Методическая статья

Confocal микроскопии показывает клеток поверхности рецептор агрегации через спектроскопии корреляции изображений

DOI:

10.3791/57164

⸱

2 августа 2018 г.

 ,  ,  , 
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Антитела, которые привязаны к целевой рецепторы на поверхности клеток может придать конформации и кластеризации изменения. Эти динамические изменения имеют последствия для развития наркотиков в клетки-мишени. Этот протокол использует confocal микроскопии и спектроскопии корреляции изображений через ImageJ/Фиджи для количественной оценки степени рецептора кластеризации на поверхности клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфокальная микроскопия предоставляет доступные методологию для захвата субклеточном взаимодействия критические характеристика и дальнейшего развития доклинических агентов, помечены флуоресцентных зондов. С последними достижениями в наркотиков цитотоксических антител на основе систем доставки, понимание изменений, вызванных этими агентами в сфере агрегации рецепторов и интернализации имеет решающее значение. Этот протокол использует устоявшейся методологии флуоресцентные иммуноцитохимии и открытым исходным кодом Фиджи распределение ImageJ, с его встроенными автокорреляции и изображения математических функций, для выполнения корреляции пространственного изображения спектроскопия (ICS). Этот протокол quantitates интенсивности флуоресценции рецепторов, помечены как функция пучка области конфокального микроскопа. Это дает количественную оценку положения комплексирования целевой молекулы на поверхности клеток. Эта методология направлена на характеристике статических клеток с потенциалом для расширения в височной исследования агрегации рецепторов. Этот протокол представляет доступной методологии для обеспечения количественной оценки кластеризации событий, происходящих на поверхности клеток, используя хорошо созданы методы и неспециализированных тепловизионной аппаратуры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка терапевтических антител показал замечательный успех в лечении множественные опухоли типа1. Последние достижения антитела наркотиков конъюгатов (ADC) как механизмы доставки для цитотоксических соединений расширил требования для понимания динамики взаимодействия антитела: рецептор на клетки поверхность2. После успешного нападения на антитела к поверхности рецепторные клетки, эти комплексы может вызвать аналогичные структуры агрегирования с теми, которые наблюдались в лиганд: антитела взаимодействия3. Изменения в агрегации рецепторов могут вызвать изменения в мембраны и результат в интернализации рецептора и его удаление из клеточной поверхности. В контексте Конъюгат антител наркотиков этот процесс впоследствии выпускает цитотоксических полезной во внутреннюю endosomes и впоследствии цитоплазмы, что приводит к эффективной клетки убийства.

Конфокальная микроскопия предоставил эффективным средством визуализации этих важных взаимодействия антител и их целевой рецепторы4. Для изучения изменений агрегации целевой молекулы на поверхности клеток этот протокол использует пост-обработки confocal микроскопии изображений через пространственного изображения корреляции спектроскопии (ICS) техника 5,6,7 .

Основа спектроскопии корреляции изображений является наблюдение, что колебания интенсивности пространственных флуоресценции разделяют отношения в состояние плотности и агрегирования помечены структур. Эта связь устанавливается после расчета пространственных автокорреляционной функции образа5.

Все варианты спектроскопии корреляции изображений требуется Вычисление автокорреляции изображения. Это сопровождается уместно эту функцию для двумерных кривая Гаусса для извлечения параметров состояния количественных агрегации, содержащиеся в образе. В простых терминах Вычисление автокорреляции изображений включает в себя сравнение всех возможных пикселей пары содержащихся в изображении и расчета вероятности что оба одинаково как яркий, как друг с другом. Это визуализируется как функция расстояния и направления пикселей разделения8.

Теоретические основы для спектроскопии корреляции изображения была создана и определяется Петерсен и мудреца и др. 5 , 6. в настоящем Протоколе, автокорреляции вычисления выполняются в Фиджи/ImageJ, а также приложение электронной таблицы, основой для пространственных автокорреляционная функция колебания интенсивности может быть описан как (Eq 1):

figure-introduction-1     

где F представляет Фурье; F−1 Фурье обратное преобразование; F * его сложный конъюгат; и пространственной ЛАГ переменные ε и η. В пространственной ICS как описано в настоящем Протоколе, автокорреляционная функция может быть рассчитана с помощью 2D быстрого преобразования Фурье преобразование алгоритм7,9. Автокорреляция на нулевой пространственного разделения, иначе известный как нуль ЛАГ, g11(0,0), обеспечивает обратное среднее количество частиц нынешней площади луч микроскопа. Она может быть получена путем установки пространственного автокорреляционная функция для двумерных Гауссова функция (Eq 2):

figure-introduction-2     

Как пикселей, захвачен в изображении содержатся в пределах установленного области, и эти измерения не распространяется на бесконечности, g∞ термин используется в качестве смещения для учета долгосрочных пространственных корреляций, содержащиеся в образе. Для молекулярного размера агрегатов ω — точки распространения функция микроскопа и описал полной ширины на половину максимум пространственных автокорреляционной функции. Области, содержащиеся в точки распространения функция документа может быть откалиброван с использованием флуоресцентных бусины подпункта резолюции.

Для протокола спектроскопии корреляции изображений, описываемые автокорреляционный и математических функций, необходимых для завершения ICS выполняются с использованием открытым исходным кодом платформы обработки изображений, Фиджи10, распределение ImageJ Программа11,12. Фиджи/ImageJ использует предустановленные быстрого преобразования Фурье в БПФ математические функции. Эта функция сокращает время вычисления этого расчета путем уменьшения диапазона данных по два в каждом измерении13раза. Как 2D автокорреляционная функция приблизительно симметрично в x, y оси, участок профиля одной линии через образ автокорреляции может использоваться для измерения сырье автокорреляции как функция пространственной ЛАГ. Ноль ЛАГ шум удаляется до дальнейшего вычисления, с результате автокорреляции амплитудой (пиковое значение, g(0)T) исправлены для фона с выражением (Eq 3):

figure-introduction-3     

где яb -это средняя интенсивность от фона региона, исключая ячейки. Плотности кластера, или плотность флуоресцентных объектов, определяется (Eq 4):

figure-introduction-4    

В протоколе, описанные здесь мы также просто расчет плотности кластера (CD), с предположение основано на том наблюдении, что нормализованных автокорреляционная функция будет распадаться значение приближается 1.0 с увеличением пространственных ЛАГ. С максимальной пространственных ЛАГ, это больше не корреляции флуоресценции значения интенсивности и таким образом без корреляции вычислений в этом регионе вычисления значения интенсивности, умноженное на такой интенсивности, которая затем делится на Площадь той интенсивностью, которая по определению равна 1.0. Таким образом кластер плотности от нормализованной автокорреляционная функция может быть вычислено путем вычитания 1.0 от нормализованной автокорреляционной функции до принятия его взаимные (Eq 5):

figure-introduction-5     

Дальнейшие области луч может быть калибрация чтобы quantitate количество кластеров, содержащихся в области точки распространения функция инструмента. Калибровка должна быть выполнена с использованием же оптические условия, используемые в ходе анализа спектроскопии корреляции изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. посев адэрентных клеток линии для визуализации эксперимент

  1. Семя 10000 A431 плоскоклеточный рак ячейки на хорошо на ночь (O/N) в 300 мкл Дульбекко изменения смесь средне/питательных орел F-12 (DMEM/F-12) средства массовой информации, содержащие 10% плода Bovine сыворотки, 1% пенициллина и стрептомицина и 1% GlutaMAX в 8 камерные изображений слайд для высокого разрешения масло погружения объективов (например, NuncTM лаборатории-TekTM под патрон coverglass).
  2. Стимулировать агрегации рецепторов на клетки A431 с добавлением 100 нг/мл EGF лиганд в СМИ за 10 мин при комнатной температуре (RT).

2. основное антитело инкубации

  1. Извлеките носитель и вымыть клетки с 300 мкл комнатной температуры (RT)-фосфатный буфер (ПБС) дважды.
  2. Исправить клетки с 200 мкл параформальдегида 4% в PBS 10 мин на RT.
    Примечание: Для изучения временных изменений целевых агрегации, этот шаг крепления должны быть опущены.
  3. Удаление PFA и вымыть клетки с 300 мкл комнатной температуры PBS дважды.
  4. Инкубировать клетки с 200 мкл PBS, содержащий основное антитело в концентрации 10 мкг/мл для по крайней мере 2 ч при 4 ° C.
    Примечание: Для ICS расчетов считается действительным, все рецепторы на поверхности клеток должны быть помечены основное антитело. Это требует предварительных экспериментов с серией разбавления каждого основного антитела (1:10, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 500 1:1, 000, и т.д.) должны быть выполнены. Оптимальное основное антитело концентрация определяется путем анализа интенсивности флуоресценции против кластера плотность. Выбранный первичный концентрации происходит, когда плотность кластера плато с увеличением концентрации основного антитела до дальнейшего увеличения плотности кластера результате неспецифической антитела связывая. Основное антитело может быть разбавлен в сыворотке крови свободных средств массовой информации, если выполнение визуализации эксперимент курс.
  5. После завершения время желаемого инкубации Вымойте клетки с 300 мкл RT PBS дважды.
  6. Блокировать образца с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для по крайней мере 2 ч при 4 ° C.
    Примечание: Фиксированная образцы обычно блокируются (O/N) на ночь при 4 ° C.

3. Вторичное антитело инкубации

  1. Подготовка 10 мкг/мл запас дневно помечены вторичные антитела (например Alexa Fluor 488 IgG) в PBS. 2 мкг/мл Hoechst 33342 могут быть включены в этот разрежения для обнаружения улучшены примеры на микроскопе.
    Примечание: Для покадровой экспериментов, PBS можно обменять на сыворотке свободных средств массовой информации.
  2. Удаление 5% BSA/PBS из клеток и инкубировать раствором вторичное антитело втечение 2 ч при температуре 4 ° C, защищая образцы от окружающего света.
  3. По завершении вторичное антитело инкубации время вымыть клетки с 300 мкл PBS (дважды) и хранить при 4 ° C, защищать от окружающего света.
  4. Для предотвращения испарения, оберните края камеры слайд с парафина.

4. конфокальная микроскопия образцов

Примечание: Параметры, используемые для анализа конфокальный будет отличаться в зависимости от оборудования и флуорофоров, используемые в отдельных эксперимент. Современные конфокальный инструменты обеспечивают механизмы для сохранения всех изображений параметры, используемые в эксперименте в формат файла образа в машинном коде документа. Важно, что эти параметры записаны предусмотреть соответствующие репликации экспериментальных условий в разные периоды сбора данных.

  1. Во время изображения флуоресцентных сигналов, Избегайте чрезмерной насыщенности. Использовать изображения Посмотреть таблицу, которая обеспечивает представление ложных цвета пиксела насыщения и уменьшить прибыль детектор и соответственно мощность лазера. Наиболее конфокальный инструменты включают параметр «диапазон индикатора» или аналогичный параметр в приобретении программного обеспечения для этого.
  2. Свести к минимуму воздействие Флюорофор интерес для мощность лазера. Использование ДНК маркировки пятно как Hoechst 33342 предоставляет простой механизм для выявления и положение образца в поле зрения до коллекции.
  3. Выполнение первоначального сканирования образца с низким разрешением и если программное обеспечение позволяет быстро скорость сканирования. Это будет ограничивать возможности Фотообесцвечивание образца.
  4. Увеличить разрешение захвата и замедлить скорость сканирования, когда будете готовы собирать данные изображения.
  5. Если конфокальный инструмент позволяет, сбор данных с помощью фотон, подсчитывая режиме.
    Примечание: Если фотон подсчета не доступен на инструмент: обеспечить уровни серого линейной во время захвата изображений.
  6. Установите обскуры для каждой линии лазера используется для 1 блок Эйри (АС).
  7. Использование линии или фрейм, в среднем во время приобретения (x4) изображения для уменьшения детектор связанных шум.
    Примечание: В этом варианте ICS как только один момент времени фиксируется время приобретения не экспериментальные ограничивающих факторов.
  8. Для изображения коллекции выберите большим увеличением, высокая числовая апертура цели, например цель плана-Апохромат, чтобы обеспечить максимальное разрешение и коррекция для сферических и хроматических аберраций (примеры включают план-Апохромат 100 X или 63 X /1.40 Масло цели).
  9. Oversample размер захваченных пикселов в изображении. Рекомендуется каждого пикселя захватить регион 50 x 50 Нм. Для эффективного ICS размер пикселя должна быть менее 0,1 x 0,1 мкм2 на пиксель. Это достигается путем сочетания масштабирования для сканирования на относительно небольшой площади и выбора относительно большое изображение формата (например 1024 x 1024 или 2048 x 2048 пикселей).
  10. Сосредоточиться на апикальной или базальной поверхности клетки в регионе как плоский как можно скорее. Несколько ячеек могут быть собраны в один образ и регионах интереса, обрабатываются индивидуально во время анализа ICS.
  11. Захватить область свободный фона ячейки, используя те же параметры инструмента для нормализации образца.

5. Расчет спектроскопии корреляции изображений

Примечание: Открытым исходным кодом платформы обработки изображений, Фиджи, распределение ImageJ программы, требуется для выполнения автокорреляции и математические функции, необходимые для ICS. Это распределение ImageJ рекомендуется, поскольку она включает в себя многочисленные предварительно установленных подключаемых модулей и легче обновление архитектуры, который может выполнять операции через несколько изображений экспериментов.

  1. Установите программу Фиджи (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Загрузите приобретенные наборы данных.
  3. Определите области поверхности мембраны апикальной или Базальноклеточный интерес и дубликат для размер пикселя 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). «Меню: изображение > Дублировать...»
  4. Расчет средней интенсивности области кадрирования интерес «меню: анализ > измерения.»
  5. Определить область фона и дублировать одинаковый размер пикселя захвата клеточной поверхности мембраны (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). «Меню: изображение > Дублировать...»
  6. Расчет средней интенсивности фона, обрезанные области интереса. «Меню: анализ > измерения.»
  7. Вычтите средней интенсивности фонового изображения, содержащие области интереса. «Процесс > изображение калькулятор > вычесть.»
  8. Выполните вычисление автокорреляции. Этот расчет, содержится в структуре меню: «процесс > FTT > FD математике.»
    1. В математике FD диалоговое окно выберите: изображение 1: обрезанное изображение имя, операции как корреляции, изображение 2: имя обрезанное изображения, обратное преобразование.
  9. Нормализовать полученный образ путем деления на общее количество пикселей. «Меню: процесс > математика > разделить...» (например: 64 x 64 пикселей = 4096)
  10. Нормализовать снова путем деления средней интенсивности нормированного обрезанные области квадрат. «Меню: процесс > математика > разделить...»
    Примечание: Это может быть достигнуто путем деления изображения значение средней интенсивности дважды.
  11. Нарисуйте линию через точку распространения функция.
  12. Участок профиль этой линии, чтобы вычислить максимальное значение. «Меню: анализ > участок профиля.»
  13. Рассчитать кластеров на площади пучка путем передачи пиковое значение (результат 5.12) в электронную таблицу и выполните следующие вычисления (Eq 6):
    figure-protocol-1

6. Пакетная обработка ICS наборов данных

Примечание: Создание макроса Фиджи/ImageJ рекомендуется повторить описанные в протоколе выше. Это позволяет для последовательного и быстрого анализа нескольких файлов изображений во время анализа спектроскопии корреляции изображений.

  1. Создание рабочего процесса ICS макрос путем записи каждой команды меню в протоколе ICS
    «Меню: Плагины > Макрос > запись...».
  2. Выберите «Создать» для создания макросов.
  3. Выберите пункт «язык > макрос IJ1.»
  4. Сохраните макрос.
  5. Различные шаги макроса, обеспечивая напоминания для операторов каждой функции добавьте диалоговые окна. Диалоговые окна также служить в качестве метода для приостановки процесса анализа для нужные до дальнейшей обработки (то есть, регион для обрезки)
    1. Коде диалогового окна Макрос
      Название = «Заголовок диалогового окна»;
      MSG = «Диалоговое окно Box/протокол шаг сообщение»;
      waitForUser (название, msg);
      Примечание: Дополнительная эффективность может устанавливаться, подписавшись на сайт обновления бар в Фиджи Updater (инструкции по https://imagej.net/BAR). Это обеспечивает Фиджи с «коллекция широко применимых процедур» 14. Одна такая процедура является найти пиков. Структура меню: «бар > анализ данных > найти пиков.» Этот сценарий предоставляет быстрый средства из расчета, что пиковое значение в профиле точки распространения функция.

7. протокол расширения: Расчет луч области микроскопа

Примечание: Функция оптической передачи микроскопа гарантирует, что даже молекулярного размера объектов отображаются в виде изображений с радиусом около 200-300 Нм в плоскости x-y. Протокол ICS позволяет определение точки распространения функция, выполнив шаги 4-5 на флуоресцентные бусины подпункта резолюции. В частности:

  1. Смонтировать подпункта резолюции (т.е. < диаметр 100 Нм) флуоресцентных бус на 8 камерные изображений слайд.
  2. Бисер изображения в соответствии с описанной протокол, с помощью конфокального микроскопа, использовали для экспериментов ICS.
  3. Вычислите функцию ICS из результирующего изображения в соответствии с протоколом шаги 5.1-5.13.
  4. Из печати профиля Вычислить радиус луча (r) как полную ширину на половину максимального значения функцией ICS.
  5. Вычислите площадь пучка (BA) (Eq 7):figure-protocol-2

8. протокол расширения: Расчет кластеров на единицу площади

  1. Вычислить плотность кластера (CD) на единицу площади (Eq 8):
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  2. Разделите кластеры на площади луч (результат 5.13) площадь пучка (результат 7.5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперимент спектроскопии корреляции успешный изображения зависит от надлежащего применения контроля лечения. Эти группы лечения включают изучение флуоресценции в не основное антитело и группы лечения не вторичное антитело. После настройки оптимального Конфокальная лазерная устанавливаются для эксперимента, изображения должны быть захвачены этих групп управления, чтобы подтвердить отсутствие неспецифических флуоресценции в образце. Для многих адэрентных рак клеточных линий выявление облас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод спектроскопии корреляции изображения (ICS), что мы описываем в этот протокол использует стандартные конфокальные микроскопы без необходимости специализированные детекторы. ICS метод, описанный использует методы устоявшихся immunocytochemistry для обеспечения быстрого отбора нескольких условий лечения для увеличения статистического анализа. Эта методология делает это с небольшим снижением абсолютной точностью по сравнению с альтернативными одной молекулы методы, основанные на корреляции флуоресценции колебания молек...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндрю Скотт M имеет исследований финансовой поддержки от AbbVie Фармацевтика, EMD Сероно и Даиичи-Санкё Co и консультации и владение акциями фармацевтических наук о жизни. Авторы не имеют других соответствующих принадлежность или финансового участия какой-либо организации или лица с финансовой заинтересованности в или финансовый конфликт с предмета или обсуждались в рукописи помимо указанных материалов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, что финансовая поддержка от NHMRC (1084178 стипендий и грантов 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), рак Австралии, Людвиг раковых исследований, Джон Рид T надеется, Фонд рака мозга лечение, Ла Троуб и рак агентство Виктория. Финансирование от оперативной программы поддержки инфраструктуры, предоставленного правительством викторианской, Австралия также признается.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 лунокThermoFisher Scientific155409
DPBS, без кальция, без магнияThermoFisher Scientific14190144
Фетальная бычья сывороткаThermoFisher Scientific10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), без фенола красногоThermoFisher Scientific12604021
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)ThermoFisher Scientific15140122
GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific35050061
козье античеловеческое IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11013
TetraSpeck Флуоресцентные микросферные стандарты 0,1&микро; mThermoFisher ScientificT7279
CetuximabMerck Serono3023715501
Парапленка M 38мx100ммMerck MilliporeBRND701605
16% Параформальдегид (формальдегид) водный растворProSciTechC004
Рекомбинантный человеческий EGF R& Система D236-EG

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14(2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801(2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7(2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fluorescent ImmunocytochemistryEGF Receptor ClusteringPoint Spread Function AnalysisFiji ImageJ ProcessingA431 Epidermoid Carcinoma CellsSpatial Intensity QuantificationBeam Area Measurement

Похожие статьи