Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57192

⸱

20 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Guangzhou University, 2Hard Winter Wheat Genetics Research Unit, United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service, 3The UWA Institute of Agriculture, University of Western Australia

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим простой и недорогой Серебряный пятнать протокол, который требует только три реагентов и 7 минут обработки и подходит для быстрого поколения высокого качества данных ССР в генетический анализ.

Аннотация

Просто повторить последовательность (ССР) является одним из наиболее эффективных маркеров, используемые в растительных и животных генетических исследований и молекулярных селекционных программ. Серебряный пятнать это широко используемый метод для обнаружения маркеров ССР в геле полиакриламида. Однако обычные протоколы для Серебряные пятная технически сложных и трудоемких. Как многие другие биологические лаборатории методики, Серебряные пятная протоколы неуклонно оптимизирован для повышения эффективности обнаружения. Здесь мы приводим упрощенная Серебряный пятнать метод, который существенно снижает затраты реагента и обнаружения резолюции и картина усиливает. Новый метод требует два важных шага (пропитка и развития) и три реагентов (нитрата серебра, гидроксид натрия и формальдегид) и только в 7 мин обработки для не Денатурирующий гель полиакриламида. По сравнению с ранее сообщалось протоколов, этот новый метод проще, быстрее и использует меньше химических реагентов для обнаружения ССР. Таким образом этот простых, недорогостоящих и эффективных Серебряный пятнать протокол выиграют генетическое картирование и селекции Селекция с помощью маркеров путем быстрого поколения ССР маркер данных.

Введение

Развитие на основе ПЦР маркеров революционизировало наука генетики растений и разведения1. Среди наиболее часто используемые и наиболее универсальным ДНК маркеров простой последовательности повторить (ССР) маркеры. Их генома широкое освещение, изобилие, специфика генома и повторяемости являются некоторые из достоинств ССР маркеров в дополнение к их кодоминантного наследования для обнаружения гетерозиготных генотипов2. Несколько исследований использовали ССР маркеры для изучения генетического разнообразия, отслеживать родословную, построить генетическая связь карт и карта гены для экономически важных черт3,4.

Продукты PCR маркеров SSR обычно разделяются с помощью электрофореза агарозы или геля полиакриламида и затем визуализируется с Серебряный пятнать или под УФ света после окрашивания бромидом ethidium. Серебряный пятнать фрагментов ДНК в полиакриламидных гелей более чувствительны, чем другие пятная методы5,6 и широко используется для обнаружения фрагментов ДНК как ССР маркеры7.

Как много методов биологической лаборатории серебро Окрашивание акриламидных гелей неуклонно улучшилось после ее первых сообщанными как метод визуализации фрагмента в 1979 году8. Техника первоначально была изменена для обнаружения фрагментов ДНК Бассам и др. 6 в 1991 году и затем улучшить Сангинетти и coworkers9 в 1994 году. Метод был оптимизирован в последние несколько десятилетий6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Однако, большинство этих обновленных версий протоколов до сих пор некоторые недостатки, такие как высокий спрос технических и долго время для фиксации обработки и монтажа6, которые ограничивают применение этих протоколов7, 11. Это оптимальный протокол, который сочетает в себе лоу кост с высокой эффективностью обнаружения фрагментов ДНК срочно необходима для обычного применения Серебряный пятнать в биологических исследованиях.

Кроме того гель полиакриламида можно подразделить денатурируя и не денатурации полиакриламидные гели, и оба могут быть использованы для обнаружения маркеров SSR с помощью Серебряный пятнать метод. Эффект и разрешение которых существенно не отличается, но не денатурации полиакриламидных гелей проще процесс и занять меньше времени16.

На основе предыдущих исследований15целью настоящего исследования является описать оптимизированный Серебряный пятнать протокол в деталях для быстро, просто и лоу кост обнаружения маркеров SSR-Денатурирующий гель полиакриламида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка продуктов ПЦР маркеров SSR

  1. Подготовка всех химических веществ и реактивов для ПЦР-реакции, включая шаблон ДНК (30 нг/мкл), 2 × ПЦР главный микс (содержащие 2 × буфер ПЦР, 0,4 мм каждого dNTP, 3 мм MgCl2, 0.1 U/мкл полимеразы дна Taq и красители), 10 мкм каждого вперед и назад грунтовки и дистиллированной или деионизированной воды (dH2O).
    Примечание: ССР маркеров, используемые в настоящем исследовании были PT51333 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' и последовательность обратная грунтовка: 5 «- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3») и PT50903 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' и обратной последовательности грунтовка: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') для табака и CX-43 (вперед грунтовка последовательности: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' и обратить вспять грунтовка последовательности: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') и CX-157 (вперед грунтовка последовательности: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' и обратной последовательности грунтовка: 5 «- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3») для цветения китайская капуста.
  2. Подготовка 10 мкл смеси ПЦР для амплификации, добавив 2 мкл шаблона ДНК, 5 мкл 2 × ПЦР Мастер микс, 0.2 мкл каждого вперед грунтовка и обратный грунтовка и 2.6 мкл dH2O.
  3. Выполняют реакции амплификации PCR в Термоциклер с начальным шагом 94 ° c за 5 мин, следуют 38 циклов 45 s на 94 ° C для денатурации, 45 s при 55 ° C для отжига праймера и 1 мин при 72 ° C для расширения и окончательное расширение шаг 10 мин при 72 ° C; Затем, храните продукты PCR на 4 ° C для последующего использования.

2. Приготовление растворов для полиакриламидные гели для литья

  1. Подготовка 1 Л, 5 × КЭ буфера, растворяя 54 g Tris база и 27,5 г борной кислоты в dH2O, добавив 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8.0) и регулируя решение окончательное объемом 1 000 мл с dH2O.
    Примечание: TBE буфер может храниться при комнатной температуре для месяцев.
  2. Приготовить 2 Л, 0.5 × КЭ буфера путем добавления 200 мл 5 × КЭ буфера dH2O в окончательный объем 2 Л и хранить при комнатной температуре.
  3. Приготовляют раствор Денатурирующий гель полиакриламида 6%, растворяя 29 g молекулярной биологии класса акриламида и 1 g молекулярной биологии класса N, N'-methylenebisacrylamide в 0,5 буфере TBE × окончательный объемом 500 мл. Обложка решения бутылка с алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C для последующего использования.
    Предупреждение: Акриламид считается мощный нейротоксин и должны быть обработаны с осторожностью. Всегда надевайте перчатки при взвешивании порошок и решения, которые содержат его.
  4. Подготовьте путем растворения 2 g APS с dH2O окончательный объемом 10 мл 20% раствора Аммония пероксодисульфат (APS). Он может храниться при температуре-20 ° C для месяцев.
    Примечание: Для удобства, 10 мл 20% раствора APS может быть aliquoted в 1,5 мл или 2 мл пробирок для хранения при температуре-20 ° C. Размораживание и перемешайте перед использованием.
  5. Приготовляют раствор разреженных bind силана, растворяя 3 мкл bind-силана в 0.997 мл 95% этиловом спирте, содержащий 0,5% уксусной кислоты. Он может храниться при температуре 4 ° C для недель.
    Предупреждение: Bind силана токсичных, надевайте перчатки при работе с решением и держать комнату проветривается.

3. Подготовка полиакриламидных гелей для электрофореза

  1. В водопроводной воде, затем полный полоскания с dH2O. воздух сухой плиты, установив их в тарелку, сушка для мыть один набор стеклянные пластины и прокладки с моющим средством.
  2. Разогнать 1 мл раствора bind силан на внутреннюю поверхность прямоугольной стеклянной пластины и сухой за 5 мин.
    Примечание: Если bind силана решения не распространяется равномерно на поверхности пластины, гель может быть отключена во время окрашивания и привести к неудовлетворительной эффект окрашивания.
  3. Разогнать 1 мл оттолкнуть силан на внутреннюю поверхность зубчатый стеклянной пластины с помощью тампона, стереть избыток оттолкнуть силана с папиросной бумаги и воздух сухой за 5 мин.
    Примечание: Если Отрази силана не равномерно пальто поверхности стеклянной пластины, это может повредить гель, частично зачистки.
  4. Соберите стеклянные пластины с прокладки с зубчатая пластина на вершине и закрепите обе стороны Ассамблеи с литьем зажимы.
  5. Налейте достаточное количество 6%-Денатурирующий гель полиакриламида решения стакан для набора пластина 33 см Ширина × высота 10 см и прокладку толщиной 1,5 мм (40 мл), добавить 20 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) и 200 µLfresh 20% APS и осторожно перемешать.
    Примечание: Соответствующее количество решения гелем (40 мл) была рассчитана из внутреннего объема двух пластин толщиной распорки (30 см × 8,5 × 0,15 см). Что касается количества APS и TEMED полимеризации геля существует стандартное соотношение решения гелем TEMED и APS, основанные на ссылку17. Решения гелем, описанные выше хранится при 4° C. Если решения гелем хранится при комнатной температуре, 20 мкл TEMED и 100 мкл APS должны использоваться на 20%. Аккуратно перемешайте смесь решения гелем с палкой стекла, чтобы избежать воздушных пузырей в решении.
  6. Залейте раствор немедленно и тщательно в собранном стеклянные пластины вдоль края зубчатая пластина, заполнить пространство почти до вершины и вставить гребень. Добавьте небольшой объем решения гелем над гребнем.
    Примечание: Держите стеклянные пластины горизонтально для предотвращения гель от утечки. При необходимости удалите любые пузыри с крюком пузырь.
  7. Разрешить гель для задания на 30 минут при комнатной температуре.
    Примечание: Время полимеризации может измениться с температурой решения гелем и окружающей среды.
  8. После гель полностью полимеризации, снимите зажимы литья и положение пластины набор в танковом подразделении электрофорез с зубчатая пластина, обращенной к верхней буфера водохранилища и использовать большие зажимы для присоединения плита, набор в танковом подразделении.
  9. Залейте 1 Л 0.5 × КЭ буфер, в каждой из верхней и нижней палат. Снимите гребень и тщательно промыть лунки с буфера с помощью шприца или пипетки.
    Примечание: Убедитесь, что гель сэндвич в нижней части пластины полностью замачивают в буфер без каких-либо пузыри.

4. Запуск гели

  1. Загрузите 1 мкл ПЦР продукта в каждой скважине геля полиакриламида. Загрузите размер лестница ДНК для обеих сторон геля вместе с образцами продуктов ПЦР. Зафиксировать крышку безопасности к палате верхнего буфера.
  2. Подключайте к сети питания, соответствующие цветом красный в красный и черный-черный. Побегите гель на постоянное напряжение 110 V, до тех пор, пока краска достигает определенной позиции, обычно на ~ 70 мин.
    Примечание: Время напряжения и работает можно отрегулировать согласно размер продуктов PCR.

5. Серебряный пятнать для обнаружения маркеров ССР в не полиакриламидный гель

  1. После электрофореза Слейте буфер из верхней палаты в большой стакан через клапан. Отсоединить зажимы стороне, удалить пластины из аппарата, тщательно отделить зубчатый стеклянной пластины вдоль одной стороны с помощью шпателя и убедитесь, что остатки геля прилагается к стеклянной пластине покрытием с bind силана.
  2. Сделать 1 Л раствора свежие пропитки, растворяя 1.5 g AgNO3 в 1 Л dH2O. подготовить 1 Л раствора свежие разработки, растворяя 10 г NaOH в 900 мл dH2O, добавляют 1 мл 37% формальдегида и приспособиться к конечный объем 1 Л, с использованием dH2O.
    Примечание: Надевайте перчатки и обрабатывать выше химических продуктов и решений с осторожностью. Нет необходимости поддерживать решения и соответствующие шаги с решениями в темноте.
  3. Тщательно промойте гель и стеклянной пластины с достаточно dH2O удалить буфер электрофореза, а затем установите пластину с гелем вверх на пластиковый лоток и погружать гель в 1 Л раствора пропитки. Поставьте лоток в шейкере.
  4. Слегка встряхните лоток 60 r/мин для 3-4 мин.
    Примечание: Время встряхивания можно отрегулировать согласно толщины геля и концентрация нитрата серебра в растворе пропитки.
  5. Переместить пластину из раствора пропитки и положил его на другой лоток. Промойте остаточного пропитки решение покинуть от поверхности пластины и гель, с помощью достаточно dH2O дважды для 3-5 s.
  6. Установите пластину с гелем вверх на другой лоток, опускайте пластины в 1 Л раствора развития, затем осторожно встряхнуть лоток в 50 r/мин ~ 3 мин монитор, внешний вид ДНК фрагментов и остановить развитие, когда самый высокий коэффициент сигнал ДНК фрагментов шума фона наблюдается (этот шаг занимает ~ 3 мин).
  7. Промойте пластины и гель с достаточно dH2O дважды и сухой пластину гель с папиросной бумаги.
  8. Сканировать гель, используя соответствующие сканера. Разрешение 300 dpi дает четкие визуализации фрагментов ДНК. Гель также могут быть сфотографированы с помощью камеры.
  9. Кромконаносящий шаблон ССР маркеров может быть забит на основе фрагментов ДНК в изображении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ампликонов PCR были произведены с использованием соответствующих пар грунтовка ССР в цветущий китайская капуста и табак. После электрофореза полиакриламидные гели были пятнами, с использованием выше Серебряный пятнать протокол, который однозначно обнаружен диапазонов моделей ССР маркеров (рис. 1).

Сравнить эффективность обнаружения различных Серебряные пятная протоколы, продукты PCR маркеров ССР в т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стиральной гель после пропитки является важным шагом. Объем времени и воды недостаточно Стиральная может привести к неполному удалению пропитки решения на поверхности пластины и гель и привести в темном фоне. Соответствующее время развивающихся является еще одним ключевым шагом, чрезмерного развития может привести к темно коричневый фон с низкой контрастностью изображения фрагментов ДНК. Кроме того пропитка шаг значительно влияет на окрашивание эффективность фрагментов ДНК. Хотя расширение время пропитки более 5 мин или ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась фонд естественных наук Гуандун Китая (2015A030313500), провинциальные ключ международного кооперативного исследовательская платформа и крупные научно исследовательский проект Гуандун высшего образования (2015KGJHZ015), Наука и Технология план администрации монополии табака Гуандун (201403, 201705), науки и технологии план Гуандун Китая (2016B020201001), национальной инновационной учебного проекта для студентов (201711078001). Упоминание названия торговых или коммерческих продуктов в данной публикации исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Министерством сельского хозяйства. USDA — равных возможностей поставщика и работодателем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мастер-микс для ПЦР (Green Taq Mix)Vazyme Biotech Co. Ltd, Китай#P131-03
50-2000 bp DNA LadderBio-Rad, США#170-8200
DL500 ДНК-маркерTakara Bio Inc., Япония#3590A
база TrisSangon Biotech Шанхай, Китай#77-86-1
Борная кислотаSangon Biotech Шанхай, Китай#10043-35-3
EDTA-Na2Guangzhou Chemical Reagent Factory, Китай#6381-92-6
АкриламидSangon Biotech Шанхай, Китай#79-06-1
N,N'-метилен-бис-акриламидSangon Biotech Шанхай, Китай#110-26-9
N,N,N',N'-ТетраметилэтилендиаминSangon Biotech Шанхай, Китай#110-18-9
Завод химических реактивов персульфата аммонияГуанчжоу, Китай#7727-54-0
Связующий силанSolarbio Пекин, Китай#B8150
AgNO3SinopharmChemical Reagent Beijing Co., Ltd, Китай#7761-88-8
ФормальдегидТяньцзиньский завод химических реактивов DaMao, Китай#50-00-0
Завод химических реактивов NaOH в Гуанчжоу, Китай# 1310-73-2
Уксусная кислотав Гуанчжоу, Китай# 64-19-7
Na2< /sub>CO3Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Китай# 497-19-8
Ethanolв Гуанчжоу, Китай# 64-17-5
HNO< sub>3Guangzhou Chemical Reagent Factory, Китай#7697-37-2
Na2S2O3.5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, Китай#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Китай#1787-61-7
Пластиковый подносShanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,Китай-TS-1
ШейкерQilinbeter JiangSu,Китай-BenQ
M800 СканерBenQ,
Источник питанияBeijing Liuyi Instrument Factory,Китай-Высокий
вертикальные гелевые системы, JY-SCZFBeijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Китай
в Завод химических реактивовЗавод химических реактивов Китай-DYY-6C

Ссылки

  1. Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
  2. Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
  3. Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
  4. Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
  5. Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
  6. Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
  7. Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
  8. Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
  9. Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
  10. Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
  11. Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
  12. An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
  13. Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
  14. Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
  15. Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
  16. Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
  17. Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Неденатурирующий гельгенетические исследованиядетекция маркеровпроявление путем импрегнациианализ фрагментов ДНКгель-электрофорезхимические реагенты
Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.