RESEARCH
Peer reviewed scientific video journal
Video encyclopedia of advanced research methods
Visualizing science through experiment videos
EDUCATION
Video textbooks for undergraduate courses
Visual demonstrations of key scientific experiments
BUSINESS
Video textbooks for business education
OTHERS
Interactive video based quizzes for formative assessments
Products
RESEARCH
JoVE Journal
Peer reviewed scientific video journal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Video encyclopedia of advanced research methods
EDUCATION
JoVE Core
Video textbooks for undergraduates
JoVE Science Education
Visual demonstrations of key scientific experiments
JoVE Lab Manual
Videos of experiments for undergraduate lab courses
BUSINESS
JoVE Business
Video textbooks for business education
Solutions
Language
ru_RU
Menu
Menu
Menu
Menu
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Erratum Notice
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Здесь мы представляем быстрым, легким и лоу кост метод для изготовления форм пользовательских полидиметилсилоксан, которые могут использоваться для производства на основе гидрогеля инженерии тканей со сложной геометрией. Мы дополнительно описать результаты от механических и гистологической оценок, проводимых на инженерии сердечной ткани производятся, используя эту технику.
В области тканевой инженерии продолжает Зрелые, наблюдается повышенный интерес в широком диапазоне параметров ткани, включая ткани форму. Манипулируя ткани форму на Микрометр сантиметр масштаба можно прямое выравнивание ячейки, изменять эффективные механические свойства и рассмотреть ограничения, относящиеся к диффузии питательных веществ. Кроме того судно, в котором готовится ткани может распространять механических ограничений на ткани, привело поля напряжений, которые далее могут влиять на структуру клеток и матрицы. Фасонные ткани с высокой воспроизводимости измерений также есть утилита для анализов в пробирке в котором образца размеры имеют решающее значение, таких как механический анализ всей ткани.
Эта рукопись описывает метод альтернативного изготовление, используя отрицательные мастер формы, приготовленный из лазером акриловые: эти формы выполняют хорошо с полиэфиром (PDMS), разрешение конструкции с размерами на сантиметр масштаба и функция размеры меньше, чем 25 мкм и может быть быстро разработаны и изготовлены по низкой цене и с минимальным опытом. Минимальное время и стоимость требований позволяют для лазерных травленная прессформы быть быстро итерации по пока не определен оптимальный дизайн и быть легко адаптированы для любого анализа интерес, в том числе за пределами области тканевой инженерии.
За последние два десятилетия мягкие литографии как изготовление техника широко используется для поддержки научных исследований, особенно в областях микрофлюидика, материалы исследований и ткани инженерных1,2, 3. Литье реплики, в которой создается объект с желаемой формы от негативных мастер плесень, предлагает удобный и недорогой метод производства положительная PDMS реплицирует который может использоваться для литья в форме гидрогели. Однако требуется негативные мастер формы обычно производятся с использованием микротехнологий методов, которые стоят дорого, много времени, ограничены по размеру, и требуют пространство комнаты и сложного оборудования. В то время как 3D печати предлагает потенциальной альтернативой, его полезность несколько ограничены из-за пределы резолюции недорогих принтеров и химических взаимодействий между общей 3D принтер полимеров и PDMS, которые могут препятствовать отверждения.
Лазерный резак системы способны как резки и травления такие материалы, как пластик, дерево, стекло и металл в последнее время стали значительно менее дорогостоящими и поэтому более доступными для изготовления инструментов исследования. Коммерческого класса Лазерные резаки способны сфабриковать объектов на шкале сантиметр с минимумом функций менее 25 мкм и далее требуют минимальной подготовки, опыта и времени для использования. В то время как лазерной абляции PDMS ранее использовался при изготовлении устройств микрофлюидика, наши знания не рукопись описал процесс, по которому миллиметр и сантиметр масштаба формы могут быть изготовлены из лазерной резки негативных мастер формы4 .
Мы использовали этот метод прежде всего для того, чтобы манипулировать форму инженерии тканей с целью улучшения питательных диффузии, сотовой выравнивание и механические свойства5,6,7. Однако для использования в любой области, где формованные гидрогели представляют интерес, например наркотиками доставки и материал науки исследований8позволяет универсальность этой техники. С доступ к лазерный резак, реплицирует PDMS плесень могут быть сделаны для почти любой геометрии без свесы (которые будет препятствовать удалению без многодетальном плесень, которая выходит за рамки этой рукописи) и что вписывается в габариты кровати лазера.
1. Создайте векторный формат мастер дизайн плесень
2. Лазерная резка акрила мастер формы
3. Подготовьте формы PDMS для клетки или ткани, культура
4. бросили коллагена и фибрин гидрогеля тканей
Примечание: Используйте асептические надлежащую процедуру для поддержания стерильности.
5. анализ методов: Ткани уплотнения
Примечание: Уплотнение результате матрица ремоделирования является показателем жизнеспособность тканей и развития, которая легко может быть измерена путем анализа оптической микроскопии и изображения.
6. анализ методов: Испытания на растяжение
Примечание: Обе активные механика (силы или штаммов, порожденных инженерии тканей из-за активности клеток) и пассивных механики (силы или штаммов, созданный в ответ на прикладной штаммов или силы) являются критическим функциональные характеристики многих инженерных ткани и это особенно верно для инженерии сердечной ткани. Микромеханические анализатор, используемый для анализа описаны в Таблице материалов. Другие механические испытания аппараты могут применяться аналогичным образом предполагая, они позволяют гидратированных тестирования и способны контроля длины и заставить измерения диапазонов и резолюций соответствующие для ткани. Для тканей с поперечного области порядка одного квадратных миллиметров и жесткость порядка десятков кПа ячейка нагрузки 5 МН — хорошо подходят. Более крупные и более жесткая материалов потребует большей нагрузки ячейки. До начала испытаний, убедитесь, что датчик силы и длина контроллер правильно откалиброван.
7. анализ техника: Парафин иммуногистохимии и гистологии
Примечание: Мы имели большой успех в визуализации разделов инженерии ткани с помощью парафиновые блоки так, что морфология ткани лучше всего сохранилась. Все шаги процесса должны тщательно рассматриваться и с учетом инженерии тканей, включая обработку образцов без вакуума или давление, эмпирически определение методов извлечения соответствующего антигена и титрования основное антитело концентрация. Другие методы, например использование замороженных блоков для подготовки слайдов, может потребоваться меньше времени и затрат при дают достаточные результаты в зависимости от предполагаемого применения.
8. анализ техника: Выравнивание ячеек
Примечание: Манипуляции ткани формы и поля внутренних напряжений может модулировать выравнивание ячеек, определяющей чертой многих родной тканей.
Оптика лазерный резак приведет к травлению районы для очень немного уменьшились размеры как травление глубина увеличивается, и результаты в плесени стены с очень тонкий рельеф, должное к сужающийся лазерного луча. Это поможет облегчить удаление плесени PDMS литой, но следует тщательно рассмотреть, если очень глубоко выгравированы негативные мастер формы (> 6 мм), требуется (рис. 1).
Со временем в культуре из-за матрицы ремоделирования, хотя темпы и степень, в которой это происходит, будет зависеть от состава эшафот, ячейки нагрузки и культивирования условий будет компактный cellularized конструкции.
Ремоделирование матрица может произойти путем реорганизации и деградации окружающих матрица (а также осаждения новой матрицы), но обычно ассоциируется с увеличением механическая жесткость обусловлено сокращением площади поперечного сечения. С коллагена только конструкции состоит из коллагена 1,6 мг/мл и 12 x 106 кардиомиоцитов/мл, мы видим конструкции компактных до 19,7 ± 2,8% их первоначальной ширины в течение четырех дней после литья (рис. 2) через уплотнение assay. Хотя этот assay дает представитель 2D приближение процесса 3D, простота сбора данных и неразрушающего природы сделать это мощный инструмент для изучения процесса развития конструкции. Обратите внимание, что в условиях культуры клеток, даже в отсутствие клеток, коллаген механики могут со временем изменяться из-за оба самосборки и cross-linking11. Фибрин может быть быстро деградируют к фибринолиза как в естественных условиях , так и в пробирке если не в присутствии antifibrinolytic, например Апротинин или Аминокапроновая кислота12. Таким образом воздействие компонентов эшафот на долгосрочной перспективе развития тканей и не только образование ткани, следует рассматривать при выборе конструкции формулировку. Если размер окончательного ткани имеет важное значение для конкретного приложения, уплотнения должны рассматриваться также в формы дизайна и эмпирически определяется на основании ячейки матрицы и тип(ы) композиции. Обратите внимание, что уплотнение ткани также может вызвать стресс поля внутри ткани, которой можно манипулировать в cellularized конструкции для поощрения выравнивание ячеек (рис. 4).
Широкий спектр эшафот концентрации полимера и первоначальная клеточная посева плотности были использованы для создания инженерии тканей в литературе, и это может объясняться главным образом для различных требований для различных типов клеток, клеточных линий и приложений. Основываясь на нашей собственной работе с hiPSC производные кардиомиоцитов, мы считаем, что коллаген концентрация 1,25 мг/мл и посева плотность ~ 15 миллионов клеток/мл является хорошей отправной точкой13. Кроме того фибрина широко используется в качестве материала леска сердечной ткани также, обычно в диапазоне 3-4 мг/мл14. Клеток, заполнение плотности могут выбираться на основе целого ряда факторов, в зависимости от приложения, но плотность клеток родной тканей обеспечивают хорошей отправной точкой. Также считают, что решения высокой концентрации клеток может стать сложным, чтобы работать с, особенно для небольших объемов. Для населения в данной ячейке могут быть настроены эшафот формулировки; как правило, повышение концентрации полимера когда тканей являются слишком хрупкими или перерыв после уплотнения и увеличение концентрации полимера, когда ткани слишком жесткой или не компактный15.
До выполнения пассивной механический анализ в любое время на этапе культура, это может быть целесообразным механически предварительных условий выборки конструкции. Литраж природных полимерных гидрогелей и инженерии тканей увеличит воспроизводимость результатов тестирования из-за материала вязкоупругости и лучше указать свойства, которые конструкции представят в клинических приложения. Мы используем 8 циклов 10% деформации в треугольной формы сигнала в размере 10% деформации/мин до начала механической оценки (Рисунок 3).
Ткани и клетки тип конкретных морфология может оцениваться гистологии и иммуногистохимии с традиционными методами. Однако, мы обнаружили, что оптимизация почти все этапы парафин обработки, встраивание, секционирование, антиген поиска и пятнать были необходимые для инженерии сердечной ткани, по сравнению с покрытием клетки или секционного родной ткани (Рисунок 4).

Рисунок 1 : План процесса проектирования и подготовки PDMS формы от лазерного вырежьте акриловая мастерами. (A) плесень дизайн, подготовленный в формате векторной графики. Очищен от вирусов (B) Лазерные травленная акриловые негативные мастер. (C) PDMS бросили на поверхности тесьмой акриловые главной формы. (D) результирующий PDMS плесень готов для стерилизации до культуры ткани. Вставка: вид сверху, же масштаба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Построить уплотнения со временем в культуры. (A) образы прямоугольной конструкции, подготовленный в трех экземплярах при сжатии с течением времени в культуре. Зеленые пометки представляют маски, используемые для расчета площади видна конструкция для анализа изображений. (B) Площадь участка конструкции (двумерный метрики конструкция уплотнения) с течением времени. Горизонтальные линии представляют собой средние значения и погрешностей указать стандартное отклонение. Для всех групп, n = 3 и * указывает p < 0,05 по оценке ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Raw следы для механических характеристик инженерии сердечной ткани. Вставками отображать трассировку одного представителя дергаться сужением (одинаковые оси как основной сюжет). (A) активные механические результате быстрые шаги последовали держит нагрузку 5% с шагом в ответ. (B) пассивной механической ответ результате теста тянуть перерыв в размере 10% деформации/мин. Все образцы были проанализированы в ванне с 37 ° C Tyrode в решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Парафин блока изображения гистологии для инженерии сердечной ткани конструкций различных конструкций. Парафин блок изображения гистологии для инженерии сердечной ткани конструкций различных конструкций витражи с (A) гематоксилином и эозином, Диаминобензидин (борьбы с сердечными тропонина T, коричневый) и гематоксилином ядерной изображение (B), (C ) picrosirius красное пятно на коллаген с быстро зеленый цитоплазматических изображение и (D) мыши анти α-актинина антитела (зеленый) и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ядерных изображение (синий). Результате дизайн и ткани уплотнения конструкции отличается выравнивание ячейки. Линейки в A относится к B и C также. Врезные в D показывает полосатый кардиомиоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Авторы не имеют ничего сообщать.
Здесь мы представляем быстрым, легким и лоу кост метод для изготовления форм пользовательских полидиметилсилоксан, которые могут использоваться для производства на основе гидрогеля инженерии тканей со сложной геометрией. Мы дополнительно описать результаты от механических и гистологической оценок, проводимых на инженерии сердечной ткани производятся, используя эту технику.
Авторы признают, финансирование из низ R00 HL115123 и Браун университета школа инженерии. Они также благодарны Браун Дизайн семинар и Крис Bull для профессиональной подготовки и поддержки с лазерной резки.
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Коллаген крысиного хвоста I, 4 мг/мл | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Содим хлорид | Fisher | BP358-10 | Конструкты |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Конструкты |
| Тонкие щипцы | Fine Science Tools | 11252-20 | Конструкты |
| Sylgard 184 силиконовый эластомер | Corning | 4019862 | PDMS Пресс-формы Лабораторная |
| лента | Fisher | 15-901-5R | PDMS Пресс-формы |
| Акрил, 1/4" толстый | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Конструирует |
| RPMI 1640 средний, порошковый | Fisher | 31800-089 | Конструирует |
| Дигидрат хлорида кальция | Fisher | AC423520250 | Конструирует |
| Магния хлорид гексагидрат | Fisher | M33 500 | Конструктов |
| Хлорид калия | Sigma | P9541-500G | Конструкции |
| Диосновной гептагидрат фосфата натрия | Sigma | S9390-500G | Конструкции |
| глюкозы | Sigma | G5767-25G | Конструкции |
| OCT | VWR | 25608-930 | Гистология |
| Замороженные блочные формы | VWR | 25608-916 | Гистология |
| Гематоксилин | Фишера | 3530 1 | Гистология |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Гистология |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Гистология |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Векторная графика | |
| Inkscape | (открытый исходный код) | Векторная графика | |
| UCP (универсальная панель управления) | Универсальные лазерные системы | Интерфейс лазерного резака | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Лазерный резак | Универсальные лазерные системы | Лазерный резак | |
| Микромеханический анализатор | Aurora Scientific | 1530A с тензодатчиком 5 мН | Механический анализ |