощен для крыс от послеродового день 21-30 (P21 - P30), но может быть адаптирована к изолировать микроглии от крыс и мышей, любого возраста, хотя доходности и общей жизнеспособности будет варьироваться в зависимости от вида и возраста животного. Максимальная урожайность и оптимальной эффективности достигается при использовании немного незрелых микроглии (~ P9), урожайность и жизнеспособности, постепенно сужающийся к несколько более низкого уровня в взрослых животных. Микроглии также могут быть изолированы от мышей, но мы обнаружили, что клетки крыс показывают значительно выше урожайность, жизнеспособность и сложности разветвленной морфологии, когда по сравнению с клетки мыши в сыворотке бесплатно культур. Животных в возрасте более чем P50 не были оценены с настоящим Протоколом. Эта процедура изоляции immunopanning была оптимизирована для сведения к минимуму изменения в микроглии транскрипционный анализ профиля при изоляции и максимального течению жизнеспособность клеток. С помощью этих методов и средств массовой информации формулировок, высокой жизнеспособности первичных культур может быть устойчивым на недели. Микроглии, культивируемых в этих условиях проявляют весьма разветвленная Словотолкование, быстрое расширение и втягивание процессов и относительно низкие показатели распространения. Мы подчеркнуть значимость сыворотки воздействия на эти свойства и обсудить сильные и слабость этого метода по сравнению с другими подходами.

Протокол

Все процедуры с участием грызунов соответствует Стэнфордского университета руководящие принципы, которые соответствуют национальных и государственных законов и политики. Все животные процедуры были одобрены Стэнфордского университета административной панели на лабораторных животных уход.

Примечание: В Таблице материалыпредоставляются все решения и буфера композиции.

1. Подготовьте чашку Петри для CD11b Immunopanning (день 0)

Примечание: 1 immunopanning блюдо готовиться каждые 1-2 несовершеннолетних крыса мозги.

1. Добавьте 25 мл 50 мм трис pH 9.5 раствора в чашке Петри 15-см.
2. Добавьте козье анти мыши IgG (H + L цепи) в блюдо для конечной концентрации 6 мкг/мл. Вихрем пластины равномерно распределить.
3. Инкубировать блюдо для 1-3 ч при 37 ° C.
4. Полоскания блюда три раза с DPBS⁺⁺ (фосфат амортизированное saline (PBS) с Ca^{2 +} и Mg^{2 +}), затем заменить раствором панорамирование буфер, содержащий 1 мкг/мл OX42 антител. Оставьте блюда на ночь при комнатной температуре на плоской поверхности.

2. ткани коллекции (1 день)

Примечание: Этот протокол должен взять ~ 3-4 ч.

1. Перед началом, убедитесь, что все решения стерильных и охлажденные на льду. Холод все документы на льду и стерилизовать с этанолом, перед использованием.
2. После соответствующих нормативных процедур жертву несовершеннолетних Лаборатория Крыса удушение углекислого газа.
   Примечание: Кроме того, молодых животных могут быть принесены в жертву с смертельной дозы кетамина/Ксилазина (100-200 мкл рабочего раствора кетамина 24 мг/мл, Ксилазина 2,4 мг/мл). Кетамин/Ксилазина должен использоваться, если животных не менее 14 дней. При использовании нескольких животных, экстракт тканей из одного животного и поместить его в предварительно охлажденные DPBS⁺⁺ на льду, прежде чем приступить к последующим животных.
3. Щепотка hindpaw и обеспечить полное отсутствие отклика от животного перед продолжением.
4. Transcardially perfuse животное с 10-30 мл ледяной перфузии буфера с помощью иглы 27½-G, до тех пор, пока буфер работает четко.
   Примечание: Объем перфузии буфера будет варьироваться в зависимости от размера и возраста животного.
5. Сразу же после перфузии удалите голову животного. Поступающие из спинного мозга вырезать затылочного мыщелка на каждой стороне Рассечение ножницами, будьте осторожны, чтобы не повредить мозг. После резки каждой стороны тщательно, разрезать одну сторону вдоль теменной и лобной кости к носовой кости. С щипцами осторожно тянуть обратно в верхней части черепа, быстро удалить мозга (или структуры ЦНС интерес) и поместить в предварительно охлажденные DPBS⁺⁺ на льду.
6. Повторите для всех остальных животных.
   Примечание: Все разбирательства шаги должны выполняться в Ламинарный шкаф в надлежащих условиях стерильности.

3. механические диссоциации (1 день)

1. После того, как были собраны все мозги, нарезать 1 мм³ куски в чашке Петри, на льду одного мозга с лезвием скальпеля холодной и передавать гомогенизатор ледяной dounce с 5-7 мл ледяной douncing буфера. Отделить один мозг одновременно.
2. Отделить ткани с помощью 10-20 нежный и неполной штрихи с гомогенизатор dounce свободную. Будьте осторожны не непосредственно раздавить ткани на нижней части гомогенизатор, но вместо этого Импел ткани через пространство между сторонами поршень и гомогенизаторы.
3. Осторожно выньте поршень для предотвращения появления пузырьков воздуха. Разрешить плохо диссоциированных ткани куски поселиться в нижней части гомогенизатор и передачи супернатант новой охлажденные 50 мл Конические трубки.
4. Замените удаленные тома свежие douncing буфера и повторите шаги 3.2 и 3.3 для в общей сложности 3-4 раундов, или до тех пор, пока отделить все ткани. Повторите процедуру для каждой мозга.

4. миелина удаления (1 день)

Примечание: Миелина удаления используется для изоляции микроглии от животных старше P12.

1. Измерить объем суспензии клеток в 50-мл Конические трубки с помощью пипетки 25 мл, а затем добавить ледяной douncing буфер для регулировки объема до 33,5 мл.
2. Добавьте 10 мл миелина разделения буфера (MSB) суспензии клеток и смесь тщательно, инвертирование трубке несколько раз. Это приведет к 23% конечной концентрации MSB в объеме 43,5 мл.
3. Центрифуга для ячейки 15 мин на 500 x g при 4 ° C с медленным торможения.
   Примечание: Центрифуги должен занять примерно 1,5-2 мин замедляться. Это будет генерировать верхний слой миелина и мертвые клетки мусора, несколько темных супернатант и меньше Пелле, который обогащен для живых клеток.
4. Снять верхний слой миелина/мусора и супернатант с пипеткой. Будьте осторожны при удалении верхнего слоя для обеспечения как большая его часть удаляется как можно.
5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 12 мл панорамирование буфера. Аккуратно нарезанных суспензию клеток разрушить любой скопления клеток, которые могли остаться.

5. Immunopanning (1 день)

1. Передайте суспензию клеток через стрейнер ячейки 70 мкм для удаления больших мусор или скопления клеток.
2. Промойте с покрытием OX42 сдвига блюдо три раза с DPBS⁺⁺. Не позволяйте пластину для полностью сухой между моет.
3. Слить последний DPBS⁺⁺ мыть и применить отфильтрованные клеток подвеска для панорамирования блюдо. Аккуратно водоворот пластину для распространения клеток, а затем инкубировать пластину на плоской поверхности при комнатной температуре для 20 минут, чтобы позволить клетки присоединиться. Не дольше 20 минут инкубации или клетки станет очень трудно оправиться от блюдо.
4. Промойте панорамирования блюдо с DPBS⁺⁺ 10 раз для удаления не сторонник клеток. Микроглии будет настолько прочно прикреплены к плите, вихрем пластины с каждого полоскания для обеспечения удаления других клеток не сторонник.
5. Слить последний DPBS⁺⁺ мыть и заменить 15 мл DPBS⁺⁺ и 200 мкл трипсина (1,25% раствор).
6. Инкубируйте блюдо крупностью до 10 минут при 37 ° C с 10% CO₂ в trypsinize.
   Примечание: Не продолжаться дольше, чем 10 мин или микроглии станет трудно удалить.
7. После 10 минут trypsinization будет по-прежнему застрял микроглии к пластине. Слить трипсина/DPBS⁺⁺ и осторожно промыть 2 x с DPBS⁺⁺ удалить трипсина, заменить 12 мл ледяной микроглии роста средних (MGM).
8. Место, панорамирование блюдо на льду на 2 мин, чтобы помочь ослабить взаимодействия клеток/подложки и убедитесь, что блюдо плоские, чтобы предотвратить высыхание областях сдвига блюдо.
9. Пипетка энергично, с 10-мл пипетки и пипетки контроллером на высокой скорости для восстановления клеток от сдвига блюдо. Нарисуйте сетку 16 x 16 с потоком жидкости из пипетки попытаться удалить все клетки.
10. Проверьте клетки под микроскопом, при 20-кратном чтобы убедиться, что клетки отсоединяется от пластины. Марк пятна на вершине блюдо, где клетки все еще застряли и повторить, дозирование в этих областях.
11. Собирайте суспензию клеток и аликвота 3-4 мл супернатант в 15 мл Конические трубки. Спина на 15 мин на 500 x g при 4 ° C с медленным торможения.
    Примечание: Спиннинг микроглии через небольшой объем позволяет для максимального восстановления клеток.
12. Аспирационная супернатанта, оставляя 0,5 мл MGM с Пелле ячейки.
13. Ресуспензируйте каждой гранулы в оставшихся MGM и объединить клетки от всех трубок.
14. Подсчет количества ячеек с Горяева.
15. Плита клетки, как описано в шагах 6 - 7 в зависимости от приложения.
16. Культура клетки при 37 ° C с 10% CO₂.
    Примечание: Клетки могут быть культуры до 3-4 недель с регулярные СМИ изменений или одной недели без изменения средств массовой информации.

6. пятно покрытие культуры ткани пластины/Coverslips (1 день)

1. Плиты 15 мкл коллаген IV покрытия непосредственно в центре пластины 24-ну анионные/Катионный покрытием культуры тканей (подробную информацию см. в Таблице материалы ) и инкубировать в течение 15 минут при 37 ° C с 10% CO₂.
2. После подсчета клеток с Горяева разбавляют клетки 2.3 x 105/мл в MGM. Аспирационная коллаген IV место и сразу же пластины 15 мкл суспензии клеток в этом месте; Это даст 3.5 x 10³ клеток/спот. Инкубируйте 5-10 мин при 37 ° C с 10% CO₂ разрешить клетки, чтобы присоединиться, добавить 500 мкл CO_2-достижение равновесного уровня TGF-β2/Ил-34/холестерин, содержащий роста среднего (TIC) осторожно к колодцу.
3. Если покрытие на coverslips, первый слой стерильных стеклянных coverslips с 10 мкг/мл уловки D-Лизин (PDL) H₂O 1 h на RT, промойте H₂O 3 раза и пусть высыхает в капюшоне под УФ светом. После coverslips сухой, продолжите пятно покрытие на coverslips, как описано в шаге 6.2.

7. покрытие для изоляции RNA/белков

1. День 1, пальто всей области 24-ну анионные/катионных покрытием культуры ткани пластины с покрытием коллаген IV и инкубировать на 10 мин - 1 ч при 37 ° C с 10% CO₂, затем удалить и сразу же пластины 3-5 x 10⁴ клетки/колодец в CO₂ достижение равновесного уровня ТИЦ СМИ.
2. На 2 день выполните изменения 50% средств массовой информации для каждого хорошо на следующий день после приготовления. Мертвые клетки, как правило, кластер в центре хорошо, так что СМИ от там.
3. Выполните изменения СМИ 50% каждые 2-3 дня для поддержания культур. Если средства массовой информации изменения ввести ненужные переменной для культур, клетки могут выжить в течение приблизительно 1 неделю без изменений средств массовой информации, в отличие от более чем 3 недели регулярного технического обслуживания.

Результаты

Этот протокол описывает метод для культуры высокой чистоты разветвленное микроглии от несовершеннолетних крыс. Аналогичные результаты можно получить с помощью незрелых, перинатальной и взрослых животных, как описано ниже. Поскольку ячейки изоляции часто включают в себя тонкие нюансы и множество возможностей для клетки, чтобы умереть, мы использовали контрольно-пропускные пункты контроля качества для определения успеха на различных этапах. Мы обычно контролируется клеточных суспензий, с по...

Обсуждение

Потому что микроглии служат дозорных иммунные клетки ЦНС, они являются очень реагировать на экологические изменения; Таким образом для сведения к минимуму воспалительных реакций в клетках во время их изоляции и культуры⁸требуется большой осторожностью. Это достигается в этом протоколе через скорости и температуры. Сохраняя клетки на льду или на 4 ° C, всякий раз, когда возможно значительно снижает активации, так что все шаги центрифугирования занять место на 4 ° C, животных увлажненную с ледяной п...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Крыса: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
мышиный антикрысиный CD11b моноклональный (клон OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	панорамирование: 1:1,000; Окрашивание: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Окрашивание: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Окрашивание: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Окрашивание: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Окрашивание: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Окрашивание: 1:500
Triton-X (моющее средство при окрашивании ICC)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Гепаран сульфат	Гален Лабораторные принадлежности	Cat# GAG-HS01
Гепарин	Сигма	Cat# M3149
Пептон из сухих веществ молока	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Мышиный ИЛ-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Холестерин овечьей шерсти	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Коллаген IV	Corning	Cat# 354233
Олеиновая кислота	Cayman Chemicals	Кат# 90260
11(Z)Эйкозадиеновая (гондоевая) кислота	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Кальцеин AM краситель	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium гомодимер-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Пенициллин/Стрептомицин	Gibco	Cat# 15140-122
Глутамин	Gibco	Cat# 25030-081
N-ацетил цистеин	Sigma	Cat# A9165
Инсулин	Sigma	Cat# 16634
Апо-трансферрин	Sigma	Cat# T1147
Селенит натрия	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (с высоким содержанием глюкозы)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Поли-D-лизин	Sigma	Cat# A-003-E
Пластины Primaria	VWR	Cat# 62406-456
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Stock reagents  Восстановление
апотрансферрина			: 10 мг/мл в PBS Используемая концентрация: 1:100 Хранение: -20°С; C
N-ацетилцистеин			Восстановление: 5 мг/мл в H2O Используемая концентрация: 1:1,000 Хранение: -20°; C
Восстановление селенита			: 2,5 мг/мл в H2O Используемая концентрация: 1:25 000 Хранение: -20° C
Коллаген IV			Восстановление: 200 мкм; г/мл в PBS Используемая концентрация: 1:100 Хранение: -80° C
TGF-b2			Восстановление: 2 мг/мл в PBS Используемая концентрация: 1:1 000 Хранение: -20°; C
Ил-34			Восстановление: 200 μ г/мл в PBS Используемая концентрация: 1:1,000 Хранение: -80°Град; C
		в овечьей шерсти	Восстановление: 1,5 мг/мл в 100% этаноле<бр/> Используемая концентрация: 1:1 000<бр/> Хранение: -20°С; C
Восстановление сульфата			: 1 мг/мл в H2O Используемая концентрация: 1:1,000 Хранение: -20°; C
Олеиновая кислота/Гондовая кислота			Восстановление: Гондоевая: 0,001 мг/мл; Олеиновой: 0,1 мг/мл в 100% этаноле<бр/> Используемая концентрация: 1:1 000<бр/> Хранение: -20°С; C
Восстановление гепарина			: 50 мг/мл в PBS Используемая концентрация: 1:100 Хранение: -20°; C
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
Solutions  Рецепт буфера для
перфузии			г/мл гепарина в DPBS++ (PBS с Ca++ и Mg+ +) Комментарии: Использовать при ледяном
Douncing Buffer			Рецепт: 200 μ L 0,4% DNaseI в 50 мл DPBS++ Комментарии: Использование при ледяном
промывке Буфер			Рецепт: 2 мг/мл пептона из сухих молочных веществ в DPBS++
Питательная среда для микроглии (MGM)			Рецепт: DMEM/F12, содержащий 100 единиц/мл пенициллина, 100 μ г/мл стрептомицина, 2 мМ глутамина, 5 мкм; г/мл N-ацетилцистеина, 5 мкм; г/мл инсулина, 100 мкм; г/мл апотрансферрина и 100 нг/мл селенита натрия Комментарии: Используйте ледяной MGM для снятия микроглии с посуды.
Рецепт покрытия			: MGM, содержащий 2 μ г/мл коллагена IV
Рецепт буфера для разделения			: 9 мл Percoll PLUS, 1 мл 10x PBS без Ca++ и Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2 Комментарии: Хорошо перемешать после добавления  CaCl2 и MgCl2
TGF-b2/IL-34/Холестеринсодержащие питательные среды (TIC)			Рецепт: MGM, содержащий человеческий 2 нг/мл TGF-b2, 100 нг/мл мышиного IL-34, 1,5 г/м; г/мл холестерина овечьей шерсти, 10 мкм; г/мл гепарансульфата, 0,1 г/мкм; г/мл олеиновой кислоты и 0,001 мкм; г/мл гондевой кислоты Комментарии: Обязательно добавляйте холестерин в среды, подогретые до 37 °deg; C и не прибавлять более 1,5 мкм; г/мл или он выпадет в осадок. Не фильтруйте холестеринсодержащие среды. Уравновесьте среду TIC 10% CO2 в течение 30-1 часа перед добавлением в клетки для обеспечения оптимального pH.

натрияХолестерин гепарана: 50 мкм; Collagen IV миелина