Здесь мы приводим простой и недорогой Серебряный пятнать протокол, который требует только три реагентов и 7 минут обработки и подходит для быстрого поколения высокого качества данных ССР в генетический анализ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Просто повторить последовательность (ССР) является одним из наиболее эффективных маркеров, используемые в растительных и животных генетических исследований и молекулярных селекционных программ. Серебряный пятнать это широко используемый метод для обнаружения маркеров ССР в геле полиакриламида. Однако обычные протоколы для Серебряные пятная технически сложных и трудоемких. Как многие другие биологические лаборатории методики, Серебряные пятная протоколы неуклонно оптимизирован для повышения эффективности обнаружения. Здесь мы приводим упрощенная Серебряный пятнать метод, который существенно снижает затраты реагента и обнаружения резолюции и картина усиливает. Новый метод требует два важных шага (пропитка и развития) и три реагентов (нитрата серебра, гидроксид натрия и формальдегид) и только в 7 мин обработки для не Денатурирующий гель полиакриламида. По сравнению с ранее сообщалось протоколов, этот новый метод проще, быстрее и использует меньше химических реагентов для обнаружения ССР. Таким образом этот простых, недорогостоящих и эффективных Серебряный пятнать протокол выиграют генетическое картирование и селекции Селекция с помощью маркеров путем быстрого поколения ССР маркер данных.
Введение
Развитие на основе ПЦР маркеров революционизировало наука генетики растений и разведения1. Среди наиболее часто используемые и наиболее универсальным ДНК маркеров простой последовательности повторить (ССР) маркеры. Их генома широкое освещение, изобилие, специфика генома и повторяемости являются некоторые из достоинств ССР маркеров в дополнение к их кодоминантного наследования для обнаружения гетерозиготных генотипов2. Несколько исследований использовали ССР маркеры для изучения генетического разнообразия, отслеживать родословную, построить генетическая связь карт и карта гены для экономически важных черт
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка продуктов ПЦР маркеров SSR
- Подготовка всех химических веществ и реактивов для ПЦР-реакции, включая шаблон ДНК (30 нг/мкл), 2 × ПЦР главный микс (содержащие 2 × буфер ПЦР, 0,4 мм каждого dNTP, 3 мм MgCl2, 0.1 U/мкл полимеразы дна Taq и красители), 10 мкм каждого вперед и назад грунтовки и дистиллированной или деионизированной воды (dH2O).
Примечание: ССР маркеров, используемые в настоящем исследовании были PT51333 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' и последовательность обратная грунтовка: 5 «- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3») и PT50903 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - AAATTTCT....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ампликонов PCR были произведены с использованием соответствующих пар грунтовка ССР в цветущий китайская капуста и табак. После электрофореза полиакриламидные гели были пятнами, с использованием выше Серебряный пятнать протокол, который однозначно обнаружен диапазонов моделей ССР маркеров (рис. 1).
Сравнить эффективность обнаружения различных Серебряные пятная протоколы, продукты PCR маркеров ССР в т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Стиральной гель после пропитки является важным шагом. Объем времени и воды недостаточно Стиральная может привести к неполному удалению пропитки решения на поверхности пластины и гель и привести в темном фоне. Соответствующее время развивающихся является еще одним ключевым шагом, чрезмерного развития может привести к темно коричневый фон с низкой контрастностью изображения фрагментов ДНК. Кроме того пропитка шаг значительно влияет на окрашивание эффективность фрагментов ДНК. Хотя расширение время пропитки более 5 мин или .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа финансировалась фонд естественных наук Гуандун Китая (2015A030313500), провинциальные ключ международного кооперативного исследовательская платформа и крупные научно исследовательский проект Гуандун высшего образования (2015KGJHZ015), Наука и Технология план администрации монополии табака Гуандун (201403, 201705), науки и технологии план Гуандун Китая (2016B020201001), национальной инновационной учебного проекта для студентов (201711078001). Упоминание названия торговых или коммерческих продуктов в данной публикации исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Министерством сельского хозяйства. USD....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Мастер-микс для ПЦР (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, Китай | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, США | #170-8200 | |
| DL500 ДНК-маркер | Takara Bio Inc., Япония#3590A | ||
| база Tris | Sangon Biotech Шанхай, Китай | #77-86-1 | |
| Борная кислота | Sangon Biotech Шанхай, Китай | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, Китай | #6381-92-6 | |
| Акриламид | Sangon Biotech Шанхай, Китай | #79-06-1 | |
| N,N'-метилен-бис-акриламид | Sangon Biotech Шанхай, Китай | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин | Sangon Biotech Шанхай, Китай | #110-18-9 | |
| Завод химических реактивов персульфата аммония | Гуанчжоу, Китай | #7727-54-0 | |
| Связующий силан | Solarbio Пекин, Китай#B8150 | ||
| AgNO3Sinopharm | Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Китай | #7761-88-8 | |
| Формальдегид | Тяньцзиньский завод химических реактивов DaMao, Китай | #50-00-0 | |
| Завод химических реактивов NaOH в Гуанчжоу, Китай | # 1310-73-2 | ||
| Уксусная кислота | в Гуанчжоу, Китай | # 64-19-7 | |
| Na2< /sub>CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Китай | # 497-19-8 | |
| Ethanol | в Гуанчжоу, Китай | # 64-17-5 | |
| HNO< sub>3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, Китай | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, Китай | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Китай | #1787-61-7 | |
| Пластиковый поднос | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, | Китай-TS-1 | |
| Шейкер | Qilinbeter JiangSu, | Китай-BenQ | |
| M800 Сканер | BenQ, | ||
| Источник питания | Beijing Liuyi Instrument Factory, | Китай-Высокий | |
| вертикальные гелевые системы, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Китай |
Ссылки
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
