Гипофункция слюнных желез является частое следствие аутоиммунных заболеваний и лучевой терапии. Воспроизводимые оценки функции слюнных желез в моделях мыши этих заболеваний является технической проблемой. Здесь описан простой метод для точного и воспроизводимого измерения производства слюны у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод для измерения функции слюнной железы у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Больных с синдромом Шёгрен на, аутоиммунное заболевание, поражающее экзокринных желез, развивать слюнных желез воспаление и сократили производство слюны. Аналогично производство слюны серьезно подорваны у больных, получавших лучевой терапии рака головы и шеи. Грызунов модели, разработанные для имитации этих клинических условий, содействия пониманию патогенеза заболевания и позволяет для развития новых терапевтических стратегий. Таким образом способность точно, можно воспроизвести и неоднократно измерения функции слюнных желез в животных моделях имеет решающее значение. Опираясь на ранее описанные в литературе, был разработан метод который отвечает этим критериям и была использована для оценки функции слюнной железы у мышей. Дополнительным преимуществом этого нового метода является, что она осваивается легко и имеет небольшие отличия между оператором. Слюнные железы функция вычисляется как сумма (вес или объем) или ставка (мл/мин) слюны производства в ответ на стимуляцию пилокарпин. Собранные слюны является хорошим источником для анализа содержания белка, концентрации иммуноглобулина и других биомолекул.
Введение
Слюнные железы вырабатывают слюну в ответ на различные неврологические и механических раздражителей1. Раздражители осуществляется через симпатическую и парасимпатическую нервную систему адренергических и холинергических рецепторов в железе. Пилокарпин — холинергических, пункт симпатомиметической агент, который действует преимущественно на мускариновых рецепторов. В слюнной железе он индуцирует выработку слюны, воздействуя на мускариновых ацетилхолиновый рецептор м31. Производство слюны, после пилокарпин администрации является показателем способности слюнных желез реагировать стимуляции и обычно используется как мера функции слюнных желез.
Точное измерение слюны производства имеет решающее значение в изучении слюнной железы болезней, включая синдром Шёгрен на2 и радиационной травмы после лечения рака головы и шеи3. Были разработаны несколько различных методов для измерения слюны у грызунов. К ним относятся прямые катетеризации выделительной Слюнных протоков4, сбора слюны из ротовой полости под вакуумной5и коллекции с помощью стеклянных капилляров6 или7,микропипеткой8, 9. прямой катетеризации Слюнных протоков предоставляет наиболее точную и чистой слюны. Однако это технически сложная процедура, и потенциал для причинения вреда протоковой исключает повторяющихся слюны коллекции от же животных. Сбора слюны под вакуумом может привести к переменной результаты из-за высыхания слюны из трубки. Далее эта потеря преувеличен в мышах с уменьшение слюноотделения. Стеклянные капилляры позволяют сбора слюны для последующего анализа, однако, изменения в вязкость слюны, секретируемых в состоянии больной предотвращает эффективное Заполнение капилляра. Кроме того попытки развертки полости для сбора остаточной слюны может привести к травме. Накапайте метод позволяет для полной коллекции, и за тот же оператор, это удивительно согласуется между экспериментов. Однако по неизвестным причинам, этот метод показывает значительные различия между различными операторами. Таким образом чтобы соответствующие сравнения, становится необходимым, что тот же оператор выполняет все эксперименты, связанные с конкретным проектом. Очевидно это является основным недостатком для лаборатории.
Преодолеть эти проблемы, была разработана процедура, что сочетает в себе методы сбора слюны используется для людей и грызунов. Тампоном, описанный ниже метод для измерения объема пилокарпин индуцированной слюны простой, воспроизводимость, не зависит от оператора и могут выполняться неоднократно в то же самое животное. Кроме того она позволяет сбора слюны для последующего анализа белков, иммуноглобулины или других биомолекул.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол, в описанный ниже был одобрен институциональный уход животных и использования Комитетом и следует этические руководящие принципы, установленные национальными институтами здравоохранения. Все представленные в настоящем докладе данные были получены с помощью самок мышей, которые были в возрасте 10-12 недель. Были использованы следующие штаммы мышей: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S и F1 (B6XA/J). Все мыши были размещены в клетках (5 животных в клетке) барьер в конкретных условиях возбудителя бесплатно и корма и воды ad libitum.
1. Подготовка
- Подготовить раствор гидрохлорида пилокарпин, весить 10 мг комплекса и растворить его в 1,776 мл стерильного изотонического раствора, vortexing, чтобы дать Стоковый раствор 5.63 мг/мл. Существует не нужно стерилизовать это решение. Но при желании, процеживают через фильтр 0.2 мкм. Храните этот раствор в нескольких аликвоты в морозильной камере-80 oC на срок до 3 месяцев. Каждый замороженных фондовой предназначен для одноместного размещения. После размораживания, не заморозить пилокарпин решения.
- Возьмите 0,6 мл трубки отцентрифугировать и тщательно пробивают небольшое отверстие в нижней части каждой трубы с подогревом 18-иглы. Задайте эти трубы в 2 мл пробирок. Трубы не должны быть стерильными.
- Используя острые, стерильные лезвия бритвы, разрежьте на куски около 2 см в длину цилиндрических абсорбирующий тампоны. Разрежьте каждый кусок 2 см по диагонали, чтобы дать 2 конической формы тампоны. Поместите один тампон в каждой из трубок отцентрифугировать 0,6 мл.
- Вес 0,6 мл отцентрифугировать тубы с сухим тампоном.
- Передача мышей, чтобы быть изучены в новой чистой клетку с бутылки воды. Держите мышей без пищи в течение по крайней мере за 2 ч до начала сбора слюны для предотвращения загрязнения слюной собранные частицы пищи.
Примечание: Нет необходимости держать 1 мышь в клетке для этой процедуры. Однако количество мышей, размещенных в каждой клетке зависит от конкретного учреждения правила и положения для использования животных. - Незадолго до окончания 2 h для приготовления рабочего раствора пилокарпин (0.0563 мг/мл) путем разбавления Стоковый раствор 100 x в стерильного физиологического раствора. Это не является необходимым для дальнейшей фильтрации стерилизации это решение. Всегда держите пилокарпин рабочего раствора на льду.
Примечание: Таблица 1 дает количество пилокарпин для инъекций для диапазона веса тела мыши дать окончательный дозу 0,375 мг/кг веса тела.
2. процедура
- Вес каждой мыши и определить дозу анестезии смесь для каждой мыши, с помощью таблицы 1. Привнести первая мышь с соответствующим объемом анестезии смесь, внутрибрюшинного маршрут. Установите таймер на 2 мин (большинство штаммов мыши, испытания в данном протоколе идти спать 2 мин). Убедитесь, что мышь должным образом наркозом отсутствием ходить, когда размещены на плоской поверхности. Если мышь еще ходить, ждать еще 2 мин перед переходом к следующему шагу. Примените капли смазочного глазная мазь для обоих глаз для предотвращения высыхания.
Примечание: В таблице 1, доза обезболивающий смеси составляет 0,007 мл/г веса тела. Оптимальный диапазон для выполнения этой процедуры — 0,006 до 0,008 мл/г веса тела. Однако, после 4 мин, если мышь до сих пор пешком или экспонирование отрывистые движения, консультироваться с институциональной ветеринар для надлежащим образом увеличивая дозу анестетика. - Определение дозы пилокарпин для мыши, с помощью таблицы 1 и придать соответствующую сумму внутрибрюшинного маршрутом. Установите таймер на 2 мин и вставьте фиксатор Тюбик 50 мл мыши до тех пор, пока голову и уши палку из конца разреза. Место труб под углом 45 градусов, с головой вниз и вентральной поверхности, обращенной вверх. Лента трубки процедуры Совету держать его от перемещения.
Примечание: Таблица 1 обеспечивает дозировка для мышей, более чем на 17 g, как эта процедура не была предпринята на мышах, весом ниже 17 g. - В конце 2 мин аккуратно вставить пару закрытой микро рассекает щипцами в рот и приподнимите подбородок вверх, чтобы открыть рот. Нажмите щипцы 1-2 мм далее в рот, убедившись, что язык рассматривается отдыхает на верхней рукоятке щипцы. С другой парой тонкой щипцов удерживайте предварительно взвешенный сухим тампоном недалеко от его конический наконечник.
- Аккуратно вставьте конический наконечник тампон в рот. Снять щипцы оставляя кончик тампона в ротовой полости.
- Схватить широкий конец тампоном, расширяя вне полости рта и поверните его, чтобы максимальная площадь контакта с рот. Держите тампон в этом положении в течение 15 мин.
Примечание: Это гарантирует, что тампон остается во рту в течение коллекции. Обратите внимание, что конический наконечник тампон действует как фитиль и более широкой части тампоном остается вне полости рта. - В конце 15 мин осторожно поверните тампон для сбора слюны, который не поглощается и поместите влажный тампон в 0,6 мл отцентрифугировать. Закройте трубку и установите его в 2-мл пробирку, размещены на льду.
Примечание: В настоящее время слизистой появится полностью сухой. Мыши могут теперь быть перемещены обратно в его клетке для восстановления от анестезии. - Перенесите мышью в клетке. Место, смоченным гранул пищи в клетке после сбора слюны, чтобы помочь быстрее регидратации.
Примечание: Мышей, Звонок в течение 10 мин после окончания коллекции. Подкожно подогретым 0,2 мл изотонического раствора может также предоставляться для ускорения восстановления. - Перейти к следующему мыши. Все мыши должны быть проверены до тех пор, пока они полностью восстановлены и являются амбулаторный.
3. измерения
- В конце всех коллекций вес 0,6 мл трубки с мокрой тампоном. Вычислите разницу между сырого веса и сухой вес, чтобы получить вес слюны производства. Место 0,6 мл трубки слюной обратно в 2-мл пробирку.
- Отрежьте шапки 2 мл пробирок. Затем центрифуга 2 мл пробирок для 2 мин на 7500 x g, при 4oC в микро центрифуги для восстановления слюны. Измерьте объем слюны, полученные с помощью микропипеткой.
- Экспресс результаты как слюна вес (мг)10 свыше 15 мин или как отношение веса слюны (мг) / мыши веса тела (g).
Примечание: Если был измерен объем слюны, извлеченные из тампоном, выразить результаты как объем слюны восстановленные (мл) или отношение объема слюны (мл) / мыши веса тела (g).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В экспериментальной мыши модель системы способность производить слюны в ответ на стимуляцию пилокарпин используется как показатель функции слюнных желез. Слюны производства была измерена в самок мышей C57BL/6 11-недельных методом тампоном. На рисунке 1Aрезультаты выражаются как количество слюны (мг), собранные после увеличения дозы пилокарпин. В дозе 1 мг/кг веса тела некоторые из мышей начал выставке дистресс (недобровольное встряхивания и дрожа). Поэтому бо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Слюны является сложным процессом и зависит от многих факторов. Таким образом измерения функции слюнных желез в лабораторных животных может быть проблемой. Дополнительной проблемой является то, что повторные измерения функции слюнных желез в то же самое животное необходимо установить начало болезни или продемонстрировать восстановление после лечения.
Тампоном метод, описанный в настоящем докладе является технически простой для выполнения с множеством вариантов для представления данных. Полученн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Благодарности
Это исследование было поддержано грант от национальных институтов здравоохранения, Национальный Институт стоматологии и краниофациальных исследований (DE025030).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Химикаты для сбора слюны | |||
| Пилокарпина гидрохлорид | Альфа Эзар, Тьюксбери, Массачусетс, США | B21410 | Разведите в стерильном изотоническом растворе. Храните одноразовые аликвоты 100X по стоку -80oC |
| Name | Company< | strong>Номер в каталоге | Комментарии |
| Anesthesia Mix раствор | Смешайте 1 мл кетамина гидрохлорида + 0,5 мл ксилазина + 8,5 мл стерильного изотонического раствора в стерильном флаконе. Можно использовать в течение 3 месяцев. | ||
| Зетамин (гидрохлорид кетамина) | Vet One, Бойсе, Айдахо, США | C3N VT1 | Stock 100 мг/мл |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Меттава, Иллинойс, США | RXANASED-20 | Stock 20 мг/мл |
| Изотонический стерильный физиологический раствор | Vet One, Бойсе, Айдахо, США 501032 | Используется в качестве разбавителя | |
| Искусственные слезы (лубрикантная офтальмологическая мазь) | Henry Schien, Дублин, Огайо, США | 48272 | Используется для предотвращения пересыхания глаз во время процедуры |
| Название | Company | Каталожный номер | Комментарии |
| Материалы для сбора слюны | |||
| SalivaBio Детский тампон | Salimetrics, ООО «Карлсбад», CA, США | Н/Д | Индивидуально упакованные тампоны |
| 50 мл полипропиленовые трубки | VWR, Radnor, PA, США | 89004-364 | Отрежьте дно 1 см от трубки. Следите за тем, чтобы край среза был ровным. |
| Микроцентрифужные пробирки 0,6 мл | VWR, Radnor, PA, США | 87003-290 | Проделайте отверстия в дне пробирки с подогревом иглами 18 калибра |
| Микроцентрифужные пробирки 2 мл | VWR, Radnor, PA, США | 87003-298 | |
| Инсулиновые шприцы с постоянно прикрепленными иглами | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, США 324702 | ||
| 18 калибра обычные скошенные иглы | Becton Dickinson and Company, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 305195 | ||
| Стерильное лезвие скальпеля #11 | Integra York Inc PA, США | 4-311 | |
| Микрорассекающие щипцы | Roboz, Гейтерсбург, Мэриленд, США | RS-5139 | Зазубренный угловой наконечник 0,8 мм, длина 4 дюйма |
| Этикеточная лента | Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США | sc-224487 | |
| 3-канальный таймер | Amazon.com, Сиэтл, штат Вашингтон, США | B06W2KCYVN | |
| Аналитические весы | Mettler Toledo, Колумбус, штат Огайо, США | ||
| Название< | strong>Company< | strong>Номер в каталоге | Комментарии |
| Химикаты/реагенты для индуцирования слюнной дисфункции | |||
| LPS | Invivogen, Сан-Дейго, Калифорния, США | tlrl-b5lps | Растворите в воде, не содержащей эндотоксинов, и храните исходный раствор в концентрации 5 мг/мл. Разведите в стерильном HBSS 100 мкг/мл - введите 100 мкл/мл |
| в адъюванте Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Разведите 1:1 в стерильном физрастворе. Внутрибрюшинное введение 0,1 мл/мышь |
| Кролик анти-Ro52 анти-Ro52 | антисыворотка, полученная в лаборатории | Иммунизация кроликов рекомбинантной мышиной Ro52 | |
| Название | Company< | strong>Номер в каталоге | Комментарии |
| Химикаты/ наборы для анализа слюны | |||
| Sluvary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, США | E-22013 | Используется в соответствии с инструкциями производителя |
| Name< | strong>Company | Номер в каталоге | >Комментарии |
| <Оценка сильно>слюнных IgA с помощью сэндвича ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Бирмингем, Алабама, США | 0106-01 | Стандарты для сэндвича ИФА - диапазон от 30 нг/мл до 0,5 нг/мл |
| Козий антимышиный IgA немаркированный | Southern Biotech, Бирмингем, Алабама, США | 1040-01 | Слой 1 мкг/мл в бикарбонатном буфере |
| Козий антимышиный IgA HRP | Southern Biotech, Бирмингем, штат Алабама, США | 1040-05 | Обнаружение антител используется при разведении 1:4000 |
| субстрата TMB | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, США 555214 | Используется в соответствии с инструкциями производителя | |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 луночных планшетов | Thermo Scientific, Рочестер, штат Нью-Йорк, США | 3855 | |
| Name | Company | >Каталожный номер | Комментарии |
| >Оценка белка в слюне | |||
| Bio-Rad Protein Assay Концентрат красителя | BioRad, Hercules, CA, США 5000006 | Для оценки белка в соответствии с инструкциями производителя |
Ссылки
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
