Методическая статья

Определение, если ДНК окрашивали цианиновые краска может быть переваривается с энзимами ограничения

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57141

⸱

2 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

В этой статье

Краткое содержание

Пятнать молекул ДНК для микроскопии флуоресцирования позволяет ученым, чтобы просмотреть их во время эксперимента. В методе, представленные здесь молекулы ДНК предварительно окрашенные с флуоресцентными красителями и переваривается Метилировани и не метилирования чувствительные энзимы ограничения.

Аннотация

Визуализация ДНК для микроскопии флуоресцирования использует различные красители например цианиновые красители. Эти красители используются благодаря их высоким сродством и чувствительности для ДНК. Для того чтобы определить если молекулы ДНК, полная длина после завершения эксперимента, чтобы определить если окрашенных молекул являются полная длина, переваривание ДНК с энзимами ограничения требуется метод. Однако окрашенных ДНК может тормозить ферментов, поэтому метод, чтобы определить, какие ферменты, можно было бы использовать для флюрохром окрашенных ДНК. В этом методе ДНК запачкается с цианиновые красителя на ночь для красителя и ДНК, чтобы сбалансировать. Далее, окрашенных ДНК переваривается с энзима ограничения, загружается в гель и electrophoresed. Экспериментальной группы ДНК дайджест по сравнению с в silico дайджест для определения активности энзима ограничения. Если есть такое же количество полос, как и ожидалось, реакция является полной. Больше полосы, чем ожидалось, указать частичный пищеварение и меньше полосы указывают неполное переваривание. Преимуществом этого метода является его простота, и он использует оборудование, что ученый потребуется для энзима ограничения пробирного и электрофорез геля. Ограничение этого метода является то, что ферменты для большинства ученых коммерчески доступных ферментов; Однако могут использоваться любые энзимов ограничения.

Введение

Тото серии (Тото-1, YOYO-1, Попо-1, БОБО-1, Тото-3, YOYO-3, Попо-3 и БОБО-3; Таблица 1) используется в самых разнообразных экспериментов, где визуализация ДНК является требуется1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. семьи димер цианиновые широко используется из-за их квантовый выход, чувствительность и высокое сродство для ДНК молекул18,19,20. Димер цианиновые красители имеют большой избирательности для двойной мель ДНК и когда интеркалированного 100 до 1000 раз увеличение флуоресценции21. Пиридиния красители (YOYO-1, Тото-1, YOYO-3 и Тото-3) имеют короче длина волны излучения, чем их quinolium краситель (БОБО-1, Попо-1, БОБО-3 и Попо-3) коллегами (Таблица 1)22. Кроме того, высокий квантовый выход для цианиновые димеры интеркалированного в ДНК (0,2 - 0,6)22. Однако с помощью фермента определить профиль метилирования ДНК молекула2 или растянуть23 молекулы ДНК, уже окрашивали Люминесцентную краску требует метод для определения, какие ферменты будет переваривать окрашенных ДНК. Для этого метода может использоваться любой тип красителя, который встраивается в ДНК или каких-либо фермента, который дает ощутимый характер субстрат ДНК.

Мэн et al. сначала определяется скорость переваривания prestained ДНК через гель-электрофорез с использованием целого ряда различных красителей24. Maschmann et al. вникал в глубже взглянуть на Тото семьи красителей. Как определяется уровень пищеварение окрашенных ДНК, чтобы увидеть, если ДНК, окрашенных краской заданного могут быть осмыслены с энзима ограничения25. Другие методы изучения воздействия привязки красителей, интеркалированного с ДНК, используя Оптический пинцет26 или27ЯМР. Либо метод требует специализированного оборудования; принимается во внимание, что этот метод позволяет оборудование, большинство лабораторий молекулярной биологии должны определить, если краска вмешивается Пищеварение энзима ограничения.

Кроме того в других методах, чтобы измерить длину данной молекулы, оптические сопоставления удлиненные неокрашенных молекул ДНК на поверхности и переваривается ДНК для определения участка и размер фрагментов. Было показано интеркаляции краска увеличить длину контура дневно окрашенных молекул ДНК и в зависимости от используемых красителях, контур колея различные21. Этот метод был использован в различных геномов1,3,4,6,13,28,,2930, 31. Однако, если молекулы были предварительно окрашенные, в зависимости от краски и фермента, фермент может не иметь возможность вырезать ДНК, окрашенных краской заданного. Таким образом этот метод определяет, если ДНК, окрашенных краской заданного могут быть осмыслены с ферментом. Кроме того в зависимости от концентрации красителя и краска использована, подвижности ДНК полос в геле перенесет более медленно, чем родной ДНК из-за частичного раскручивание ДНК позвоночника чтобы освободить место для красителя для вставки между пар32 .

Однако иногда эти красители могут частично или полностью препятствовать действий некоторых энзимов ограничения7,24. Это считается вследствие структурных изменений в ДНК, вызванные вложение Люминесцентную краску, которая может помешать признавая ее определенной последовательности фермента. Понимание, как эти красители влияют на энзимов ограничения может помочь в экспериментах, где требуется метилирования профиль или растягивать окрашенных ДНК.

В нашем методе ДНК был окрашенных с флюрохром интерес и переваривается с энзима ограничения. Затем был electrophoresed ДНК на геле, образы, и была измерена скорость пищеварения энзима ограничения. Энзимы ограничения были выбраны на основании вырезать узор на гель. Слишком много диапазонов вызвало Перекрытие полос ДНК и слишком мало полос не дают полную картину молекулы ДНК. Есть сладкое пятно, чтобы иметь возможность определить профиль переваривается молекулы ДНК; Таким образом он будет зависеть от используемых ДНК и фермента. Преимуществом данного метода является его простота; Он только требует оборудования, используемого в ограничение пищеварение и гель-электрофорез.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка красителей, буферов и геля агарозы

  1. Подготовьте следующие решения для окрашивания ДНК или пищеварения окрашенных ДНК.
    1. Подготовка 1 x TE (Tris-HCl и Этилендиаминтетрауксусная кислота; ЭДТА) буфер с помощью 10 мм трис-HCl и 1 мм ЭДТА в мерный цилиндр или объемные колбу. Хранить при комнатной температуре (18-25 ° C).
    2. Сделать аликвоты каждого красителя: Тото-1, YOYO-1, Попо-1, БОБО-1, Тото-3, YOYO-3, Попо-3, БОБО-3 (таблица 1). Пипетка 4 мкл концентрированного красителя 1 мм в темный янтарь или черные 1,5 мл трубки и 36 мкл 1 x TE, смешать с помощью пипетки; Эта концентрация делает раствор красителя 100 мкм (всего 40 мкл). Выполните этот шаг для каждой краски. Хранить при 4 ° C.
      Примечание: Не подвергайте краситель для освещения для предотвращения деградации красителя или Фотообесцвечивание.
    3. Подготовка буфера 1 с использованием 10 мм бис-трис-пропан-HCl 10 мм MgCl2и 100 мкг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА). Подготовка буфера с использованием 50 мм NaCl, 2 10 мм трис-HCl, MgCl 10 мм2и 100 мкг/мл BSA. Подготовка буфера 3 с использованием 50 мм ацетат калия, 20 мм трис ацетат, ацетат магния 10 мм и 100 мкг/мл BSA. Каждый фермент требует один из этих конкретных буферов, чтобы функционировать.
  2. Подготовьте следующие решения для электрофореза геля.
    1. Сделать 6 x загрузки красителя, объединяя 0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксилола cyanol, 15% Ficoll в dH2O. хранить при комнатной температуре.
    2. Чтобы сделать 0,7% агарозном гель, весят, 0,07 г высокой гелеобразующего температуры (HGT) агарозы в колбу Эрленмейера, добавить 100 мл 1 x TAE буфера и наложить перевернутый стакан на колбу.
      1. Решение на горячей плите тепло, пока пузырьки начинают формироваться на дне колбы и плыть к верхней.
      2. Удаление решения из поджарки, остудите раствор, пока колбу могут быть затронуты с голой рукой и затем налить гель в 24,5 x 21,8 см геля плесень с гребнем гель для создания скважин.
      3. Удалить пузыри, вблизи гребень или на поверхности геля, суя их с кончиком пипетки и позволяют гель для закрепления для по крайней мере 15 минут. Это может храниться в холодильнике (4 ° C), завернутый в полиэтиленовую пленку за 1 неделю для предотвращения высыхания геля или загрязнения. Для получения дополнительной информации о том, как запустить гель относятся к ли и др. 33 .
        Примечание: Используйте гель гребень с 30 отдельных скважин. Каждый должен быть 4,5 мм с глубиной 2 мм. Высота скважины будет зависеть количество геля, выливают в поле.
    3. Подготовка 1 x TAE (Tris - ацетат - ЭДТА) буфера, используя 40 трис-HCl, 20 мм уксусной кислоты и 1 мм ЭДТА. Хранить при комнатной температуре (18-25 ° C).

2. Подготовка окрашенных ДНК

  1. Пятно лямбда ДНК (300-800 ng) с использованием различных аликвоты красителей. Каждая краска (таблица 1) будет иметь шесть различных концентраций, тестирование, для в общей сложности 48 реакций за энзима ограничения. Ниже описывается процесс набора до 1 реакции (рис. 1).
    1. Разбавить лямбда ДНК с помощью 1 x TE до 100 нг / мкл. хранить в 4 ° C. Сделайте раствор общим объемом 300 мкл.
    2. Пятно unmethylated лямбда ДНК. Для каждой группы, ожидаемые от дайджест оцените 75-100 нг/полосами. Добавьте необходимое количество краски для получения концентрации 1,9 мкм, 3.8 мкм, 19,4 мкм, 32,2 мкм, 48.3 мкм, 63,5 мкм / 100 нг ДНК.
    3. Инкубируйте на ночь (15-18 ч) при 4 ° C.
    4. Оставьте одну реакцию незапятнанное действовать в качестве управления25.
      Примечание: Используйте unmethylated дна для переваривания реакции. Энзимы метилирования чувствительные нельзя вырезать метилированной регионов в ДНК и даст появление неполное переваривание.

3. Подготовка Assay энзима ограничения

  1. Дайджест окрашенных ДНК энзима ограничения, чтобы определить, если это фермент может переварить prestained ДНК (рис. 1).
    1. На следующий день, добавить 20 U энзима ограничения, 3 мкл соответствующего буфера (таблица 2) и дистиллированной, газобетона и фильтрованной воды в общей сложности 30 мкл. Для каждой реакции энзима выберите буфер с наивысшей эффективности резки, который можно найти на веб-сайте изготовителя.
    2. Место реакции в водяной бане при температуре оптимального ферментативной активности, перечисленные в таблице 2 для 6 ферментов, используемых в Maschmann и др., для 2-4 ч (Таблица 2)25.
    3. Остановите реакции, добавив 2 мкл 0,5 М ЭДТА рН 8.0.

4. Electroeluting окрашенных ДНК в агарозном геле

  1. Удаление стороны от плесени гель 24,5 x 21,8 см (шаг 1.2.2) и поместите гель в поле электрофореза геля. Залейте 2,5 Л 1 x TAE буфера в поле. Осторожно удалите гребень гель из геля, поэтому колодцы являются доступными33.
  2. Пипетка реакции энзима ограничения на пластиковой пленкой и объединить каждой реакции с 6 x загрузки красителя. Для каждого решения реакции 1 мкл 6 x загрузки красителя на 5-6 мкл раствора (1 x) ДНК. После этого Пипетка реакции (содержащий краситель загрузки, < 18 мкл) в скважины.
  3. Смешайте 1 мкл лестницы 1 КБ, 9 мкл TE 1 x и 2 мкл 6 x загрузки красителя. Загрузите решение в скважины, которые фланге другие решения.
  4. Покрывают поле гель с темно синий или черный бумаги или ткани. Подключите поле гель к источнику питания, установите блок питания 30 V и запустить его на ночь (15-20 ч). Выключите свет во время геля, чтобы предотвратить photocleavage помечены ДНК.
  5. На следующее утро Выключите источник питания. Принимать гель с помощью лоток и перевести его в контейнер с 45 бромид ethidium мкл и 1 L 1 x TAE буфера. Храните контейнер при комнатной температуре в темноте или покрытия в фольгу для предотвращения воздействия света. Пусть гель пятно для по крайней мере 45 минут при комнатной температуре.
    Предупреждение: Используйте бромид ethidium с перчатками и носить защитные очки. При очистки вне контейнера, содержащего решение бромид ethidium и выбрасывая гель, проконсультируйтесь с вашей государств удаления руководящие принципы для определения как бороться с бромид ethidium используется; Кроме того другие пятна могут быть использованы вместо бромид ethidium.

5. изображения геля агарозы

  1. Поместите гель поверх синего света transilluminator, который излучает максимальной светоотдачи между 400-500 Нм. Возьмите фотографии с камеры, прикрепленной к станции.
    Предупреждение: Не забудьте использовать крышку для осветителя и наденьте защитные очки до поворота на источник света.
    Примечание: Этот шаг может также выполнить с помощью любого источника УФ света или стандартного геля сканера.
  2. Посмотреть фотографии в ImageJ перетаскиванием файла в строке состояния ImageJ и изображение будет всплывающее.
  3. Определите скорость переваривания для эксперимента, сравнивая полос на гель гель ожидаемых в silico шаблон. Чтобы определить скорость переваривания, количество экспериментальных групп делится на ожидаемое количество ДНК полосы24,25. Если экспериментальной переваривается шаблон группы ДНК имеет ожидаемый шаблон, пищеварение ставка составляет 1. Если шаблон имеет больше фрагментов, чем ожидалось, уровень пищеварение больше 1. Если шаблон имеет меньше фрагменты, чем ожидалось, уровень пищеварения является меньше, чем один.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того чтобы определить если интеркалирующего краска будет влиять на энзима ограничения переваривания ДНК, правильный порядок шагов должно быть после (рис. 1). После того, как окрашенные и переваривается с данного фермента ДНК Фотография геля могут быть приняты для определения числа фрагментов и их размер (рис. 2). Для того, чтобы определить эффективность фермента, общее количество ожидаемых видимых полос, деленное на количеств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того, чтобы переваривать дневно обозначенные ДНК (рис. 1), требуется ряд шагов. Во-первых ДНК запачкается с флюрохром на ночь. ДНК может быть инкубировали с цианиновые димеры на более короткий период времени; Однако Carlsson et al. обнаружил, что ДНК создан двойной полосы для каждого размера ДНК из-за неполной окрашивание20. Чтобы исправить это, ДНК может быть запятнано на ночь, чтобы предотвратить двойной полосы. Это является важным шаго...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование финансировалось национальным институтом для общей медицинской науки (NIGMS) (5605100122001), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ), а также Университет штата Небраска в Кирни (UNK) летние студенческие исследования программы (SSRP) и UNK Стипендия студентов исследований (ЕФД).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Неметилированная лямбда-ДНКNEBN3013S
YOYO-1ThermoFisher ScientificY3601
TOTO-1ThermoFisher ScientificT3600
POPO-1ThermoFisher ScientificP3580
BOBO-1ThermoFisher ScientificB3582
YOYO-3ThermoFisher ScientificY3606
TOTO-3ThermoFisher ScientificT3604
POPO-3ThermoFisher ScientificP3584
BamHINEBR0136S
PmlINEBR0532S
ScaINEBR3122S
EcoRI NEBR0101S
HindIIINEBR0104S
SmaINEBR0141S
Tris FisherBP152-1Раздражающий
EDTAFisherS316-212Токсичный
HClFisherS25358Коррозионный и раздражающий
буфер 1NEBB7201SNEB 1.1
Буфер 2NEBB7202SNEB 2.1
Буфер 3NEBB7204SNEB Cutsmart
Высокая температура гелеобразования агарозного геляLonza50041
Уксусная кислотаFisherS25118Опасный
транслюминатор синего светаDark ReaderDR196Носить правильные очки 
Бромид этидияФишера15585011канцероген; другие альтернативы – Nancy 520, Gel red и др.
Cannon EOS Rebel T3I камераCannon
Apogee Model H4Biorad1704510
Power Pac Basic Power Supply Supply1645050 
FicollFisher ScientificBP525-25
Бромофенолсиний Fisher ScientificB-392
Ксилол цианолEastmenT1579

Ссылки

  1. Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
  2. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68(2008).
  3. Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278(2007).
  4. Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
  5. Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
  6. Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
  7. Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
  8. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  9. Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
  10. Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
  11. Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
  12. Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
  13. Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25(2009).
  14. Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
  15. Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
  16. Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
  17. Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101(2005).
  18. Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
  19. Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
  20. Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
  22. Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
  23. Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
  24. Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
  25. Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
  26. Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304(2015).
  27. Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
  28. Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644(2015).
  29. Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505(2013).
  30. Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913(2012).
  31. Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711(2009).
  32. Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
  33. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи