Confocal микроскопии показывает клеток поверхности рецептор агрегации через спектроскопии корреляции изображений

Разработка терапевтических антител показал замечательный успех в лечении множественные опухоли типа¹. Последние достижения антитела наркотиков конъюгатов (ADC) как механизмы доставки для цитотоксических соединений расширил требования для понимания динамики взаимодействия антитела: рецептор на клетки поверхность². После успешного нападения на антитела к поверхности рецепторные клетки, эти комплексы может вызвать аналогичные структуры агрегирования с теми, которые наблюдались в лиганд: антитела взаимодействия³. Изменения в агрегации рецепторов могут вызвать изменения в мембраны и результат в интернализации рецептора и его удаление из клеточной поверхности. В контексте Конъюгат антител наркотиков этот процесс впоследствии выпускает цитотоксических полезной во внутреннюю endosomes и впоследствии цитоплазмы, что приводит к эффективной клетки убийства.

Конфокальная микроскопия предоставил эффективным средством визуализации этих важных взаимодействия антител и их целевой рецепторы⁴. Для изучения изменений агрегации целевой молекулы на поверхности клеток этот протокол использует пост-обработки confocal микроскопии изображений через пространственного изображения корреляции спектроскопии (ICS) техника ^5,6,7 .

Основа спектроскопии корреляции изображений является наблюдение, что колебания интенсивности пространственных флуоресценции разделяют отношения в состояние плотности и агрегирования помечены структур. Эта связь устанавливается после расчета пространственных автокорреляционной функции образа⁵.

Все варианты спектроскопии корреляции изображений требуется Вычисление автокорреляции изображения. Это сопровождается уместно эту функцию для двумерных кривая Гаусса для извлечения параметров состояния количественных агрегации, содержащиеся в образе. В простых терминах Вычисление автокорреляции изображений включает в себя сравнение всех возможных пикселей пары содержащихся в изображении и расчета вероятности что оба одинаково как яркий, как друг с другом. Это визуализируется как функция расстояния и направления пикселей разделения⁸.

Теоретические основы для спектроскопии корреляции изображения была создана и определяется Петерсен и мудреца и др. ^{5 , 6}. в настоящем Протоколе, автокорреляции вычисления выполняются в Фиджи/ImageJ, а также приложение электронной таблицы, основой для пространственных автокорреляционная функция колебания интенсивности может быть описан как (Eq 1):

где F представляет Фурье; F⁻¹ Фурье обратное преобразование; F * его сложный конъюгат; и пространственной ЛАГ переменные ε и η. В пространственной ICS как описано в настоящем Протоколе, автокорреляционная функция может быть рассчитана с помощью 2D быстрого преобразования Фурье преобразование алгоритм^7,9. Автокорреляция на нулевой пространственного разделения, иначе известный как нуль ЛАГ, g₁₁(0,0), обеспечивает обратное среднее количество частиц нынешней площади луч микроскопа. Она может быть получена путем установки пространственного автокорреляционная функция для двумерных Гауссова функция (Eq 2):

Как пикселей, захвачен в изображении содержатся в пределах установленного области, и эти измерения не распространяется на бесконечности, g∞ термин используется в качестве смещения для учета долгосрочных пространственных корреляций, содержащиеся в образе. Для молекулярного размера агрегатов ω — точки распространения функция микроскопа и описал полной ширины на половину максимум пространственных автокорреляционной функции. Области, содержащиеся в точки распространения функция документа может быть откалиброван с использованием флуоресцентных бусины подпункта резолюции.

Для протокола спектроскопии корреляции изображений, описываемые автокорреляционный и математических функций, необходимых для завершения ICS выполняются с использованием открытым исходным кодом платформы обработки изображений, Фиджи¹⁰, распределение ImageJ Программа^11,12. Фиджи/ImageJ использует предустановленные быстрого преобразования Фурье в БПФ математические функции. Эта функция сокращает время вычисления этого расчета путем уменьшения диапазона данных по два в каждом измерении¹³раза. Как 2D автокорреляционная функция приблизительно симметрично в x, y оси, участок профиля одной линии через образ автокорреляции может использоваться для измерения сырье автокорреляции как функция пространственной ЛАГ. Ноль ЛАГ шум удаляется до дальнейшего вычисления, с результате автокорреляции амплитудой (пиковое значение, g(0)_T) исправлены для фона с выражением (Eq 3):

где я_b -это средняя интенсивность от фона региона, исключая ячейки. Плотности кластера, или плотность флуоресцентных объектов, определяется (Eq 4):

В протоколе, описанные здесь мы также просто расчет плотности кластера (CD), с предположение основано на том наблюдении, что нормализованных автокорреляционная функция будет распадаться значение приближается 1.0 с увеличением пространственных ЛАГ. С максимальной пространственных ЛАГ, это больше не корреляции флуоресценции значения интенсивности и таким образом без корреляции вычислений в этом регионе вычисления значения интенсивности, умноженное на такой интенсивности, которая затем делится на Площадь той интенсивностью, которая по определению равна 1.0. Таким образом кластер плотности от нормализованной автокорреляционная функция может быть вычислено путем вычитания 1.0 от нормализованной автокорреляционной функции до принятия его взаимные (Eq 5):

Дальнейшие области луч может быть калибрация чтобы quantitate количество кластеров, содержащихся в области точки распространения функция инструмента. Калибровка должна быть выполнена с использованием же оптические условия, используемые в ходе анализа спектроскопии корреляции изображений.

1. посев адэрентных клеток линии для визуализации эксперимент

1. Семя 10000 A431 плоскоклеточный рак ячейки на хорошо на ночь (O/N) в 300 мкл Дульбекко изменения смесь средне/питательных орел F-12 (DMEM/F-12) средства массовой информации, содержащие 10% плода Bovine сыворотки, 1% пенициллина и стрептомицина и 1% GlutaMAX в 8 камерные изображений слайд для высокого разрешения масло погружения объективов (например, NuncTM лаборатории-TekTM под патрон coverglass).
2. Стимулировать агрегации рецепторов на клетки A431 с добавлением 100 нг/мл EGF лиганд в СМИ за 10 мин при комнатной температуре (RT).

2. основное антитело инкубации

1. Извлеките носитель и вымыть клетки с 300 мкл комнатной температуры (RT)-фосфатный буфер (ПБС) дважды.
2. Исправить клетки с 200 мкл параформальдегида 4% в PBS 10 мин на RT.
   Примечание: Для изучения временных изменений целевых агрегации, этот шаг крепления должны быть опущены.
3. Удаление PFA и вымыть клетки с 300 мкл комнатной температуры PBS дважды.
4. Инкубировать клетки с 200 мкл PBS, содержащий основное антитело в концентрации 10 мкг/мл для по крайней мере 2 ч при 4 ° C.
   Примечание: Для ICS расчетов считается действительным, все рецепторы на поверхности клеток должны быть помечены основное антитело. Это требует предварительных экспериментов с серией разбавления каждого основного антитела (1:10, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 500 1:1, 000, и т.д.) должны быть выполнены. Оптимальное основное антитело концентрация определяется путем анализа интенсивности флуоресценции против кластера плотность. Выбранный первичный концентрации происходит, когда плотность кластера плато с увеличением концентрации основного антитела до дальнейшего увеличения плотности кластера результате неспецифической антитела связывая. Основное антитело может быть разбавлен в сыворотке крови свободных средств массовой информации, если выполнение визуализации эксперимент курс.
5. После завершения время желаемого инкубации Вымойте клетки с 300 мкл RT PBS дважды.
6. Блокировать образца с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для по крайней мере 2 ч при 4 ° C.
   Примечание: Фиксированная образцы обычно блокируются (O/N) на ночь при 4 ° C.

3. Вторичное антитело инкубации

1. Подготовка 10 мкг/мл запас дневно помечены вторичные антитела (например Alexa Fluor 488 IgG) в PBS. 2 мкг/мл Hoechst 33342 могут быть включены в этот разрежения для обнаружения улучшены примеры на микроскопе.
   Примечание: Для покадровой экспериментов, PBS можно обменять на сыворотке свободных средств массовой информации.
2. Удаление 5% BSA/PBS из клеток и инкубировать раствором вторичное антитело втечение 2 ч при температуре 4 ° C, защищая образцы от окружающего света.
3. По завершении вторичное антитело инкубации время вымыть клетки с 300 мкл PBS (дважды) и хранить при 4 ° C, защищать от окружающего света.
4. Для предотвращения испарения, оберните края камеры слайд с парафина.

4. конфокальная микроскопия образцов

Примечание: Параметры, используемые для анализа конфокальный будет отличаться в зависимости от оборудования и флуорофоров, используемые в отдельных эксперимент. Современные конфокальный инструменты обеспечивают механизмы для сохранения всех изображений параметры, используемые в эксперименте в формат файла образа в машинном коде документа. Важно, что эти параметры записаны предусмотреть соответствующие репликации экспериментальных условий в разные периоды сбора данных.

1. Во время изображения флуоресцентных сигналов, Избегайте чрезмерной насыщенности. Использовать изображения Посмотреть таблицу, которая обеспечивает представление ложных цвета пиксела насыщения и уменьшить прибыль детектор и соответственно мощность лазера. Наиболее конфокальный инструменты включают параметр «диапазон индикатора» или аналогичный параметр в приобретении программного обеспечения для этого.
2. Свести к минимуму воздействие Флюорофор интерес для мощность лазера. Использование ДНК маркировки пятно как Hoechst 33342 предоставляет простой механизм для выявления и положение образца в поле зрения до коллекции.
3. Выполнение первоначального сканирования образца с низким разрешением и если программное обеспечение позволяет быстро скорость сканирования. Это будет ограничивать возможности Фотообесцвечивание образца.
4. Увеличить разрешение захвата и замедлить скорость сканирования, когда будете готовы собирать данные изображения.
5. Если конфокальный инструмент позволяет, сбор данных с помощью фотон, подсчитывая режиме.
   Примечание: Если фотон подсчета не доступен на инструмент: обеспечить уровни серого линейной во время захвата изображений.
6. Установите обскуры для каждой линии лазера используется для 1 блок Эйри (АС).
7. Использование линии или фрейм, в среднем во время приобретения (x4) изображения для уменьшения детектор связанных шум.
   Примечание: В этом варианте ICS как только один момент времени фиксируется время приобретения не экспериментальные ограничивающих факторов.
8. Для изображения коллекции выберите большим увеличением, высокая числовая апертура цели, например цель плана-Апохромат, чтобы обеспечить максимальное разрешение и коррекция для сферических и хроматических аберраций (примеры включают план-Апохромат 100 X или 63 X /1.40 Масло цели).
9. Oversample размер захваченных пикселов в изображении. Рекомендуется каждого пикселя захватить регион 50 x 50 Нм. Для эффективного ICS размер пикселя должна быть менее 0,1 x 0,1 мкм² на пиксель. Это достигается путем сочетания масштабирования для сканирования на относительно небольшой площади и выбора относительно большое изображение формата (например 1024 x 1024 или 2048 x 2048 пикселей).
10. Сосредоточиться на апикальной или базальной поверхности клетки в регионе как плоский как можно скорее. Несколько ячеек могут быть собраны в один образ и регионах интереса, обрабатываются индивидуально во время анализа ICS.
11. Захватить область свободный фона ячейки, используя те же параметры инструмента для нормализации образца.

5. Расчет спектроскопии корреляции изображений

Примечание: Открытым исходным кодом платформы обработки изображений, Фиджи, распределение ImageJ программы, требуется для выполнения автокорреляции и математические функции, необходимые для ICS. Это распределение ImageJ рекомендуется, поскольку она включает в себя многочисленные предварительно установленных подключаемых модулей и легче обновление архитектуры, который может выполнять операции через несколько изображений экспериментов.

1. Установите программу Фиджи (http://fiji.sc/Downloads).
2. Загрузите приобретенные наборы данных.
3. Определите области поверхности мембраны апикальной или Базальноклеточный интерес и дубликат для размер пикселя 2ⁿ (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). «Меню: изображение > Дублировать...»
4. Расчет средней интенсивности области кадрирования интерес «меню: анализ > измерения.»
5. Определить область фона и дублировать одинаковый размер пикселя захвата клеточной поверхности мембраны (2ⁿ: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). «Меню: изображение > Дублировать...»
6. Расчет средней интенсивности фона, обрезанные области интереса. «Меню: анализ > измерения.»
7. Вычтите средней интенсивности фонового изображения, содержащие области интереса. «Процесс > изображение калькулятор > вычесть.»
8. Выполните вычисление автокорреляции. Этот расчет, содержится в структуре меню: «процесс > FTT > FD математике.»
   1. В математике FD диалоговое окно выберите: изображение 1: обрезанное изображение имя, операции как корреляции, изображение 2: имя обрезанное изображения, обратное преобразование.
9. Нормализовать полученный образ путем деления на общее количество пикселей. «Меню: процесс > математика > разделить...» (например: 64 x 64 пикселей = 4096)
10. Нормализовать снова путем деления средней интенсивности нормированного обрезанные области квадрат. «Меню: процесс > математика > разделить...»
    Примечание: Это может быть достигнуто путем деления изображения значение средней интенсивности дважды.
11. Нарисуйте линию через точку распространения функция.
12. Участок профиль этой линии, чтобы вычислить максимальное значение. «Меню: анализ > участок профиля.»
13. Рассчитать кластеров на площади пучка путем передачи пиковое значение (результат 5.12) в электронную таблицу и выполните следующие вычисления (Eq 6):
    

6. Пакетная обработка ICS наборов данных

Примечание: Создание макроса Фиджи/ImageJ рекомендуется повторить описанные в протоколе выше. Это позволяет для последовательного и быстрого анализа нескольких файлов изображений во время анализа спектроскопии корреляции изображений.

1. Создание рабочего процесса ICS макрос путем записи каждой команды меню в протоколе ICS
   «Меню: Плагины > Макрос > запись...».
2. Выберите «Создать» для создания макросов.
3. Выберите пункт «язык > макрос IJ1.»
4. Сохраните макрос.
5. Различные шаги макроса, обеспечивая напоминания для операторов каждой функции добавьте диалоговые окна. Диалоговые окна также служить в качестве метода для приостановки процесса анализа для нужные до дальнейшей обработки (то есть, регион для обрезки)
   1. Коде диалогового окна Макрос
      Название = «Заголовок диалогового окна»;
      MSG = «Диалоговое окно Box/протокол шаг сообщение»;
      waitForUser (название, msg);
      Примечание: Дополнительная эффективность может устанавливаться, подписавшись на сайт обновления бар в Фиджи Updater (инструкции по https://imagej.net/BAR). Это обеспечивает Фиджи с «коллекция широко применимых процедур» ¹⁴. Одна такая процедура является найти пиков. Структура меню: «бар > анализ данных > найти пиков.» Этот сценарий предоставляет быстрый средства из расчета, что пиковое значение в профиле точки распространения функция.

7. протокол расширения: Расчет луч области микроскопа

Примечание: Функция оптической передачи микроскопа гарантирует, что даже молекулярного размера объектов отображаются в виде изображений с радиусом около 200-300 Нм в плоскости x-y. Протокол ICS позволяет определение точки распространения функция, выполнив шаги 4-5 на флуоресцентные бусины подпункта резолюции. В частности:

1. Смонтировать подпункта резолюции (т.е. < диаметр 100 Нм) флуоресцентных бус на 8 камерные изображений слайд.
2. Бисер изображения в соответствии с описанной протокол, с помощью конфокального микроскопа, использовали для экспериментов ICS.
3. Вычислите функцию ICS из результирующего изображения в соответствии с протоколом шаги 5.1-5.13.
4. Из печати профиля Вычислить радиус луча (r) как полную ширину на половину максимального значения функцией ICS.
5. Вычислите площадь пучка (BA) (Eq 7):

8. протокол расширения: Расчет кластеров на единицу площади

1. Вычислить плотность кластера (CD) на единицу площади (Eq 8):
   
   
2. Разделите кластеры на площади луч (результат 5.13) площадь пучка (результат 7.5).

Эксперимент спектроскопии корреляции успешный изображения зависит от надлежащего применения контроля лечения. Эти группы лечения включают изучение флуоресценции в не основное антитело и группы лечения не вторичное антитело. После настройки оптимального Конфокальная лазерная устанавливаются для эксперимента, изображения должны быть захвачены этих групп управления, чтобы подтвердить отсутствие неспецифических флуоресценции в образце. Для многих адэрентных рак клеточных линий выявление областей для ICS ограничивается отсутствием плоских поверхностей. Это компенсируется возможность захвата большое поле зрения нескольких раковых клеток в одно конфокальное изображение. Это обеспечивает возможность создавать необходимые выборки статистического сравнения между группами лечения.

В этом эксперименте представителя клетки A431 EGFR позитивные плоскоклеточный рак, были стимулируется с 100ng/мл EGF лигандом для 10 мин при комнатной температуре, чтобы побудить EGFR кластеризации. Был проведен анализ ICS на обоих EGF стимулировали (рис. 1A) и кератоз (рис. 1 d) клетки после инкубации с EGFR ориентации гуманизированные моноклональные антитела, cetuximab. Впоследствии, 64 x 64 пикселя урожай региона (желтом), содержащихся в клеточной мембраны (рис. 1B и 1E) было обработано используя автокорреляционная функция содержится в открытым исходным кодом платформы обработки изображений, Фиджи. Этот результирующий образ автокорреляции нормализуется путем вычитания фон флуоресценции до деления на площади средней интенсивности нормализованных региона интерес, а также площади количество пикселей в регионе обрезается ( Рисунок 1 c и 1F). Инструмент Линия функции был использован для построения профиля точки распространения функция этого образа (Рисунок 1 g и 1 H). Пиковое значение этих профилей были перенесены в приложение электронной таблицы для дальнейшей обработки данных. Фиджи макрос был создан повторить эти шаги обработки Фиджи для быстрой обработки серии клеток (n = 6) от обеих групп лечения после cetuximab immunocytochemistry (Рисунок 1I). В этом эксперименте рецептор EGFR была выявлена в 5.84 ± 0,85 кластеры луч площади на поверхности стимулируется клетки против 14.94 ± 1.62 кластеров на площади луча в популяциях, кератоз клетки A431. С предположением, что экспериментальные условия, используемые для этого анализа предел быстрого рецептор оборот, EGFR кластера плотность в стимулируется клетки A431 уменьшилось 2.56-fold. Когда условия сравниваются для агрегирования состояние той же молекулы цели в условиях, когда целевая молекула оборот ограничено, меньшее количество кластеров на площади луч указывает увеличение целевой агрегации. После EGF лигандом стимуляции EGFR агрегации увеличивает 2.56-fold, как ожидалось в этой системе. Создание макроса Фиджи, используя шаги, описанные в настоящем Протоколе позволяет для статистического сравнения различных процедур или экологических различий и их влияние на агрегации рецепторов.

Рисунок 1: спектроскопии корреляции изображений для обнаружения дневно помечены кластеров на поверхности клеток рака адэрентных клеток. Конфокальная микроскопия образ представитель EGF стимулировали (A) или кератоз (D) адэрентных клеток плоскоклеточный рак A431 помечены cetuximab основной ориентации поверхности EGFR рецепторов клеток с Алекс Fluor 488 вторичного антитела антитело. Стимулируется клетки лечили 100 нг/мл EGF 10 мин при комнатной температуре, чтобы побудить EGFR кластеризации до фиксации и иммуноцитохимии. Мембраны клеток содержащих культур регионов (желтом) с размерами в пикселах (64 x 64 [2n]) были использованы для выполнения анализа ICS (B и E). После нормализации функции автокорреляции в Фиджи/ImageJ, инструмент «линия» (желтый) был использован для измерения точки распространения функция (C и F) профиль этой функции линии строится для обнаружения пиковое значение (G и H ). EGF стимуляции наблюдался побудить 2.56-fold снижением обнаружено EGFR кластеров в ±0.85 области 5.84 луча, по сравнению с 14,9 5±1.62 кератоз клетки (n = 6) (I). С предположением, экспериментальные условия, используемые в настоящем анализе, поддерживается постоянное количество рецепторов клеточной мембраны, это представляет собой увеличение EGFR агрегации после EGF стимуляции. Масштаб баров = 10 мкм (A и D); 1 мкм (B-C и E-F). Блочная диаграмма отображается с помощью Тьюки стиль с усами, представляющий максимальный и минимальный наблюдается межквартильный диапазон значений не более чем 1,5 × (ИКР). Кластеры в брус уголок ± стандартная ошибка означает (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Эндрю Скотт M имеет исследований финансовой поддержки от AbbVie Фармацевтика, EMD Сероно и Даиичи-Санкё Co и консультации и владение акциями фармацевтических наук о жизни. Авторы не имеют других соответствующих принадлежность или финансового участия какой-либо организации или лица с финансовой заинтересованности в или финансовый конфликт с предмета или обсуждались в рукописи помимо указанных материалов.