Методическая статья
Пятнать молекул ДНК для микроскопии флуоресцирования позволяет ученым, чтобы просмотреть их во время эксперимента. В методе, представленные здесь молекулы ДНК предварительно окрашенные с флуоресцентными красителями и переваривается Метилировани и не метилирования чувствительные энзимы ограничения.
Визуализация ДНК для микроскопии флуоресцирования использует различные красители например цианиновые красители. Эти красители используются благодаря их высоким сродством и чувствительности для ДНК. Для того чтобы определить если молекулы ДНК, полная длина после завершения эксперимента, чтобы определить если окрашенных молекул являются полная длина, переваривание ДНК с энзимами ограничения требуется метод. Однако окрашенных ДНК может тормозить ферментов, поэтому метод, чтобы определить, какие ферменты, можно было бы использовать для флюрохром окрашенных ДНК. В этом методе ДНК запачкается с цианиновые красителя на ночь для красителя и ДНК, чтобы сбалансировать. Далее, окрашенных ДНК переваривается с энзима ограничения, загружается в гель и electrophoresed. Экспериментальной группы ДНК дайджест по сравнению с в silico дайджест для определения активности энзима ограничения. Если есть такое же количество полос, как и ожидалось, реакция является полной. Больше полосы, чем ожидалось, указать частичный пищеварение и меньше полосы указывают неполное переваривание. Преимуществом этого метода является его простота, и он использует оборудование, что ученый потребуется для энзима ограничения пробирного и электрофорез геля. Ограничение этого метода является то, что ферменты для большинства ученых коммерчески доступных ферментов; Однако могут использоваться любые энзимов ограничения.
Тото серии (Тото-1, YOYO-1, Попо-1, БОБО-1, Тото-3, YOYO-3, Попо-3 и БОБО-3; Таблица 1) используется в самых разнообразных экспериментов, где визуализация ДНК является требуется1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
1. Подготовка красителей, буферов и геля агарозы
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Для того чтобы определить если интеркалирующего краска будет влиять на энзима ограничения переваривания ДНК, правильный порядок шагов должно быть после (рис. 1). После того, как окрашенные и переваривается с данного фермента ДНК Фотография геля могут быть приняты для определения числа фрагментов и их размер (рис. 2). Для того, чтобы определить эффективность фермента, общее количество ожидаемых видимых полос, деленное на количеств.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Для того, чтобы переваривать дневно обозначенные ДНК (рис. 1), требуется ряд шагов. Во-первых ДНК запачкается с флюрохром на ночь. ДНК может быть инкубировали с цианиновые димеры на более короткий период времени; Однако Carlsson et al. обнаружил, что ДНК создан двойной полосы для каждого размера ДНК из-за неполной окрашивание20. Чтобы исправить это, ДНК может быть запятнано на ночь, чтобы предотвратить двойной полосы. Это является важным шаго.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не имеют ничего сообщать.
Это исследование финансировалось национальным институтом для общей медицинской науки (NIGMS) (5605100122001), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ), а также Университет штата Небраска в Кирни (UNK) летние студенческие исследования программы (SSRP) и UNK Стипендия студентов исследований (ЕФД).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Неметилированная лямбда-ДНК | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris Fisher | BP152-1 | Раздражающий | |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Токсичный |
| HCl | Fisher | S25358 | Коррозионный и раздражающий |
| буфер 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Буфер 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Буфер 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| Высокая температура гелеобразования агарозного геля | Lonza | 50041 | |
| Уксусная кислота | Fisher | S25118 | Опасный |
| транслюминатор синего света | Dark Reader | DR196 | Носить правильные очки |
| Бромид этидия | Фишера | 15585011 | канцероген; другие альтернативы – Nancy 520, Gel red и др. |
| Cannon EOS Rebel T3I камера | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply Supply | 1645050 | ||
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Бромофенол | синий Fisher Scientific | B-392 | |
| Ксилол цианол | Eastmen | T1579 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение