Методическая статья

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DOI:

10.3791/57146

⸱

30 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио недавно использовались как в естественных условиях система моделей для изучения времени репликации ДНК в процессе разработки. Вот подробные протоколы для использования данио рерио эмбрионов для синхронизации репликации профилей. Этот протокол может быть легко адаптирована для изучения времени репликации в мутантов, типы отдельных клеток, болезни моделей и других видов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синхронизация репликации ДНК является важной характеристикой сотовой, экспонирование существенные отношения с Структура хроматина, транскрипция и скорости мутации ДНК. Изменения в сроках репликации происходят во время разработки и в рак, но времени репликации роль играет в развитии и заболевания не известна. Данио рерио недавно были созданы как в естественных условиях модель системы для изучения времени репликации. Вот подробные протоколы для использования данио рерио для определения сроков репликации ДНК. После сортировки клеток эмбрионов и взрослых рыбок данио, могут быть построены с высоким разрешением шаблоны времени репликации ДНК генома общесистемной путем определения изменений в ДНК копировать количество путем анализа последовательности данных следующего поколения. Данио рерио модель системы позволяет для оценки изменений времени репликации, которые происходят в естественных условиях на протяжении развития и может также использоваться для оценки изменений в типы отдельных клеток, модели заболеванием или мутантных линий. Эти методы позволят исследования, изучение механизмов и детерминанты репликации сроков создания и обслуживания во время разработки, сроки репликации роль играет в мутации и tumorigenesis и последствия нарушается время репликации по развитию и болезни.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для клетки к делению успешно они должны сначала точно и добросовестно повторить их весь геном. Геном дублирования в шаблоне воспроизводимость, известный как ДНК репликации сроки программы1. Синхронизация репликации ДНК соотносится с организации хроматина, эпигенетических меток и ген выражение2,3. Изменения в сроках репликации происходят на протяжении всего развития и значительно, относящиеся к транскрипционный анализ программ и изменения знаков хроматина и организации4,5. Кроме того репликация сроков связан с мутационного частот, и изменения в сроках наблюдаются в различных видах рака6,,78. Несмотря на эти замечания механизмы и факторы репликации сроков создания и регулирования по-прежнему в основном неизвестны и роль он играет в развитии и болезнь является неопределенным. Кроме того до недавно генома репликацией времени изменения, которые происходят на протяжении всего развития позвоночных только были изучены в модели культуры клеток.

Данио рерио, данио рерио, хорошо подходят для изучения репликации сроков в vivo во время разработки, как брачные пары может принести сотни эмбрионов, которые развиваются быстро с много сходства с млекопитающих развития9, 10. Кроме того на протяжении развития данио рерио, есть изменения клеточного цикла, организации хроматина и transcriptional программы, использующие отношения с ДНК репликации времени11. Данио рерио являются также отличным генетическим модели, как они особенно поддаются манипуляции трансгенез, мутагенеза и целевых мутации, и генетические экраны определили многих генов, необходимых для развития позвоночных12. Таким образом данио рерио может использоваться для идентификации генов, участвующих в репликации сроков создания и обслуживания и наблюдать последствия дерегулирования времени репликации на позвоночных развития. Трансгенные линии может также использоваться для оценки времени репликации из типов клеток отдельных, изолированных в различные области развития timepoints, или в условиях заболевания. Важно отметить, что существуют различные модели данио рерио болезней человека, который может использоваться для изучения роли репликации сроков в болезни формирования и прогрессии9,,1314.

Недавно первый профили синхронизации репликации были получены от данио рерио, утвердив его в качестве модельной системы для изучения времени в vivo15репликации. Для этого, клетки были собраны от zebrafish эмбриона на нескольких стадиях развития и в типе ячейки, изолированных от взрослых рыбок данио. Клетки были затем сортируются по СУИМ (сортировки активирован флуоресценции клеток) на основе содержимого ДНК для изоляции населения фазы G1 и S. Используя пример G1 как элемент номер копии, скопируйте номер вариации в S-фазе населения были определены и используются для определения относительной репликации времени16. Изменения в сроках репликации можно непосредственно сравнить между различными развития образцов и типов клеток, и это было использовано для определения изменения в репликации сроков, которые происходят в естественных условиях на протяжении развития позвоночных. Этот метод предлагает несколько преимуществ над другими геномной методами, главным образом что оно не требует маркировки с тимидина аналогов или иммунопреципитации ДНК4,6.

Вот подробные протоколы к профиль ДНК генома общесистемной репликации сроков на высокого разрешения в данио рерио. Эти протоколы были использованы для определения отношения с геномных и эпигенетических функций в геноме данио рерио, а также профилировать изменения в этих отношениях, которые происходят на протяжении всего развития. Эти протоколы являются также легко адаптируется к изучать изменения в сроках репликации в мутантных штаммов данио рерио и модели заболеванием. Кроме того эти методы предоставляют основу, которая может быть расширена после изучения времени репликации в типах конкретных клеток, сортируя первый из типов индивидуальных клеток от данио рерио. Данио рерио может служить отличным в vivo модель системы для изучения времени репликации и в конечном итоге выявить биологические функции этой важной чертой эпигеномные.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные были обработаны в строгом соответствии с протоколами, утвержденных Оклахома медицинских исследований Фонда институционального животное уход и использование Комитетом.

1. Настройка взрослых рыбок данио для разведения

  1. Используйте большой когорты взрослых мужчин и женщин данио рерио одного штамма для разведения. Есть небольшие различия в генетической данио рерио даже одного штамма, использовать большой когорты чтобы убедиться, что результаты представитель генетическая изменчивость населения и не ограничивается небольшим подмножеством населения.
  2. В ночь перед эмбрионы будут собраны, место десятки взрослых разведения в разведение танков, использовать примерно равное количество мужчин и женщин. В зависимости от эксперимента используйте одну из следующих стратегий селекции.
    1. Разведение стратегия 1: место несколько данио рерио мужского и женского пола в отдельных разведения танков, отделить самцов от самок с разделителем. Если используется этот подход, установки много различных племенных танков и бассейн эмбрионы от каждого, чтобы убедиться, что биологическая изменчивость является представитель населения.
    2. Разведение стратегия 2: объединить десятки данио рерио мужского и женского пола в крупных племенных танк. Использовать эту стратегию, пока существует достаточно большое количество эмбрионов, это разумно предположить, они пришли из различных учредителей и поэтому генетически представителя населения.

2. Временный вязки - сбор, сортировка и жилье zebrafish эмбриона для экспериментов

  1. Выполнение запланированных вязки, начиная, как только свет циклов, в первой половине дня. Отменить любые эмбрионов, созданных на ночь.
  2. Разрешить рыбу разводить в мелкой воде (3-5 см) в течение 10 мин, с дном false для эмбрионов бежать через.
  3. После 10 минут собирайте эмбрионов, наливание через сито и промывки в 10 см пластины с бутылкой мыть. Бассейн, все эмбрионы собираются в той же точке времени, Марк их со временем сбора, и место немедленно в инкубаторе на 28,5 ° C.
  4. Сотни эмбрионов можно ожидать от одной брачные пары в день. Разрешить взрослых развести в 10 мин циклов до тех пор, пока количество эмбрионов полученных не менее двадцати.
  5. Примерно 1-1,5 ч после сбора, сортировка эмбрионов для удаления мертвых и неоплодотворенных эмбрионов. Чтобы отсортировать эмбрионов, удалите из инкубатора и наблюдать под микроскопом рассечения.
    1. Количество эмбрионов и место на плотность 100 эмбрионов на 10 см пластины.
    2. Добавить свежие среднего (5 мм NaCl, 0.17 мм KCl, 0,33 мм2CaCl, 0,33 мм MgSO4), E3 и вернуться в инкубаторе 28,5 ° C эмбрионов.

3. Dechorionate, deyolk и исправить zebrafish эмбриона

Примечание: Этот раздел протокола предназначен для эмбрионов до 48 h пост оплодотворение (hpf). Существует не нужно удалять chorions эмбрионов на более поздних стадиях развития (после 48 hpf), как они часто естественно упасть. Нет необходимости deyolk или удалить chorions рыбы старше 5 дней после оплодотворения (dpf).

  1. Когда эмбрионы достигают желаемого развития возраста, убедитесь в надлежащей стадии развития морфологически под микроскопом света согласно «Стадий эмбрионального развития Zebrafish»17.
  2. Передача до 1500 поставил эмбрионов до 15 мл Конические трубки и промыть несколько раз с E3.
    1. Добавить 1 мл E3 и 20 мкл раствора Проназа (30 мг/мл) на каждые 100 эмбрионов и слегка взболтать. До 1500 эмбрионы могут быть dechorionated в одной трубке с 15 мл E3.
    2. Положите трубку на бок и организовать эмбрионов ровным слоем для обеспечения максимальной поверхности соотношение объема. Аккуратно агитируйте трубки, каждые 2-3 мин до всех chorions упали офф эмбрионов. Общая dechorionation время будет варьироваться в зависимости от активности Проназа.
  3. Удалить супернатант и осторожно промойте эмбрионы 3 раза с 10 мл E3. Место эмбрионов на льду для оставшейся части этого раздела протокола.
  4. Удаление E3 и мыть эмбрионов с буфером свежеприготовленные ледяной deyolking (0,5 x раствор Рингера Гинзбург рыбы, без кальция: 55 мм NaCl, 1.8 мм KCl, 1,25 мм NaHCO3).
    1. Добавьте 1 mL ледяной deyolking буфера до 500 эмбрионов.
    2. С помощью P1000, нежно Пипетка эмбрионов вверх и вниз 5 - 10 раз для нарушить желточного мешка.
    3. Передача 1 мл 1,5 мл отцентрифугировать и центрифуги на 4 ° C и 500 x g 5 мин.
  5. Удалите супернатант и мыть лепешка с 1 мл ледяной ПБС (фосфатный буфер, pH 7.0), чтобы удалить раствор Рингера. Центрифуга на 4 ° C и 500 g x 5 мин.
  6. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в 1 мл ПБС. Место труб на льду.
  7. Добавьте 3 мл ледяной этанола (EtOH) 15 мл Конические трубки. Вихревой трубка EtOH мягко на низкое.
    1. Аккуратно с помощью P1000, медленно (1 капля в секунду) капельного zebrafish эмбриона суспензию клеток в EtOH во время vortexing.
    2. Добавить в общей сложности 1 мл суспензии клеток эмбриона, для окончательной фиксации решения 75% EtOH.
  8. После 1 мл ячейки подвеска был добавлен, нежно трубки вихрем перемешать и место при-20 ° C для по крайней мере 1 час. Рекомендуется разместить труб на их стороне для обеспечения максимальной поверхности соотношение объема и уменьшить количество эмбрионов и клетки, которые склеиваются. Хранить клетки эмбриона при-20 ° C на 2-3 недели.

4. окрашивание ДНК и СУИМ, сортировка эмбрионов

Примечание: Этот раздел протокола предназначен для эмбрионов на 1 dpf.

  1. Удаление EtOH Исправлена зародыша клетки от-20 ° C и центрифуги на 1500 x g 4 ° C за 5 мин.
    1. Место труб на льду и тщательно удалить супернатант. С помощью P1000, нежно ресуспензируйте клеток в 1 мл свежеприготовленные холодной PBS-BSA (ПБС, альбумина bovine сыворотки 1%).
    2. Центрифуга клетки на 4 ° C и 1500 g x 5 мин и место на льду.
  2. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в пропидий йодидом (PI) окрашивание раствора (PBS PI, 100 мкг/мл РНКазы A, 50 мкг/мл, pH 7.0), используя 200 мкл на каждые 1000 эмбрионов.
    1. Позволяют клеткам инкубировать в растворе PI для 30 минут на льду, аккуратно смешивая каждые 5 мин.
    2. Место стрейнер клеток нейлон 40 мкм на 50 мл конические на льду. Аккуратно Пипетка клетки перемешивают и процеживают через сетку.
      Примечание: Если несколько трубок эмбрионов от же timepoint были собраны в разделе 3 протокола, объединить эти эмбрионы на данный момент так, что они все сортируются вместе.
    3. С помощью плоского внутри конце поршень шприца, аккуратно сорвать любые оставшиеся сгустки ячеек сетки.
    4. Промойте клетки через фильтр с 500 мкл холодной PBS-BSA на каждые 1000 эмбрионов.
    5. Поместите сетку 40 µm 15 мл конические на льду и фильтрации суспензии клеток с 50 мл Конические трубки во второй раз в 15 мл.
  3. Используя соответствующую ячейку Сортировка инструмент, установите лазерный возбуждения для обнаружения 561 Нм и выбросов до 610/20 для обнаружения пропидий йодидом.
    1. Смесь 15 мл окрашенных клеток кратко vortexing и место в инструмент при 4 ° C.
    2. Запустите клетки на медленный поток оценить, идеально 1.0 мл/мин, с тем чтобы получить профиль чистой клеточного цикла и избегать смешивания G1 или G2/M клетки с S фазе населения.
    3. Во-первых, ворота для КФН-A-x SSC-(район вперед разброс по точечной Сиде) для удаления мусора (рис. 1A).
      Примечание: Клеток эмбрионов различных размеров в зависимости от стадии и ячейки. Фильтр нейтральной плотности (ND) может потребоваться переключаться между 1.0 и 1.5 в зависимости от размера клетки присутствуют. Ворота большой площади для большинства клеток сбора и удаления мусора.
    4. Во-вторых, ворота для SSC-области (SSC-A), Пи области (Пи-A), чтобы удалить мусор и ячейки Дуплеты (Рисунок 1B).
    5. В-третьих, ворота для SSC-A от SSC-W (ширина) чтобы удалить любые оставшиеся ячейки Дуплеты (рис. 1 c).
  4. Отображение условного населения на гистограмму с ячейки номер (количество) на оси y и пропидий йодидом области (PI-A) на оси x. Для 24 hpf эмбрионов это должно дать профиль стереотипных клеточного цикла, как показано на рисунке 1 d.
    1. Чтобы отсортировать населения фазы S, установите ворота с правой стороны пика G1 на левой стороне G2 пик, включая лишь минимальное количество населения G1 и G2. Для 24 hpf эмбрионов, это будет обычно составляют около 10-15% из населенности закрытого (см. рис. 1 d).
    2. Чтобы отсортировать G1 населения, установите ворота на левой стороне G1 пик, не пройти в верхней части пика. Отрегулируйте ширину ворот G1 как можно более узким (см. рис. 1 d).
    3. Обратно, ворота G1 и S фазу населения для обеспечения надлежащего первоначальный шлюзовые (Рисунок 1E).
  5. Сортировка G1 и S фазу населения в 15 мл конические трубы с 3 мл PBS-BSA. Цель должна заключаться в получить между 500 000 и 1 миллион или более сортировки клеток на фракции (G1 и S-фаза).
  6. После завершения сортировки центрифуги трубки на 1500 x g и 4 ° C на 10 мин.
    Примечание: Мелкоклеточного Пелле будет трудно понять, и важно избежать нарушения его, так что используйте предпочтительно размахивая ведро ротора через фиксированный угол ротора.
  7. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 1 мл раствора 1 x PBS. Клетки перехода к 1,5 мл отцентрифугировать и центрифуги на 6000 x g и 4 ° C за 5 мин.
  8. Тщательно удалить все жидкости из трубки и заморозить сухих гранул при-20 ° C. Храните таблетки при-20 ° C на 2-3 недели.

5. ДНК изоляции, RNase лечение и очищение дна

  1. Удалите ячейку Пелле от-20 ° C и место на льду.
    1. 400 мкл буфера SDS (50 мм трис-HCl (рН 8,0), 10 мм ЭДТА, 1 M NaCl, 0,5% SDS) гранул и Ресуспензируйте.
    2. Добавить протеиназы K в конечной концентрации 0,2 мг/мл и перемешать кратко, vortexing.
    3. Проинкубируйте образцы на 56 ° C 2 h, вихревой каждые 15 мин.
  2. После 2 ч выполните извлечение фенола хлороформ, добавив 400 мкл фенол хлороформ (фенол: хлороформ: изоамилового спирта 25:24:1, насыщенных с 10 мм трис, рН 8,0, 1 мм ЭДТА).
    1. Вортекс для образца 20 s и центрифуги на 16000 x g 5 мин для разделения фаз.
    2. Осторожно удалите верхний водной фазе (400 мкл) и передачи в 1,5 мл трубку.
  3. Выполните EtOH осадков, добавив 40 мкл ацетат натрия 3M (рН 5.2), 2 мкл гликогена и 1 мл EtOH.
    1. Вихрь тщательно перемешать и поставить на 20 ° C ночь до осадок ДНК. Образец можно ускорили также в-80 ° C или на сухой лед за 1 ч.
    2. Центрифуга образца при 4 ° C и 16 000 x g за 30 мин до Пелле ДНК.
    3. Супернатант и мыть Пелле отменить с 1 мл 70% EtOH. Центрифуги на 4 ° C и 16 000 x g за 5 мин.
    4. Выбросите супернатанта и воздушно-сухой Пелле при комнатной температуре на 2-3 мин.
  4. Растворяют гранулы в 96 мкл газобетона воды и мкл 4 РНКазы A (2 мг/мл).
    1. Смесь хорошо, vortexing и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
  5. Выполните извлечение фенола хлороформ, добавив 100 мкл фенол хлороформ и Следующая процедура в шагах 5.2.1 - 5.2.2.
  6. Выполните EtOH осадков, добавив 10 мкл ацетат натрия 3M, 1 мкл гликогена и 250 мкл EtOH и после процедуры в шагах 5.3.1 - 5.3.5.
  7. Ресуспензируйте Пелле в 60 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 10 мм ЭДТА (pH8.0)) и определения концентрации ДНК с помощью количественного метода на основе флуоресценции. Хранить ДНК при-20 ° C.
    Примечание: Важно количественно с помощью привязки на основе флуоресценции ДНК красители, или других средств, более надежными, чем УФ спектрометр-методы на основе ДНК.

6. Подготовка библиотек ДНК и следующего поколения последовательности

Примечание: G1 копии номер эталонного образца для каждого биологического источника требуется для каждого запуска последовательности (т.е. WT, мутант, трансгенных, клеточная линия, и т.д.). Сравните все образцы фазы S из того же источника биологического в же последовательность запуска в одной и той же ссылке G1. Запустите по крайней мере два биологических реплицирует каждого образца для обеспечения согласованности между выборками.

  1. Разбавьте 1 мкг ДНК в окончательный объем 50 мкл и передачу специализированных трубки для sonication.
  2. Сдвига геномной ДНК для целевого 250-300 ВР в целенаправленной ultrasonicator, согласно спецификации изготовителя и протокол.
  3. Проверьте качество и размер стриженый геномной ДНК с помощью автоматизированных электрофорез машины, согласно спецификации изготовителя и протокол. Убедитесь, есть большой пик ~ 250-300 bp для стриженый геномной ДНК.
  4. Подготовьте последовательности библиотеки с помощью комплекта подготовки библиотеки ДНК с мультиплексной oligos для виртуализации на платформе Illumina, по словам производителя протокол.
  5. Проверьте качество приготовительная библиотеки с помощью автоматизированных электрофорез машины, по словам производителя протокол. Убедитесь, есть большой пик ~ 400-450 bp, и есть минимальный пиков Димеры праймера (80-85 bp) и адаптер димеров (~ 120 bp).
  6. Количественно библиотек с помощью комплекта количественного определения библиотеки ДНК для секвенирования ДНК следующего поколения, по словам производителя протокол.
  7. Разбавить 15 мкл библиотеки к концентрации 5 Нм и комбинировать мультиплексированных библиотек, необходимых для достижения желаемого однозначно сопоставления читать рассчитывает на сэмпл.
    Примечание: Количество однозначно сопоставления чтений на сэмпл будет определять резолюции. Использование как 5 миллионов сопоставлены читает для оценки времени репликации для данио рерио генома. Рекомендуется начать с чтения 10-20 млн.
  8. Выполните в паре конец 100 bp всей ДНК генома образцов на платформы виртуализации нового поколения, согласно инструкциям производителя.

7. Анализ последовательности данных

Примечание: Инструкции в этом разделе предназначены в качестве ориентира для анализа. Используйте дополнительные методы для выравнивания последовательности, фильтрацию, обработку, и т.д. Этот раздел протокола будет заниматься предпочтительным методом анализа в этой работе. Если используются дополнительные методы, настройте параметры и функции с учетом этих целей. Ниже команды вводятся в Ubutnu или Mac терминал, с установлены соответствующие пакеты.

  1. Получить самые последние версии данио рерио генома (danRer10, по состоянию на когда был написан этот протокол) от браузера геноме UCSC, используя следующие команды:
    Wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
    1. Распакуйте файл fa.gz с помощью следующей команды:
      gunzip danRer10.fa.gz
    2. Выравнивание данных секвенирования генома используя АДЖ мем, используя следующие команды:
      ВСБ мем -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
  2. Преобразуйте файл .sam .bam файл samtools с помощью следующей команды:
    SAMtools Просмотр -bS input.sam > output.bam
    1. Сортировка файлов соответствие последовательности, samtools с помощью следующей команды:
      SAMtools сорт output.bam > output_sorted.bam
    2. Индекс .bam файл samtools с помощью следующей команды:
      SAMtools индекс output.bam
  3. Марк PCR дублирует с Пикар, используя следующие команды:
    Java-Xmx2g-банку picard.jar MarkDuplicates \
    INPUT=input.BAM
    Output=Output.BAM
    REMOVE_DUPLICATES = false
    METRICS_FILE=output_metrics.txt
  4. Создайте файлы текста (.txt) операций чтения для каждой хромосомы, используя следующую команду:
    я в {1,25}; делать CHROM = «chr» $i; Эхо $CHROM; SAMtools Просмотр input.bam $CHROM | вырезать -f 2,4,5,7,8,9 > .txt$ {i} readsChr; Договорились
    Примечание: Столбцы в файле .txt, флаг, местоположение, mapQ, пара ЦПЧ, пара местоположение и размер фрагмента, соответственно.
  5. Чтение файлов .txt в Matlab (или любое другое подобное программное обеспечение), используя функцию textscan.
    1. Фильтр из низких сопоставления качества читает, установив порог mapQ 30.
    2. Удаление читает с флагами не первичного выравнивания, ПЦР дубликаты или пара карт к другой хромосоме.
    3. Фильтр из любой читает с их пары за пороговое расстояние 2000 года bp.
    4. Оцените статистику результате гласит, чтобы определить количество чтения статистики, охват, размер вставки и качества (рис. 2).
  6. Определите чтения освещение в 100 bp фиксированной windows для каждого образца, подсчитывая количество считываний в 100 bp промежутки по всей длине каждой хромосомы.
    1. Вычислить медиану считывания счетчика для всех окон.
    2. Фильтр из регионов высокого охвата путем удаления windows больше, чем 5 стандартных отклонений от медианы.
  7. Определите регионы для анализа в G1 эталонных образцов путем нахождения сегментов вдоль каждой хромосомы с 200 чтений с помощью раздвижных окон.
    1. Определите чтения глубину в каждой пробе фазы S подсчитывая количество считываний фазы S в windows 200-чтения count, определенных для сопровождающих G1 ссылку.
  8. Гладкие необработанных данных, используя функцию csaps в программном обеспечении, с коэффициента интерполяции (p) 10-16.
  9. Нормализовать сглаживаемые данные для z скор с 0 среднее и стандартное отклонение 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование опубликованных репликации данных об использовании времени, представитель репликации синхронизация профилей и меры контроля качества предоставляются15. Первые шаги обработки включают выравнивание данных секвенирования генома, расчет чтения Длина и статистика покрытия генома и фильтрации низкого качества, непарные, и повторяющиеся читает ПЦР. Статистические данные чтения для типичного данио рерио последовательности образца приведены на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио предоставляют новый и уникальный в естественных условиях модельной системы для изучения времени репликации ДНК. Когда приурочен вязки выполняются как подробно этот экспериментальный протокол, тысячи эмбрионы могут быть собраны в один день для экспериментов. Эти эмбрионы синхронно развиваться через точно приурочен и отчетливо характеризуется этапы развития. Данио рерио можно легко и точно поставленный морфологии, используя стереомикроскопом, как zebrafish эмбриона развивать внешне и оптически ясно. Эт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здравоохранения посредством грантов 5P20GM103636-02 (включая поддержку основной поток цитометрии) и 1R01GM121703, а также награды от Оклахома центр для взрослых стволовых клеток Исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaClFisher ScientificBP358-10
KClFisher ScientificP217-500
CaCl2Fisher ScientificC79-500
MgSO4EMD MilliporeMMX00701
NaHCO3Fisher ScientificBP328-500
ПроназыСигма10165921001раствор протеазы
Фосфатный буферный раствор (PBS)SigmaD1408
Этанол (EtOH)KOPTECV1016
Бычий сывороточный альбумин (БСА)SigmaA9647-100G
Йодид пропидия (PI)InvitrogenP3566
Tris-HClFisher ScientificBP153-500
EDTASigmaE9844
SDSSanta Cruzsc-24950
Протеиназа KNEBP8107S
Фенол:ХлороформSigmaP3803-100ML
ацетат натрияJ.T.Baker3470
ГликогенAmbionAM9510
РНКаза АThermo ScientificEN0531
Quanit-iTInvitrogenQ33130Реагенты для количественного определения ДНК на основе флуоресценции
Covaris AFA microTUBECovaris520045специализированная трубка для ультразвуковой обработки
Covaris E220 SonicatorCovarisE220сфокусированный ультразвуковой
Agilent 4200 TapestationAgilentG2991AAавтоматизированный аппарат для электрофореза
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582Реагенты для автоматизированного аппарата для электрофореза
NEBNext Ultra Набор для подготовки библиотеки ДНК для IlluminaNEB Cat#E7370LНабор для подготовки библиотеки ДНК
NEBNext Multiplex Oligos Kit для Illumina (Набор индексных праймеров 1)NEBCat#E7335Sнабор для подготовки
мультиплексных олигон для библиотеки ДНКNEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)NEBCat#E7500Sдополнительные мультиплексные олигоноты для подготовки библиотеки
ДНК NEBNext Library Quant Kit for IlluminaNEBE7630Lнабор для количественного определения
Agencourt AMPure XP бусиныBeckman CoulterA63882магнитные бусины
Illumina HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501Платформа для секвенирования ДНК нового поколения
40 & микро; m Falcon Nylon Cell SitherFisher Scientific08-771-1
VWR Одноразовая чашка Петри 100 x 25 ммVWR89107-632
6,0 мл Шприц для Nichiryo Model 8100VWR89078-446
Posi-Click Tubes, 1,7 мл, натуральный цветDenville ScientificC2170 (1001002)Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Бутылки для мытьяVWR16650-022Полиэтилен низкой плотности, широкогорловое
сетчатое фильтрVWR470092-4406,9 см, мелкоячеистый
Корсинг бакAquaneeringZHCT100индивидуальный аквариум для разведения
iSpawnTechniplastN/Aбольшой аквариум для разведения
FACSAria IIBD biosciencesN/Aмашина для сортировки клеток
Wild M5a стеромикроскопWild HeerbruggN/Aпрепарирующий микроскоп
Qubit 3 FluorometerThermo ScientificQ33216количественный флуоресцентный метод определения концентрации ДНК
MatlabMathworksверсия 2017a
Matlab Statistics ToolboxMathworksверсия 11.1
Matlab Curve Fitting ToolboxMathworksверсия 3.5.5
аппарат библиотеки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  2. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  3. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
  4. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).
  5. Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
  6. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
  7. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
  8. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  9. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  10. Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
  11. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  14. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  15. Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
  16. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Zebrafish EmbryosCell SortingNext Generation SequencingPropidium Iodide StainingFlow CytometryGenome wide AnalysisReplication Fork InitiationEmbryonic Development StagesSingle cell Suspension

Похожие статьи