Method Article

Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay

DOI:

10.3791/57183

⸱

April 12th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Huashan Hospital, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот документ представляет собой всеобъемлющую процедуру для оценки в vitro классические опухоли ангиогенеза существует ли в гемангиобластомы (ХБС) и его роль в ОБД. Результаты подчеркивают сложность HB-неоваскуляризации и предполагают, что эта распространенная форма по ангиогенез только дополнительный механизм в HB-неоваскуляризации.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инактивации ген-супрессор опухолевого фон Хиппель-Линдау (ВХЛ) играет решающую роль в развитии гемангиобластомы (ХБС) внутри человека центральной нервной системы (ЦНС). Однако цитологические происхождения и процесс эволюции HBs (включая неоваскуляризация) остаются спорными, и анти ангиогенеза для ВХЛ-HBs, основанный на классической HB ангиогенеза, дали неутешительные результаты в клинических испытаниях. Одним из основных препятствий для успешной клинической перевод анти сосудистой лечения является отсутствие глубокого понимания неоваскуляризация в этом сосудистые опухоли. В этой статье мы представляем всеобъемлющей процедуры для оценки в vitro классические опухоли ангиогенеза существует ли в ОБД, а также его роль в ОБД. С этой процедурой исследователи могут точно понять сложность HB неоваскуляризации и определить функции этой распространенной формой ангиогенеза в ОБД. Эти протоколы могут использоваться для оценки наиболее перспективных анти сосудистой терапии опухолей, который имеет высокий трансляционная потенциал для лечения опухоли либо пособничество в оптимизации лечения анти ангиогенных HBs в будущем переводы. Результаты подчеркивают сложность HB неоваскуляризации и предположить, что это общие формы ангиогенез-это только дополнительный механизм в HB неоваскуляризации.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гемангиобластомы (ХБС) являются доброкачественные сосудистые опухоли, которые находятся исключительно в пределах человека центральной нервной системы (ЦНС). Они развиваются в больных с фон Хиппель-Линдау (ВХЛ) болезни или спорадические поражений. ВХЛ-HBs трудно вылечить путем хирургического лечения из-за частого повторения и несколько поражений, которые в результате этого генетические расстройства1. Хотя инактивации ген-супрессор опухолевого ВХЛ рассмотрел причины tumorigenesis ВХЛ-HBs, цитологические происхождения (включая неоваскуляризация) и эволюционного процесса HBs остаются во многом спорные2. Поэтому лучшее понимание биологических механизмов HB-неоваскулярной может дать полезную информацию в наиболее перспективных анти сосудистой стратегии для ВХЛ-HBs.

Недавние исследования показали, что HB-неоваскуляризация похож на эмбриологических vasculogenesis3,4,5. Классический Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)-опосредованной ангиогенеза, возникла из эндотелия и что движет ВХЛ потеря функции привело к распространению и формирование неоваскулярной, которая была оспорена6. В 1965 году, Cancilla и Циммерман найдена, с помощью электронной микроскопии, что ХБС возникла из эндотелия7. Позже было установлено, что стромальных клеток являются производными от vasoformative элемент8. В 1982 году Jurco et al. обнаружил, что стромальных клеток эндотелия происхождения9. Таким образом мы предположили, что человеческого сосудистой эндотелиальные клетки являются оригинальные клетки HB-неоваскуляризация10. Хотя это лучше использовать основной культуры от HB клеток, полученных от пациентов хирургии ВХЛ, наши предыдущие исследования указал, что основной культуры от HB не являются стабильными и клеточных линий не может быть установленным3. Кроме того основных культур в 3D среде не может опознать цитологического происхождения HB-неоваскуляризация потому, что они включают в себя родоначальниками HB-сосудистой ингредиенты10,11. Таким образом, как примитивные и классическая модель эндотелиальных клеток клеток человека сосудистого эндотелия (HUVEC) может служить альтернативной сотовой модели для HBs.

Прорастания пробирного сфероида представляет собой новую модель в ткани, инженерных12,13. В этом документе, 3D на основе коллагена coculture системы в пробирке с помощью сфероида прорастания пробирного была разработана, с общей целью оценить классические опухоли ангиогенеза существует ли в ОБД, а также его роль в ОБД.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод был проведен в соответствии с утвержденными руководящими принципами и положениями исследовательской этики Комитета из Хуашань больницы, Университет Фудань. Соответствующий стандарт безопасности меры соблюдались в каждом шаге. Для схематического представления пожалуйста, обратитесь к рис.

1. клетки культуры и плазмидные конструкции

  1. Постоянно поддерживать человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVEC) в Дульбекко модифицированная орла среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 единицы/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненные 5% CO2 инкубатора в 37 ° C.
  2. Дайджест PLKO.1 плазмиду с ApaI и EcoRI для синтеза индуцируемый фрагмента. Убедитесь, что последовательности олигонуклеотида ВХЛ индуцируемый вектора CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.
  3. Затем смешайте 20 µΜ системы с вперед 5 мкл oligo, 5 мкл обратный oligo, 5 мкл 10 x буфер НЭБ и 35 мкл ddH2O вместе (общий объем-50 мкл). Нагрейте смесь на 98 ° С в течение 4 мин и медленно остыть до комнатной температуры в течение нескольких часов.
  4. Перевязать отожженная oligos и PLKO.1 плазмиды вместе с T4 лигаза на 4 ° C для ночлега. 16 h позже, 5 мкл лигирование смеси в 25 мкл компетентным DH5α клетки. Затем экран успешно перевязаны плазмид и проверьте вставленного фрагмента путем sequencing.

2. Лентивирусы пакет и инфекции

  1. В общей сложности Смешайте 10 мкг PLKO.1-shVHL или PLKO.1-shScramble вектора, 7.5 мкг упаковки плазмида psPAX2 и 2,5 мкг конверт плазмида pMD2.G в 500 мкл DMEM СМИ без плода бычьим сывороточным (ФБС) 25 мин.
  2. Добавьте в раствор, приготовленный выше 7 mLDMEM без FBS.
  3. Культура клетки 293FT в среде DMEM без FBS в блюдах культуры ткани диаметром 10-см. Убедитесь, что количество клеток 293FT 1 x 107 , используя счетчик соматических клеток.
  4. Добавьте 1 мл раствора, подготовленный выше средний 293FT клеток для transfection.
    Примечание: Клеточная линия 293FT является производным от линии клеток 293F и стабильно Экспресс SV40 большой T антигена. Таким образом это подходящий хост для лентивирусные производства.
  5. Заменить культурной среде DMEM, содержащие 10% FBS через 6 ч.
  6. Сбор средств массовой информации, с помощью пипетки на 48 ч после transfection.
    Примечание: Этот вирус существует в среде DMEM, содержащие 10% FBS. Мертвые клетки плавать на носителе. Используйте 0,45 мкм стерильным мембраны для фильтрации ороговевшие клетки и загрязнения. Как правило нет необходимости для проверки кратности инфекции (МВД). Это заключается в создании стабильной клеток линии. На последнем шаге все живые клетки без успешного инфекции умирают по puromycin. ShScramble группы и клеток HUVEC являются контрольной группы. Убедитесь, что все клеток HUVEC умереть с концентрацией используемых puromycin 72 ч. Каждый хорошо имеет такое же количество клеток.
  7. Культура клеток HUVEC в лентивирусные СМИ за 72 ч. Затем добавьте puromycin к средствам массовой информации клеток HUVEC в концентрации 2 мкг/мл в течение 24 ч. Использование HUVEC клетки без какого-либо лечения как в контрольной группе. Убедитесь, что все управления клетки умирают на этот раз.
    Примечание: Живые клетки представляют собой стабильный клеток линии ВХЛ нокдаун клеток и shSramble клеток. Плотность покрытия 5000/хорошо в 96-луночных пластины.

3. поколение сфероидов эндотелиальных клеток

  1. Trypsinize HUVECs клеток и Ресуспензируйте в среде DMEM с 10% FBS. С умеренным количеством клеток в культуре 10 см блюдо добавьте 1 мл typsin-ЭДТА.
  2. Заполнение ячеек в 3D раунд-96-луночных днище, на плотность клеток 1 × 103 клеток/скважины. Использование колодца, который может вместить сфероиде 0,50 мкл приостановить сфероида. Подсчет количества ячеек с помощью счетчика системы клеток следуя инструкциям производителя.
  3. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2 непрерывно в течение 72 ч. В этих условиях убедитесь, что подвесной клетки образуют сфероидов ячейки автоматически. Замените половину из питательной среды после 36 часов.

4. в vitro Assay ангиогенеза

  1. Оттепель решения гелем на 4 ° C и разбавить его с сокращение сыворотке среднего на коэффициент разбавления 1:5.
  2. Сосать сфероидов от DMEM питательной среды с микропипеткой. После мытья сфероидов с 5 мл среды, сокращение сыворотке, приостановить сфероидов мягко и осторожно в разреженных геля. Убедитесь, что нет пузырьков воздуха.
  3. Внедрите 300 мкл смешанной жидкости в пластине 15-хорошо. После инкубации при 37 ° C и 5% CO2 за 1 ч мкл 400 сокращение сыворотке среднего для каждой скважины. Заполните стерильной воды вокруг лунки для создания увлажненной среде затрудняет испарение.
  4. После этого культура пластины при 37 ° C в 5% CO2 при влажности до 100% за 1 ч.
  5. Тщательно аспирационная старый среднего и заменить его 600 мкл сокращение сыворотке среды с 1% добавки рост эндотелиальных клеток в каждой скважине.
  6. После 12 ч или 24 ч, принимать изображения под Перевернутый световой микроскоп (40 *).

5. анализ данных

  1. Загрузите изображения на платформу анализа изображений в Интернете для получения рассады длина данных (Таблица материалов).
  2. На веб-странице Создайте учетную запись по электронной почте.
  3. Затем загрузите изображения, нажав кнопку Загрузить.
  4. Скачайте результат, нажав кнопку Загрузить.
    Примечание: Программное обеспечение будет генерировать обработанные изображения и данные. Данные содержат пять частей: Накопительное Росток, длина средняя Росток, стандартное отклонение длины Росток, прорастают зона и зона сфероида. Обработанные изображения, каждый параметр изложена в другой цвет для облегчения идентификации обработанные изображения: красный представляет ростки скелета, желтый количество побегов, синий структура прорастают, конец белый прорастают и оранжевый сфероида.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исходные изображения принимаются Перевернутый световой микроскоп. Типичный изображения ВХЛ группы и группы управления показаны на рисунке 2-A1 и 2-A2. Прорастания длина контрольной группы короче, чем в группе ВХЛ.

После загрузки изображений, онлайн платформа предоставляет результаты анализа непосредственно. Вывод состоит из двух частей:...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно несколько полей сосудистая биология исследований были простимулированы изучение ангиогенных эндотелия15. В этой статье, мы разработали эндотелиальной сфероида прорастания техника как экспериментальная модель для изучения формирования судна, что происходит от гена ВХЛ потеря функции в манипулировать эндотелиальные клетки для выявления роман кандидат молекул ангиогенных Каскад. Насколько нам известно это первый доклад для изучения эффектов ангиогенных эндогенная модифицированных эндотелиальн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана от грантов от шанхайского комитета по науке и технике (15411951800, 15410723200). Авторы хотели бы поблагодарить профессора YuMei Вэнь и профессор Chao Чжао патогенного микроорганизма Департамента Фуданьский университет для их технической помощи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
эндотелиальная клетка пупочной венычеловека Fudan IBS Cell CenterFDCC-HXN180
dulbecco' s модифицированный орел» s medium Gibco11995040
фетальная бычья сывороткаGibco 
PLKO.1-puro векторAddgene#8453
упаковка плазмиды psPAX2 Addgene#12260
конверт плазмида pMD2.GAddgene#12259
3D круглодонный 96-луночные планшетыS-BioMS-9096M
matrigelBD Biosciences354234
среда Opti-MEMGibco31985-070восстановленная сыворотка среда 
15-луночный планшетIbidi81501Пузырьки воздуха в геле могут быть уменьшены путем уравновешивания μ – Слайд ангиогенез перед использованием внутри инкубатора на ночь
добавки для роста эндотелиальных клетокSciencell#1052
10-см чашка для культурыCorningScipu000813
PuromycinGibcoA1113802
typsin-EDTAGibco25200056
автоматизированная система счетчика клеток  Программное обеспечение для анализа биотехнологических
изображений Винмасисhttp://mywim.wimasis.com 
26400044

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
  2. Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
  3. Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
  4. Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102(2014).
  5. Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
  6. Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
  7. Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
  8. Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
  9. Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
  10. Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
  11. Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
  12. Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
  13. Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
  14. Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
  15. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  16. D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).
  17. Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
  18. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
  19. Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019(2014).
  20. Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
  21. Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
  22. Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
  23. Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
  24. Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
  25. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemangioblastoma NeovascularizationSpheroid Sprouting AssayVHL Gene SilencingEndothelial Cell CultureLentiviral Vector TransfectionHUVEC Cell LineSprout Length AnalysisIn Vitro AngiogenesisTumor VasculogenesisCapillary Formation Assay

Related Articles