Method Article

Визуализация и количественная оценка потенциала дифференциация адипогенном мезенхимальных клеток с маркером конкретных Lineage

DOI:

10.3791/57153

⸱

March 31st, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, The University of Auckland, 2Research School of Biology, The Australian National University, 3Auckland Cancer Society Research Centre, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 4Department of Plastic Surgery, Counties Manukau District Health Board, 5Department of Surgery, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 6Biomedical Imaging Research Unit, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 7Maurice Wilkins Centre, The University of Auckland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные методы оценки дифференциации адипогенном дешевой и простой в использовании, но не являются специфическими для изменения в экспрессии генов. Мы разработали assay для количественного определения дифференцировку мезенхимальных клеток в зрелых адипоциты, с помощью маркера конкретной линии. Этот assay имеет различных приложений через фундаментальные исследования и клинической медицины.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько красителей в настоящее время доступны для использования в обнаружении дифференцировку мезенхимальных клеток в адипоцитов. Красители, например нефть красный O, дешевый, простой в использовании и широко используемых в лабораториях анализа адипогенном потенциала мезенхимальных клеток. Однако они не являются специфическими для изменения в транскрипции гена. Мы разработали ген специфического дифференциация пробирного анализировать свою судьбу, выключенном мезенхимальных клеток в адипогенном линии. Иммуно маркировки против жирных кислот связывания белка-4 (FABP4), маркер линии конкретных адипогенном дифференциации, включенной визуализации и количественного определения дифференцированных клеток. Способность определить количественно потенциал дифференциация адипогенном мезенхимальных клеток в формате 96 хорошо Гонав имеет перспективные последствия для ряда приложений. Сотни клинических исследований связаны с использованием взрослых мезенхимальных стромальных клеток и в настоящее время трудно соотнести терапевтических результатов в пределах, так и особенно между такие клинические испытания. Этот простой высок объём FABP4 assay обеспечивает количественного анализа для оценки потенциала дифференцировки клеток пациента производные и является надежным инструментом для сравнения различных методов изоляции и расширения. Это особенно важно с учетом растущего признания гетерогенности клеток, администрируемого пациентам в мезенхимальных клеток продуктов. Assay также имеет потенциальную полезность скрининга наркотиков высокой пропускной способности, особенно в заранее диабет и ожирение исследований.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из ключевых требований, установленных международным обществом клеточной терапии (ИКСТ) для определения Multipotent с экстрактами мезенхимальных стромальных клеток является, что клетки должны иметь возможность дифференцировать в адипогенном, остеогенные и хондрогенном линий 1. традиционные методы измерения дифференцировке в эти три полагаются на обнаружение высокомолекулярных продуктов с использованием химических красителей1. Красителей, таких как масло красный O (пятна тучные капельки в клетках, которые подверглись adipogenesis), дешевые и простые в использовании; Однако они не смогли обнаружить конкретные изменения в экспрессии генов, которые происходят, когда Мезенхимальные клетки дифференцироваться в каждой соответствующей lineage2. Здесь мы разработали пробирного дифференциация, которая количественное выражение протеина для маркера линии конкретных адипогенном, жирные кислоты связывания белка-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 был первоначально обнаружен в мышиных 3T3-L1 адипоцитов3 и позже было обнаружено выражаться в6человека подкожной жировой клетчатки. Это цитозольной белок, который действует как сопровождающий направлять жирных кислот усвоение клетками и участвует в процессе липолиза4.

Используется для дифференциации assays клетки-предшественники были жировой производных Мезенхимальные стромальные клетки (ИСС)7,8. ИСС разделяют многие свойства с костного мозга, полученных мезенхимальных стволовых клеток (БМ-МСК), население крупных мезенхимальных стволовых клеток взрослых8,9. ИСС предлагают несколько преимуществ над BM-MSCs в клинического применения, как большую доходность клеток могут быть изолированы от более доступными ткани источников8,9. Изолированных клеток населения должен соответствовать определенным критериям, чтобы быть определена как ИСС. Во-первых они должны показать приверженность пластиковые культуры ткани сосудов в стандартных культуры условия1. Они также должны показать конкретные поверхности антиген выражение1. Uncultured ИСС характеризуются позитивные поверхностный антиген выражением CD34, CD73, CD90, низкий выражение CD105 и негативное выражение CD45 и HLA-DR10. ИСС, очищенного от культивирования на пластиковые 28 дней (сторонник очищенный ИСС) показывают положительное выражение CD73, CD90 и CD105 и негативное выражение CD34, CD45 и HLA-DR10. Наконец клетки должны сохранять способность дифференцироваться в различных линий1,,7-8.

Адипогенном дифференциация протоколы побудить поразительное upregulation выражения FABP4 среди других генов Адипоцит линии, поэтому мы использовали Иммунохимия для визуализации FABP4 белка в клетках и затем количественно FABP4 выражение на уровне отдельной ячейки с помощью автоматизированной флуоресцентные высоким содержанием скрининг микроскопа. Этот метод является выгодным над традиционными красители, как она позволяет весьма конкретные подтверждения Адипоцит линии разграничения. Такие анализы конкретных линии гена, в сочетании с высоким содержанием скрининг методы также возможность количественной оценки доли клеток в подготовка гетерогенных клетки, которые способны дифференциации вниз конкретной линии. В наших исследованиях мы использовали FABP4 assay для подтверждения потери возможностей дифференциации адипогенном свежевыделенных ИСС после клеточной культуры.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка ИСС для дифференциации анализов

  1. Подготовка реагентов культуры ткани и обрабатывать живой клетки в стерильных культуры ткани капюшоном.
  2. Подготовка среднего A0: Дульбекко изменение орел средних и ветчиной F12 среднего (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x пенициллина/стрептомицина.
  3. Подготовить полный ASC средний: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x пенициллина/стрептомицина, плода бычьим сывороточным 10%.
  4. Сторонник использования очищенной ИСС, расширена в колбе T75 культуры. Подтвердите чистоту ИСС с использованием активированного флуоресценции клеток, сортировка (FACS)10.
  5. Отсоедините клетки, удалив всех средних от T75 культуры колбу и добавив 2 мл фермента диссоциации клеток.
  6. Оставьте флакон культуры в инкубатор (37 ° C, увлажняется, 5% CO2) 5-10 мин. Принимать настой культуры из инкубатора и твердо нажмите на стороне колбу. Проверьте, если клетки отделены от культуры колбу с помощью инвертированного микроскопа.
  7. Добавьте 13 мл A0 среды в колбе T75 культуры.
  8. Передача 15 мл в 15 мл центрифуги и центрифуги на 400 x g за 5 мин.
  9. Отменить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл полного среднего ASC.
  10. Выполните подсчет клеток с помощью Горяева.
  11. Разбавления суспензии клеток к концентрации 25000 клетки мл-1 в полной ASC среде.
  12. Добавьте 200 мкл A0 среды для всех скважин периферии 96 хорошо пластины (плоское дно). Это снижает скорость испарения скважин, содержащие в центре клетки.
  13. Трансфер 200 мкл суспензии клеток в микрорезервуар пластины для достижения окончательного клеток плотность 5 x 103 клеток на хорошо. Четыре скважины требуются для каждой группе лечения (тройные технического повторяется и не основное антитело для immunocytochemistry (ICC)).
  14. Оставьте микрорезервуар пластины в инкубатор (37 ° C, увлажняется, 5% CO2) до клеток достичь слияния (3-4 дней).

2. склонение дифференциация ИСС

  1. Подготовьте адипогенном дифференциации среднего, дополняя полного среднего ASC с 1 dexamethasome мкм, 10 мкм инсулина и 200 мкм индометацином. Полный дифференциации среднего стабилизировано на 4 ° C на 1 месяц, так что только сделать как необходимые для 1 assay. Хранить при 4 ° C и при необходимости тепло Алиготе до 37 ° C в водяной бане.
  2. После 3-4 дня принять микрорезервуар пластины из инкубатора и замените половину из питательной среды адипогенном дифференциации среднего.
  3. Выполните среднего изменения каждые 2-3 дня.
    Примечание: Оптимальный адипогенном дифференциация требует 14 дней культуры в дифференциации среднего. Дифференцированных клеток анализируются с использованием традиционных краска на основе пятна и пятна ген специфического.

3. Окрашивание для дифференциации - традиционные краситель на основе пятна

  1. Приготовляют раствор 4% формальдегида путем разбавления 16% формальдегида с PBS. Разбавляют только сумма, необходимая для эксперимента и хранить плотно закрытыми в пластиковых пробирок.
    Предупреждение: Формальдегид является потенциальным канцерогеном и может вызвать раздражение носа, горла и легких после ингаляции. Выполните все процедуры, связанные с формальдегидом в зонта.
  2. Подготовьте раствор нефти красный O, растворяя 300 мг в 100 мл изопропанола.
  3. Возьмите микрорезервуар пластины из инкубатора. Можно выполнить следующие действия в среде нестерильные.
  4. Удалить все среды из скважин и исправить клетки с 4% формальдегида для 30 мин.
  5. Во время инкубации Подготовьте масло красный O рабочего раствора. Рабочая решение состоит из 6 частей масла O красный шток с 4 частей дистиллированной воды (dH2O). Хорошо перемешайте и дайте постоять 20 мин, до фильтрации с помощью 0,2 мкм фильтр при комнатной температуре. Рабочий раствор стабилен только за 2 ч.
  6. Удалите все формальдегида из скважин, закупорить.
  7. Вымойте клетки один раз с 60% изопропиловый спирт и пусть скважины полностью высохнуть перед продолжением.
  8. Добавьте 50 мкл рабочего раствора O красные нефтяного каждой скважины и инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
  9. Удаление нефти красный O решение и сразу же добавить dH2O. мыть с dH2O 4 раза перед просмотром в световой микроскоп.

4. Окрашивание для дифференциации - Джин специфические антитела

  1. Подготовьте раствор буфер Tris физраствора (TBS), растворяя 80 г NaCl, 2 г KCl и 30г Tris база до 1 Л dH2O (рН 8). Приготовьте рабочий раствор путем разбавления 1:10 с помощью dH2O. хранить при комнатной температуре.
  2. Подготовка immunobuffer (IB) (1% плода бычьим сывороточным (ФБС) в TBS). Ярлык 15 мл пластиковых пробирок с датой и хранить при 4 ° C. IB может использоваться для 1 недели от даты.
  3. Подготовьте 0,25% казеин блокатор, растворяя 0,5 г казеина и 0,195 г азид натрия в 200 мл-фосфатный буфер (PBS). Полностью растворите ингредиенты, помешивая, на ночь. Алиготе в 15 мл пробирок и хранить в морозильной камере-20 ° C. Размороженный казеина решения может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.
  4. Готовят раствор DAPI путем разбавления запасов DAPI 1: 200 в магазине TBS. на 4 ° C, защищать от света.
  5. Готовят раствор запасов тимеросал (10 мг мл-1) путем растворения тимеросала в стерильных PBS. Хранить при 4 ° C и разбавленных соответствующие суммы-0,4 мг мл-1 для использования.
  6. Исправить и разрушения клеток с ледяной метанола (96 хорошо пластина) для 5 минут вымыть клетки один раз с 200 мкл TBS.
  7. Блок с 50 мкл казеина 0,25% при комнатной температуре в течение 10 минут и один раз промойте TBS.
  8. Добавьте 50 мкл первичных антител, разбавленных в IB (антитела подробную информацию см. в таблице 1 ) и инкубировать с крышками, закрыт на 1 час.
  9. После промойте 200 мкл TBS, а затем 3 раза с TBS на 5 мин с плавное покачивание.
  10. Добавьте 50 мкл вторичных антител, разбавленных в IB (см. таблицу 2 подробности антитела) с 1: 2000 DAPI в каждом, инкубации с крышками, закрыт на 1 ч. Крышка плиты с пленкой для предотвращения обесцвечивания фото.
  11. Мыть раз с TBS и затем дважды с TBS 15 мин с плавное покачивание.
  12. Удалите все TBS и 200 мкл раствора тимеросал.
  13. Хранить тарелку на 4 ° C, в защищенном от света до изображений.

5. изображения клетки под микроскопом высокой пропускной способности

  1. Анализируйте клетки окрашивали гена специфические антитела и Флюорофор конъюгированных вторичные антитела (иммунофлюоресценции) с помощью микроскопа высокое содержание скрининг контролируется с сопровождением программного обеспечения.
  2. Загрузите пластину микрорезервуар микроскопа. На пластине приобретения контроля выберите изображение при увеличении среднего диапазона (10 X объектив). Убедитесь, что изображения взяты из центра каждой скважины, с 50 мкм интервал между каждого сайта, чтобы убедиться, что одна ячейка не отображается в двух соседних полях.
  3. Выберите скважин для изображения.
  4. Выберите соответствующий канал комбинаций, времени экспозиции и параметры z смещение. Обратитесь к таблице 3 для более подробную информацию о каждом фильтры (Дополнительная таблица 2).
  5. Получить пробу с помощью мастера приобретения (изображения автоматически сохраняются на сервере базы данных).
  6. Используйте альтернативный канал комбинации для получения пластины, окрашенных в красный нефти O. (Дополнительная таблица 3).

6. проанализировать полученное изображение

Примечание: Удаленный доступ к базы данных сервера позволяет быстро и легко оценки изображения, полученные и использования программного обеспечения для анализа изображения.

  1. Открытых клеток забил модуль программного обеспечения для анализа.
  2. Обнаружения клеточных ядер с помощью DAPI канал (ядерная маркер) и сегмент ядер интерес с определяемой пользователем параметрами для размера и сигнал интенсивности выше фона.
  3. Обнаружить сигнал FABP4, используя FITC канала. Сегмент дифференцированных клеток с определяемой пользователем параметрами для размера и сигнальные интенсивности выше фона для выбора всех регионов позитивные FABP4 в каждом изображении.
  4. Откройте модуль Transfluor на анализ программного обеспечения для анализа пластины, окрашенных в красный нефти O.
  5. Укажите размер и интенсивность нефти красный O окрашенных областей как «ямы».

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании были измерены адипогенном дифференциация потенциал ИСС с 3 различных методов. Immunofluorescent маркировка FABP4, показали, что этот маркер локализована в цитоплазме дифференцированных клеток, и маркировки пересекается с маркировкой DAPI ядер (Рисунок 1A). Автоматизированных изображения анализ показал 24.6 раза, увеличение % положительных клеток FABP4 в группе дифференцированной в начале прохождения клеток, по сравнению с 6,9 раза увеличения в конце прохода клеток (рис. 1B). Масла O красного окрашивания локализована в тучные капельки, рассеянных по всему цитозоль дифференцированных клеток, и маркировки редко совпадает с маркировкой DAPI ядер; Однако от визуального осмотра, есть меньше клеточных ядер, связанные с тучные капельки нефти красный O в конце прохода клеток, по сравнению с раннего проход клеток (рис. 2A). Анализ автоматизированной изображений показал увеличение 11.1 складки в области нефти красный O окрашивания клеток в начале прохождения клеток и 53.9 раз увеличение окрашивания области на ячейку в конце прохода клеток (рис. 2B). Изображения обеих пятна была выполнена, а затем количественно с помощью клеток озвучивание (FABP4) или Transfluor (масло красный O) модуль программного обеспечения (дополнительная цифра 1, дополнительные таблицы 2-5). Западный анализ помаркой (рис. 3, дополнительная цифра 5) был подтвержден upregulation FABP4 выражения. Все методы анализа 3 показало, что ранние проход ИСС выше адипогенном дифференциация потенциальных чем поздно проход клетки. Дифференциация адипогенном не влияет на общий мобильный номер в колодец (дополнительная цифра 2, 3). Однако, было значительно меньше, чем клетки управления для конца прохода ИСС только размер ядер дифференцированных FABP4-положительных клеток (Дополнительные рис. 3).

Мы показали, что клетки были расширены в культуре, или пассированной, процент клеток в культуре способны адипогенном дифференциации снизилась, в соответствии с ранее опубликованных данных11. Важно отметить, что такие факторы, как возраст, индекс массы тела или предыдущей истории болезни12 может не контролируемых для в этом исследовании и вероятно, способствовали изменчивость между образцы различных доноров (Дополнительная таблица 1).

figure-results-1
Рисунок 1 : FABP4 immunolabelling показывает, что ранние проход клетки имеют большей дифференциации потенциальных чем позже проход клетки. A) представитель изображений ранних и поздних проход, контроля и дифференцированных клеток, помечены DAPI (ядерная пятно) и FABP4 показаны наряду с слияния и сегментации изображений. Сегментации изображений отображения дифференцированных клеток с наложением зеленый и недифференцированные клетки с красной наложения. B) значительное увеличение FABP4 выражая клеток наблюдалось с адипогенном дифференциации в начале и конце прохода клеток, однако, рано проход клетки продемонстрировали значительно большее увеличение дифференциации чем поздно проход клетки (Манна-Уитни испытания * обозначает P < 0,05 и *** обозначает P < 0,001). Отображаются данные в среднем через скорейшее прохождение (p4; n = 8) или поздно проход (p10; n = 4) доноров образцы, ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 : Пятнать Красного масла O показывает, что раннего проход клетки имеют большей дифференциации потенциальных чем позже проход клетки. A) представитель образы DAPI (ядерная пятно) и нефти красный O (серый, липидного капель пятно) показываются вместе с слияния и сегментации изображений. Сегментация изображения изобразить все ядра с зеленым оверлея и нефти красный O окрашенных липидного капель с красной наложения. B) значительное увеличение масло красный O окрашивания области было отмечено с адипогенном дифференциации. Начале прохождения клетки показали большую площадь O красные нефтяного пятна на клетку, по сравнению с конца прохода клеток. Площадь нефти красный O пятнать в клетку (2мкм) используется здесь как мера адипогенном дифференциации потенциал. Отображаются данные в среднем через скорейшее прохождение (p4; n = 8) или поздно проход (p10; n = 4) доноров образцы, ± SEM (тест Манна-Уитни * обозначает P = < 0,05 и *** обозначает P = < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3 : Западный анализ помаркой FABP4 белка выражение уровня дифференцированных в начале и конце прохода ИСС. Полуколичественного анализа оптической плотности FABP4 полос как отношение общего белка контроль погрузки, бета актина (ACTB), показали, что FABP4 immunolabelling значительно увеличился в начале прохождения и в меньшей степени поздно проход дифференцированной клетки. Отображаются данные в среднем через скорейшее прохождение (p4; n = 8) или поздно проход (p10; n = 4) доноров образцы, ± SEM (тест Манна-Уитни * обозначает P = < 0,05 и *** обозначает P = < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Целевой антигенIsotype (клон)ВидыРазбавление
FABP4ПоликлональныеКролик1: 100

Таблица 1: Основное антитело

Определение антителФлюорофор этикеткаВидыРазбавление
IgG кроликаAlexa фтор 488Коза1: 200

Таблица 2: Вторичного антитела

Дополнительный рисунок 1: обзор виртуальной среды анализ изображений. Окрашенные клетки были образы с использованием автоматизированной, высок объём флуоресцентный Микроскоп, чтобы избежать любой источник смещения. Изображения приобретены с использованием ImageXpress микро XLS, были сохранены непосредственно к базе данных диспетчера MDCStore и доступной для просмотра через виртуального рабочего стола соединения, которые пользователи используют для оптимизации и тестирования их параметры конкретного анализа. Изображения были проанализированы с экземпляром выделенный «автозапуск», которая позволяет несколько различных пользователей для отправки «вакансии» очередь автозапуска. Пользователи могут получить свои данные через виртуальный экземпляр после завершения их «вакансии». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 2: сравнение всего мобильных игр в Ну управления и дифференцированной скважин для раннего и позднего проход ИСС, используя FABP4, окрашенные пластины. Отображаются данные в среднем через скорейшее прохождение (p4; n = 8) или поздно проход (p10; n = 4) доноров образцы, ± SEM. Там был без статистически значимой разницы между элементом управления и дифференцированных клеток для ранней и поздней проход ИСС. Там были больше ячеек на хорошо для ранних клеток проход, по сравнению с конца прохода клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная цифра 3: сравнение всего мобильных игр в Ну управления и дифференцированной скважин для раннего и позднего проход ИСС, с использованием масла красный O окрашенные пластины. Отображаются данные в среднем через скорейшее прохождение (p4; n = 8) или поздно проход (p10; n = 4) доноров образцы, ± SEM. Там был без статистически значимой разницы между элементом управления и дифференцированных клеток для ранней и поздней проход ИСС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 4: В последующих проходах, дифференцированных клеток, которые были FABP4 положительное было значительно меньшей площади ядер, чем клетки в контроля скважин. Там был без статистически значимой разницы в районе ядер между элементом управления и дифференцированных клеток в начале прохода. Отображаются данные в среднем через скорейшее прохождение (p4; n = 8) или поздно проход (p10; n = 4) доноров образцы, ± SEM. (неспаренный t test. *** обозначает P = < 0,001). Среднее ± SEM отображаются.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная цифра 5: изображения западной помарке гели. Красный канал изображает бета миозина. Зелёный канал изображает FABP4 immunolabelling. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная таблица 1: Clinicopathological информация о доноров Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Imaging параметров (FABP4) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 3: Imaging параметров (масло красный O) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 4: таблица анализа параметров (FABP4). Мобильный модуль очков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 5: таблица анализа параметров используется (масло красный O). Флуор TRANS модуль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот документ свидетельствует о полезности и преимущества FABP4 immunolabelling для точного выявления и количественной оценки Зрелые адипоциты, производный от мезенхимальных стромальных клеток. FABP4 способен обнаружить изменения в выражении линии специфического протеина3,4,5 в зрелых адипоциты, вопреки другим широко используются красители, какой лейбл макромолекулярных изменения13,14 масло красный O15, Нил красный16 и Судан черный17. FABP4 immunolabelling позволяет для визуализации и анализа изменений в клеточной морфологии. Это отличительные преимущества над ранее описанных методов, с помощью обратной транскрипции количественного PCR (RT-ПЦР), который анализирует изменения на уровне Стенограмма без каких-либо визуализации5,18,19 ,20, или проточной цитометрии, который требует клетки в подвеска20, или западной blotting, требует клетки лизированы изолировать белка19,20. FABP4 immunolabelling является стабильным в стационарных клетках, не просочиться в растворе и будучи цитозольной белка, когда помечены в адэрентных монослое клеток, будут перекрываться с ядром позволяет для легкой визуализации и точность в автоматизированный анализ.

Высоким содержанием скрининг выгодно, потому что это быстро, точной, воспроизводимые и объективным. Она обеспечивает платформу для экономически эффективного использования реагентов и исследователь времени, поскольку получение изображения и анализа требуют минимального ручного манипулирования и полагаться на автоматической обработки документа. Несколько факторов были выявлены как решающее значение для точности и воспроизводимости высоким содержанием скрининга assays31. Количественная оценка экспрессии антигена полагается на качество изображения. Для анализа успешных изображения, изображения из каждого канала за хорошо должны быть в центре внимания и подпадают оптимального динамического диапазона для значений серого (Auto предоставляют параметры являются идеальными). Из фокуса или насыщенных образов приводят к ошибочным результатам.

Некоторые потенциальные ограничения методов, описанных в этой статье, включают следующее. Требование для специализированного оборудования и анализа изображений. Хотя в сферу применения этой статьи, опции альтернативной открытым исходным кодом программного обеспечения (например, ImageJ32,33, Фиджи34,32,CellProfiler35) может использоваться для выполнения аналогичных сегментации изображений задач; Однако они требуют навыки, чтобы загрузить и адаптировать макросов доступны онлайн или писать макросы/команды для их конкретного анализа трубопроводов. Присущие всех автоматизированных визуализации анализа трубопроводов является уровень фонового шума. Это может во многом объясняться мусора, плохое изображение качества или анализа ошибки, подчеркивая необходимость тщательной подготовки и тщательной настройки визуализации и анализа платформы. Было установлено, что лейбл FABP4 в мышах обнаружить недифференцированные прародителями30; в то время как элементы управления в этом исследовании (которые состоят из недифференцированных клеток) лишены специфического окрашивания FABP4. Этот заместитель баллы, необходимость проверки FABP4 выражение недифференцированные прародителями в каждом контексте биологических, где занято assay.

Для того чтобы нарисовать допустимых сопоставлений между FABP4 маркировки и масла O красное окрашивание, измерения вывод из анализа изображений, необходимо быть биологически соответствующих. Следовательно измерение, «% положительных клеток» был использован для FABP4, и «район пятнать в клетку» использовался для нефти красный O. Примечательно, что мера «% положительных клеток» не используется для нефти O красной маркировкой клетки в нашем исследовании, потому что не было возможности приписать помечены тучные капельки точно для данного ядра; тучные капельки разнятся в размер, количество и распределение всей клетки тела и редко совпадают с ядром. O Красного масла пятнать изменчивость существует между клеток, полученных из источников различных тканей; Хотя % позитивных клеток мера не подходит для текущего исследования, другая группа успешно использовал его для количественного определения адипоциты, производный от стволовых клеток человека железы22 где пятнать Красного масла O появились как один большой капли жира, которая охватывает Цитоплазма и перекрытием с ядрами и благоприятных данных представлены как % положительных клеток.

В противоположность этому морфология FABP4 immunolabelling последовательна в адипоциты, производный от целого ряда различных тканей источников23,24,25. Возможность количественной оценки доли клеток в культуре способны дифференциации имеет целый ряд приложений. Взрослых мезенхимальных стромальных клеток провести значительные перспективы для разнообразных терапевтического использования. Это является важным вопросом, который возник с клинической перевод присущих изменчивости в способность этих клеток между пациентами26, между сайтами изоляции27,28и между методами для изоляции12 и расширение числа клеток12 для терапевтического использования. Это было показано ранее что культур адэрентных клеток стромы часто гетерогенных, с некоторых клеток, способных дифференциации и некоторые не 12,17 как наши FABP4 пробирного демонстрирует ASC культур. Assays как это, в сочетании с методов обогащения, поможет определить субпопуляциях в разнородных культур способны линии конкретных дифференциации. Имея стандартизированных, количественно assay например этот assay FABP4 предоставляет простой метод для сравнения между все эти переменные, а также потенциал для оценки терапевтических результатов в пределах и между клинических испытаний.

Количественная оценка FABP4 в полу автоматизированное позволяет объективности и воспроизводимость анализа во многих случаях доноров и образцы. Кроме того как метка цитоплазмы, он может быть использован для анализа гипертрофии (увеличения размера Адипоцит) помимо гиперплазия (увеличение числа Адипоцит), различие, которое имеет существенное значение в Ожирение исследований, где гипертрофия прочно ассоциируется с жировой дисфункции тучных людей21. Эпидемия ожирения породил значительное количество интерес к выявлению наркотиков, способного контролировать липидный хранения. Этот assay FABP4 также обеспечивает простой индикация для скрининга тысячи соединений для их способностью ингибировать накопление липидов.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признательны донорам в жировой ткани и исследований специалистов, которые собирают и предоставить нам этот ресурс для использования в исследовательских целях. Мы хотели бы признать финансовой поддержки от Allergan. Мы также благодарны университета Окленда, факультет медицинских и здравоохранения наук производительности на основе исследований фонд для финансирования расходов на видеосъемку и редактирования для представления этой статьи.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Трис БазаИнвитроген15504-020Трис буферизованный физиологический раствор
Хлорид натрияMerck1064041000Трис буферизованный физиологический раствор
Хлорид калияMerck1049360500Трис буферизованный физиологический раствор
Азид натрияШарлауSO0091Раствор блокатора казеина
КазеинSigmaC7078-500GКазеин блокатор
раствор PBS таблеткаSigmaP4417-100TABФосфат буферный физиологический раствор
DMEM/F12Gibco11330-032Клеточная культура
Пенициллин/стрептомицинInvitrogen15140-122Клеточная культура
GlutamaxGibco35050-061Клеточная культура
Фетальная бычья сывороткаGibco10091-148Клеточная культура
TrypLE Select Enzyme (1X), без фенола красныйGibco12563-029Фермент диссоциации клеток
96 лунка планшет (плоское дно)FalconFAL353072Оборудование для культивирования клеток
T75 колба для культур, с фильтрующей крышкойGreiner658175Оборудование для клеточных культур
ИнсулинSigma 19278-5MLАдипогенная дифференцировочная среда
дексаметазонSigmaD2915-100MGАдипогенная дифференцировочная среда
индометацинsigmaI7378-5GАдипогенная дифференцировочная среда
Oil-Red OSigmaO-0625Классическая краска для адипогенеза
IsopropanolMerck1.09634Классическая краска для адипогенеза
16% формальдегидPierce28908Фиксация клеток
Ацетон Merck100983Фиксация клеток
DAPISigmaD9542Иммуноцитохимия
Anti rabbit IgG alexa 488Молекулярные зондыA11008Иммуноцитохимия
ТимеросалSigmaT5125-10GИммуноцитохимия
Кролик против человеческого белка, связывающего жирные кислоты 4 (FABP4), антителоCayman Chemicals10004944Маркер адипогенеза
Центрифужные пробирки (15 мл)Пробирки GreinerGR188271General
Centrifuge (50 мл)GreinerGR227261-PGeneral
ImageXpress Micro XLSМолекулярные устройства Машинаскрининга высокого содержания
MetaXpressПрограммное обеспечение для скрининга высокого содержания молекулярных приборов, версия 5.4.01
для

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).">Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  2. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).">Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
  3. Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).">Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
  4. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).">Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
  5. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).">Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
  6. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).">Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
  7. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).">Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  8. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).">Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  9. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).">Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
  10. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).">Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
  11. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).">Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
  12. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).">Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
  13. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).">Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
  14. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).">Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
  15. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).">Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
  16. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).">Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  17. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).">Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
  18. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).">Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
  19. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).">Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
  20. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).">Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  21. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).">Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  22. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).">Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
  23. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811(2013).">Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811(2013).
  24. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).">Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
  25. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).">LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
  26. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).">Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
  27. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).">Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  28. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).">Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
  29. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).">Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
  30. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).">Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
  31. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).">Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
  32. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).">Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
  33. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).">Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
  34. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).">Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Cell Adipogenic DifferentiationFABP4 ImmunofluorescenceAdipogenic Differentiation AssayHigh Content ScreeningStromal Cell IsolationOil Red O StainingFatty Acid Binding Protein 4Cell Morphology AnalysisAutomated Image AnalysisAdipogenic Differentiation Medium

Related Articles