Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

Summary

Здесь мы приводим простой и недорогой Серебряный пятнать протокол, который требует только три реагентов и 7 минут обработки и подходит для быстрого поколения высокого качества данных ССР в генетический анализ.

Abstract

Просто повторить последовательность (ССР) является одним из наиболее эффективных маркеров, используемые в растительных и животных генетических исследований и молекулярных селекционных программ. Серебряный пятнать это широко используемый метод для обнаружения маркеров ССР в геле полиакриламида. Однако обычные протоколы для Серебряные пятная технически сложных и трудоемких. Как многие другие биологические лаборатории методики, Серебряные пятная протоколы неуклонно оптимизирован для повышения эффективности обнаружения. Здесь мы приводим упрощенная Серебряный пятнать метод, который существенно снижает затраты реагента и обнаружения резолюции и картина усиливает. Новый метод требует два важных шага (пропитка и развития) и три реагентов (нитрата серебра, гидроксид натрия и формальдегид) и только в 7 мин обработки для не Денатурирующий гель полиакриламида. По сравнению с ранее сообщалось протоколов, этот новый метод проще, быстрее и использует меньше химических реагентов для обнаружения ССР. Таким образом этот простых, недорогостоящих и эффективных Серебряный пятнать протокол выиграют генетическое картирование и селекции Селекция с помощью маркеров путем быстрого поколения ССР маркер данных.

Introduction

Развитие на основе ПЦР маркеров революционизировало наука генетики растений и разведения¹. Среди наиболее часто используемые и наиболее универсальным ДНК маркеров простой последовательности повторить (ССР) маркеры. Их генома широкое освещение, изобилие, специфика генома и повторяемости являются некоторые из достоинств ССР маркеров в дополнение к их кодоминантного наследования для обнаружения гетерозиготных генотипов². Несколько исследований использовали ССР маркеры для изучения генетического разнообразия, отслеживать родословную, построить генетическая связь карт и карта гены для экономически важных черт

Protocol

1. Подготовка продуктов ПЦР маркеров SSR

1. Подготовка всех химических веществ и реактивов для ПЦР-реакции, включая шаблон ДНК (30 нг/мкл), 2 × ПЦР главный микс (содержащие 2 × буфер ПЦР, 0,4 мм каждого dNTP, 3 мм MgCl₂, 0.1 U/мкл полимеразы дна Taq и красители), 10 мкм каждого вперед и назад грунтовки и дистиллированной или деионизированной воды (dH₂O).
   Примечание: ССР маркеров, используемые в настоящем исследовании были PT51333 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' и последовательность обратная грунтовка: 5 «- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3») и PT50903 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - AAATTTCT....

Results

Ампликонов PCR были произведены с использованием соответствующих пар грунтовка ССР в цветущий китайская капуста и табак. После электрофореза полиакриламидные гели были пятнами, с использованием выше Серебряный пятнать протокол, который однозначно обнаружен диапазонов моделей ССР маркеров (рис. 1).

Сравнить эффективность обнаружения различных Серебряные пятная протоколы, продукты PCR маркеров ССР в т.......

Discussion

Стиральной гель после пропитки является важным шагом. Объем времени и воды недостаточно Стиральная может привести к неполному удалению пропитки решения на поверхности пластины и гель и привести в темном фоне. Соответствующее время развивающихся является еще одним ключевым шагом, чрезмерного развития может привести к темно коричневый фон с низкой контрастностью изображения фрагментов ДНК. Кроме того пропитка шаг значительно влияет на окрашивание эффективность фрагментов ДНК. Хотя расширение время пропитки более 5 мин или .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Мастер-микс для ПЦР (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, Китай	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, США	#170-8200
DL500 ДНК-маркер	Takara Bio Inc., Япония#3590A
база Tris	Sangon Biotech Шанхай, Китай	#77-86-1
Борная кислота	Sangon Biotech Шанхай, Китай	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, Китай	#6381-92-6
Акриламид	Sangon Biotech Шанхай, Китай	#79-06-1
N,N'-метилен-бис-акриламид	Sangon Biotech Шанхай, Китай	#110-26-9
N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин	Sangon Biotech Шанхай, Китай	#110-18-9
Завод химических реактивов персульфата аммония	Гуанчжоу, Китай	#7727-54-0
Связующий силан	Solarbio Пекин, Китай#B8150
AgNO3Sinopharm	Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Китай	#7761-88-8
Формальдегид	Тяньцзиньский завод химических реактивов DaMao, Китай	#50-00-0
	Завод химических реактивов NaOH в Гуанчжоу, Китай	# 1310-73-2
Уксусная кислота	в Гуанчжоу, Китай	# 64-19-7
Na2< /sub>CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Китай	# 497-19-8
Ethanol	в Гуанчжоу, Китай	# 64-17-5
HNO< sub>3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, Китай	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, Китай	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Китай	#1787-61-7
Пластиковый поднос	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,	Китай-TS-1
Шейкер	Qilinbeter JiangSu,	Китай-BenQ
M800 Сканер	BenQ,
Источник питания	Beijing Liuyi Instrument Factory,	Китай-Высокий
вертикальные гелевые системы, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Китай