Здесь мы представляем протокол к изоляции и культивировать мышиных перитонеальных тучных клеток. Мы также обсудим два протокола для их функциональных характеристик: флуоресцентных изображений внутриклеточных бесплатно Ca2 + концентрации и пробирного дегрануляции основе колориметрические количественная оценка выпущенной β-hexosaminidase.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca2 +-изображений и дегрануляции анализов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тучные клетки (MCs), как часть иммунной системы, играют ключевую роль в защите принимающей страны против нескольких возбудителей и в инициировании аллергических иммунного ответа. Активация MCs через cross-linking поверхности IgE связана с высоким сродством IgE рецептором (FcεRI), а также путем стимулирования несколько других рецепторов, инициирует подъем уровня свободного внутриклеточных Ca2 + ([Ca2 +]я) что способствует высвобождение медиаторов воспалительных и аллергических. Идентификация молекулярных компонентов, участвующих в этих сигнальных путей имеет решающее значение для понимания регулирования MC функции. В этой статье мы опишем протокол для изоляции типа МКН, перитонеальный лаваж мышиных соединительной ткани и культивирование перитонеальный MCs (ЧВК). Культур MCs от различных моделей мыши нокаут по этой методике представляют собой полезный подход к идентификации белков, участвующих в MC, сигнальные пути. Кроме того мы также описать протокол для одной ячейки фура-2 изображений как важный метод количественного определения Ca2 + сигнализации в MCs. флуоресценции основе мониторинга [Ca2 +]я является надежным и обычно используется подход к Изучите Ca2 + сигнализации событий, включая вход работает магазин кальция, который имеет первостепенное значение для MC активации. Для анализа MC дегрануляции мы описываем пробирного релиз β-hexosaminidase. Количество β-hexosaminidase, выпустила в среду культуры считается дегрануляции маркера для всех три различных секреторных подмножества описанных в MCs β-hexosaminidase могут быть легко количественно по его реакции с colorigenic субстрата в микротитровальных пластины колориметрического анализа. Этот высоко воспроизводимый метод с точки зрения затрат и не требует специализированного оборудования. В целом, предоставленный протокол демонстрирует высокий урожай МКН, выражая типичный MC поверхностных маркеров, отображение типичных морфологических и Фенотипические особенности MCs и демонстрирует высокую воспроизводимость ответы на secretagogues в Ca2 +- изображений и дегрануляции анализов.
Введение
МКН играть заметную роль во время врожденного и приобретенного иммунного ответа. В частности MCs участвовать в убийстве патогенов, таких как бактерии и паразиты и также ухудшить потенциально токсичных эндогенного пептидов или компоненты яды (для обзора см. Галли et al. 20081). Физиологическая роль МКН в врожденная и адаптивного иммунитета является предметом оживленных дискуссий. Таким образом многочисленные расхождения данных в исследованиях, выполненных с различными моделями мышь MC-недостаточным требует систематической переоценки иммунологической функции помимо специальные2МКН. Зрелые MCs преимущественно локал....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все животные процедуры выполнялись согласно немецкого законодательства руководящие принципы ухода и использования лабораторных животных (официально утверждена Карлсруэ регионального Совета).
1. PMC изоляции и культивирования внутрибрюшинного промывание
....| 1 | Лед |
| 2 | 10 мл-шприцы |
| 3 | 27 G иглы |
| 4 | 20 G иглы |
| 5 | Блок из пенопласта и контакты |
| 6 | Коллекции трубок (50 мл пластиковых пробирок) |
| 7 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
ЧВК были изолированы от 3 дикого типа мыши (C57BL/6Н), внутрибрюшинного промывание и далее культивировали в среде RPMI дополнены с FCS 20% и 1% перо-стрептококк в присутствии факторы роста (IL-3 на 10 нг/мл) и СКФ в 30 нг/мл в стерильных увлажняется условий на 37 ° C и 5% CO2. Средство было изменено на 2 и 9 дни после изоляции клеток. Морфология клеток была проанализирована с помощью передачи света DIC изображений (см. Рисунок 1A, B
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
MC модели могут успешно использоваться для изучения MC дегрануляции, хемотаксис, сцепления, а также разъяснению внутриклеточных сигнальных путей участвует в активации MC. Некоторые исследователи, использование человека MCs модели, такие как увековечена линии (LAD2 и HMC1) или человека MCs производные от шнура крови клетки-предшественники (CD133 +) и прогениторных клеток периферической крови (CD34 +). Другие предпочитают грызунов MC модели, такие как увековечил (Крыса базофильная лейкоз RBL - 2H 3 MC линия) или первичные .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы хотели бы признать Julia Geminn для оказания технической помощи в подготовке тучных клеток и культивирования. Эта работа была поддержана трансрегиональных совместный исследовательский центр (TR-SFB) 152.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R& D Systems | 403-ML | |
| SCF Thermo Scientific | PMC2115 | ||
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Антитела к ДНФ | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Компаунд 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-нитрофенил 2-ацетамидо-2-дезокси-&бета;-D-глюкопиранозид | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| Камера визуализации CoverWell | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-луночный планшет, V-образное дно | Corning | 3896 | |
| 96-луночные планшеты, плоское дно | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Считыватель микротитровальных планшетов с программным обеспечением "i-control" | Tecan | Nano Quant, бесконечная плита с плоским дном M200 Pro | |
| Greiner Bio-One | 655180 | ||
| Иономицин | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 мл Пластиковые центрифужные пробирки | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Колбы для культур (25 см) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Крышка стекла круглая; ø 25 мм; No 1 | Менцель | CB00250RA1 | |
| Гемоцитометр | VWR | 631-0696 | |
| Инвертированный микроскоп | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Фильтр Набор Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| ПЗС-камера | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Монохроматический источник света | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Система нанесения раствора с гравитационной подачей | Изготовленная на заказ | 4-канальная | |
| пластиковая центрифужная пробирка 15 мл | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Настольная центрифуга | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Ссылки
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated ce....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
