Этот протокол обеспечивает обзор процедур для изоляции РНК для профилирования транскриптомики Лимфоузел тканей от крупных животных, включая шаги в процессе идентификации и иссечение лимфоузлов от скота и диких животных, выборки подходы чтобы обеспечить согласованность несколько животных и соображения плюс представитель результаты для сохранения после сбора и обработки для анализа РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сбор и обработка лимфатических узлов от крупных животных для анализа РНК: подготовка исследований транскриптомики Лимфоузел крупных видов животных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Крупные животные (скота и диких животных) служат в качестве важных водохранилищ зоонозными патогенами, включая бруцеллы, Mycobacterium bovis, сальмонеллаи кишечная палочкаи являются полезными для изучения патогенеза и/или распространение бактерий в естественных хостов. С помощью ключевых функции лимфатических узлов в иммунного ответа тканей лимфатических узлов служат потенциальным источником РНК для вниз по течению транскриптомики анализа, для того чтобы оценить временные изменения в экспрессии генов в клетках в течение инфекции. Эта статья содержит обзор процесса лимфатических узлов коллекции, ткани проб и ниже по течению РНК переработки скота, используя крупного рогатого скота (Bos taurus) в качестве модели, с дополнительные примеры из американских бизонов (Бизон, Бизон ). Протокол включает в себя сведения о местонахождении, идентификации и удаления лимфатических узлов из нескольких ключевых узлов в организме. Кроме того методология отбора проб биопсии представлена который позволяет для соответствия выборки через несколько животных. Обсуждаются несколько соображений охраны образцов, включая поколения РНК подходит для вниз по течению методологии как РНК последовательности и RT-PCR. Вследствие длительных задержек, присущих крупных животных против мыши время курса исследований представитель от зубров и говядину Лимфоузел тканей результаты для описания время курс деградации в этом типе ткани, в контексте обзора предыдущие методологической работы по деградации РНК в других тканях. В целом этот протокол будет полезным для обоих ветеринарных исследователей, начиная с транскриптом проекты на больших животных образцы и молекулярные биологи заинтересованы в изучении методов для обработки в пробирке и в естественных условиях выборки ткани.
Введение
РНК последовательности анализа транскриптом лимфатических узлов обеспечивает возможность характеризовать иммунная реакция животных на целый ряд патогенов. Хотя эта методология широко использовались в мышей, анализ недавно расширяется в больших млекопитающих1,2. Скот и крупных животных лимфатические узлы могут использоваться для характеризуют разместить ответы на инфекции, не только для их использования в вакцины или генетической предрасположенности исследований, так и для определения целевых показателей для разработки лекарственных средств, но и как модель системы для человека исследования на зоонозных заболев....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Животных патанатомия процедур, изображен здесь охватываются утвержденных IACUC протоколов в национальном центре болезни животных, Эймс, НМА. Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами для ухода за животными и благополучия.
1. Предварительное планирование перед патанатомия
- Перед вскрытие Подготовьте следующие материалы для транспортировки патанатомия люкс:
- 1.5 или 2 мл microcentrifuge трубы заполнены с ~ 1,0 мл раствора сохранение РНК, в стойку или транспортного контейнера. Обязательно следуйте рекомендациям производителя соотношение объема раствора сохранения объема ткани.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование соображений, представленных в этой статье (шаги 1-4 протокола) поможет в восстановлении РНК от крупных животных образцы, подходит для вниз по течению анализа в исследованиях выражение гена хоста. Несколько стандартных мер оценивается качество РНК в нисходящие приложения. Спектрофотометрия соотношение280 /A260A обеспечивает измерение загрязнения белка, и коэффициент230 260/a A предоставляет другой способ оценки чистоты, который определит химических загрязнителей, т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Большинство транскриптомики исследований и связанных с ними протоколов сосредоточиться на мыши, крысы или post-mortem образцах. Однако исследования на домашний скот и диких животных предоставляют широкий спектр возможностей для характеризации иммунной реакции на болезни, как применимые к ветеринарной медицины и, что касается зоонозных заболеваний, для человеческого здоровья. Этот протокол предоставляет краткое изложение ключевых соображений для извлечения высокопрочные РНК из тканей от крупных животных, таких, как скот, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть. Все исследования финансируется с очной средств от Департамента сельского хозяйства США, Служба сельскохозяйственных исследований. Все ссылки на конкретные продукты предоставляются для целей экспериментальной воспроизводимость и не представляют собой какого-либо одобрения этих продуктов федеральным правительством.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Джеймса Fosse за его отличную работу на всех видеосъемка и видео обработка; Майкл Marti за его прекрасную работу в генерации изображения оцифрованных скота; Lilia Walther за ее помощь с РНК добыча и Bioanalyzer бежит; Митч Палмер и Карли Канип за их полезный обзор и обратной связи на изображениях лимфатических узлов; и уход за животными и ветеринарных сотрудников национального центра болезни животных для всех их напряженную работу и помощь с животноводством и подготовки necropsies.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Раствор для сохранения РНК (для всех экспериментов мы использовали RNALater) | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1,5 мл или 2 мл полипропиленовые микроцентрифужные пробирки | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Одноразовые скальпели | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Тканевые щипцы, крысиный зуб | Fisher Scientific | 12-460-117 | Другие тканевые щипцы доступны, включая изогнутый наконечник, конический край и т.д., в зависимости от предпочтений пользователя |
| 3 мм пуншовые биопсийные иглы | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Контейнер для острых предметов (небольшой и транспортируемый для вскрытия) | Stericycle | 8900SA | 1 кварт. размер показан здесь |
| Разделочные доски или одноразовые лотки | Fisher Scientific | 09-002-24A | Доступны в различных размерах, в зависимости от предпочтений пользователя Средства |
| индивидуальной защиты | Варьируется в зависимости от патогена (перчатки, респираторные маски, очки и т. Д.) | ||
| Реагент для экстракции РНК на основе фенола (для всех экспериментов мы использовали реагент TRIzol) | ThermoFisher | ||
| Silica (для всех экспериментов мы использовали набор PureLink RNA Mini) | ThermoFisher | 12183018A | Предназначен для тканевых до 100 мг |
| 100% этанола (200 proof для молекулярной биологии) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Тканевый гомогенизатор с закрытыми трубками гомогенизации (для всех экспериментов мы использовали диссоциатор gentleMACS) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarose (Общий, для гель-электрофореза) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | Также можно изготовить с нуля в лаборатории |
| Деионизированный формамид | EMD Millipore | S4117 | |
| Додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Бромофенол синий | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Ксилолацианол | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UV-Vis Спектрофотометр (мы использовали спектрофотометр NanoDrop) | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Прибор для количественной оценки РНК (мы использовали биоанализатор, с сопутствующими компонентами и протоколами) | Agilent | G2939BA | |
| Набор для экстракции РНК FFPE (мы использовали набор для выделения всех нуклеиновых кислот RecoverAll для фиксированной ткани, залитой парафином) | Пластиковый | ThermoFisher AM1975 | |
| (L-образный разбрасыватель) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Требуется только для тестирования на стерильность образцов от инфицированных животных |
| Ножи для вскрытия Животноводческие концепции | WI-0009209 |
Ссылки
- Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459(2015).
- Miller, L. C., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
