Method Article

Простой метод для изоляции протопласта сои и приложения для анализа переходных ген выражение

DOI:

10.3791/57258

⸱

January 25th, 2018

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали простой и эффективный протокол для приготовления большого количества сои протопласта для изучения сложных механизмов регулирования и сигнализации в живых клетках.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сои (Glycine max (L.) Merr.) является важной культурой видов и стала моделью бобовых для исследования генетических и биохимических pathways. Таким образом важно создать систему эффективного переходных ген выражение в сои. Здесь мы приводим простой протокол для подготовки протопласта сои и ее применение для переходных функционального анализа. Мы обнаружили, что молодые листья unifoliate от проростки сои привело в больших количествах протопласта высокого качества. Оптимизируя PEG-кальций опосредованной трансформации метода, мы достигли высоких преобразования эффективности использования сои unifoliate протопласта. Эта система обеспечивает эффективную и универсальная модель для изучения сложных механизмов регулирования и сигнализации в живой сои клеток и может помочь лучше понять разнообразные сотовой, развития и физиологических процессов, бобовых.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протопластов растительных клеток, которые имеют клеточной стенки удалены. Как они поддерживают большинство функций и деятельности растительных клеток, протопласта являются хорошей моделью системы наблюдения и оценки различных клеточных события и ценные инструменты для изучения Соматическая гибридизация1 и растений регенерации2. Протопласта также широко использовались для растений преобразования3,4,5, так как стены клетки в противном случае будет блокировать проход ДНК в клетку. Протопласта обладают некоторые физиологические реакции и клеточных процессов интактных растений, таким образом предлагая основополагающее значение в фундаментальных исследований для изучения внутриклеточных белков локализации6,7,8, белок белковых взаимодействий9,10и промоутер деятельность11,12,13 в живой клетки.

Изоляции протопласта завод впервые сообщалось в 1960 году14 и протоколы для изоляции и преобразования протопласта разработаны и оптимизированы. Стандартная процедура изоляции протопласта включает резки листья и ферментативного пищеварения клеточной стенки, последовали разделение выпустила протопласта от мусора не переваривается ткани. Трансформации стратегии включает в себя электропорации15,16, микроинъекции17,18и на основе полиэтиленгликоля (PEG)4,5,19 методы. Широкий спектр видов были зарегистрированы для изоляции протопласта, включая цитрусовые20, Brassica21, пасленовых22 и23,других декоративных растений в семей24успешным. Хотя разнообразные ткани типы используются в различных видов, система переходных выражения в проростках Arabidopsis мезофилл протопластов (TEAMP) изолированы от листьев растения модель Arabidopsis thaliana был хорошо установленных25 и широко применяемый для различных приложений.

Сои (Glycine max (L.) Merr.) является одним из наиболее важных белков и масличные культуры26. В отличие от Arabidopsis и риса получение трансгенной сои растений как известно довольно трудным и низкой эффективности. Agrobacterium tumefaciens-опосредованного проникновения были широко используется для переходных ген выражение исследования в эпидермальных клеток в табак27 и рассады в проростках Arabidopsis28,29, тогда как Agrobacterium rhizogenes был использован для преобразования волосатые корней в сои30. Вирус индуцированной генной глушителей подходы были использованы для Даунрегуляция целевых генов31,32 и переходных выражение33 на систематической основе. Протопласта обеспечивают ценный и универсальный альтернативу этих подходов. Протопласта могут быть получены из сои в надземной материалов и позволяют быстро и синхронизированные трансген выражение. Однако начиная с первоначальной успешной изоляции протопласта сои в 1983 году34, поступали ограниченное по применению протопластов в сои35,,3637, 38, главным образом из-за относительно низкой урожайности сои протопласта.

Здесь мы опишем простой и эффективный протокол изоляции протопласта сои и ее применение для исследования переходных ген выражение. С помощью молодые листья unifoliate от проростки сои, мы смогли получить большое количество жизненно протопластов в течение нескольких часов. Кроме того мы оптимизировали PEG-кальций опосредованной метод преобразования, который прост и низкой стоимости для доставки ДНК в протопласта сои с высокой эффективностью.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. рост растений

  1. Сеять семена сои 5-10 (Уильямс 82) в горшке 13 см в теплицах в условиях Лонг день (16 h света на 1500 мкмоль м-2 s-1) при 25 ° C на пользовательских почвенной смеси для сои (1:1:1 отношение почвы, перлита и Торпедо песка).

2. Подготовка плазмидной ДНК

  1. С помощью стерильной пипеткой подсказка или зубочисткой, выбрать один колонии или замороженные глицерин запас E. coli , перевозящих плазмида, содержащие ген интереса и инокуляции в жидкой среде Бертани Лурия (LB) 20 мл с соответствующие антибиотики в 50 мл флакон.
  2. Инкубируйте настой при 37 ° C ночь на шейкер. Соберите бактерии, центрифугирование подвеска на 12000 x g при комнатной температуре в течение 5 мин и отменяя супернатант. Извлечь и очистить плазмида производителя процедуры Подготовка комплекта плазмиды.

3. протопластов изоляции

  1. Вырежьте недавно расширил unifoliate листья от 10 - дневных проростки сои (рис. 1).
    Примечание: Выбор листьев на соответствующей стадии развития является ключом к успеху для приготовления соевого протопластов. Только используете только расширенный листья на ранних этапах своего развития. Как листья зрелых, стены клетки становятся труднее переваривать.
  2. С свежий лезвием удалите жилки из unifoliate листьев и затем вырезать, остается в 0,5-1 мм полосы.
    Примечание: Два unifoliate листья, усваивается в 10 мл раствора фермента даст достаточно протопласта для более чем 10 преобразований.
  3. Используя пару щипцов, передачи лист полосы сразу и аккуратно в 10 мл раствора (Таблица 1) свежеприготовленного фермента в 15 мл. Вакуумные инфильтрата лист полосы 15 мин при комнатной температуре.
  4. Инкубируйте лист полосы в растворе фермента с нежным агитации (40 мин) при низкой освещенности для 4-6 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что решение фермента превращается желто зеленый, как протопласта выпускаются. Проверьте решение фермента/протопласта под микроскопом (X10).
    Примечание: Выпущенный протопласта сферической формы, в то время как непереваренных клетки имеют нерегулярные или овальной формы.
  5. Передача 10 мл раствора фермента/протопластов в 50 мл трубки, слегка поливая и добавить 10 мл раствора W5 (Таблица 1) при комнатной температуре, чтобы остановить пищеварение. Аккуратно Переверните трубку в несколько раз. Залейте мягко фермента/протопласта решение нейлоновая сетка чистой 75 мкм, укладывают поверх 50 мл трубки для удаления тканей непереваренных листьев.
  6. Центрифуга для потока через фермента/протопласта решение на 100 x g в 50 мл трубки для 1-2 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант, используя 10 мл Серологические Пипетки не нарушая протопластов Пелле.
  7. Ресуспензируйте протопласта и разбавляют до концентрации5 2 x 10 мл-1 в охлажденный раствор W5 на 4 ° C, подсчитывая число протопластов на hemacytometer под микроскопом (x10). Держите протопласта на льду за 30 мин.
  8. Центрифуга для подвески на 100 x g для 1-2 мин при комнатной температуре и аккуратно удалить W5 решения с помощью пипетки 1 мл не нарушая протопластов Пелле. Ресуспензируйте протопластов в растворе ММГ (Таблица 1) в концентрации5 2 x 10 мл-1 при комнатной температуре.

4. протопластов преобразования

  1. Сделайте 100 мкл аликвоты протопласта (2 x 10-4 протопластов в 2 x 105 мл-1) в 1,5 мл низким сцеплением microcentrifuge труб с использованием режиссерский 200 мкл наконечники. Положите один Алиготе сторону в качестве отрицательного контроля. Добавьте 10 мкл плазмида (10-20 мкг) в каждую из остальных Алиготе протопласта.
  2. Медленно мкл 110 свежеприготовленного раствора ПЭГ (Таблица 1) на внутренней стене пробки microcentrifuge 1,5 мл и затем осторожно перевернуть и поверните трубку до тех пор, пока раствор не станет однородной.
  3. Инкубируйте преобразования смесь при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. Чтобы остановить преобразование, медленно добавить 400 мкл раствора W5 в 1,5 мл при комнатной температуре и осторожно перевернуть трубку до тех пор, пока раствор не станет однородной. Центрифуга для трубки на 100 г для 1-2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатанта, с помощью пипетки.
  5. Добавить 1 мл раствора WI (Таблица 1) на трубу и Ресуспензируйте, нежно закупорить 1 - 2 раза. Добавьте 1 мл 5% стерильный теленка (vol/vol) сыворотки в каждой скважине культуры ткани 6-ну плиты для покрытия поверхности и предотвратить протопласта от прилипания к пластине.
  6. После нескольких секунд отбросить телячьей сыворотки с помощью пипетки. Передача ресуспензированы протопластов в колодец плиты культуры. Крышка с крышкой.

5. протопластов инкубации и сбора урожая

  1. Инкубируйте протопласта при комнатной температуре в течение 1-2 дней в темноте.
    Примечание: Мы обнаружили, что двух дней инкубации дает сильный сигнал флуоресцентный белок, в целом по сравнению с одного дня инкубации, и что сигнал флуоресцентный белок может длиться до 3-4 дней.
  2. Передать решение протопластов пробки microcentrifuge низкая адгезия 1,5 мл. Центрифуга трубки на 100 x g для 1-2 мин при комнатной температуре урожай протопласта. Удалите с помощью пипетки супернатант и передачи 10 мкл протопласта на стеклянное скольжение.
  3. Соблюдайте флуоресцентного сигнала под флуоресценции или confocal микроскопии. Используйте-трансформированных протопласта как отрицательный контроль (сигнал не должны соблюдаться).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные органы 10 - дневных сои были протестированы для протопластов подготовка (Рисунок 1), и урожаи были замечены под микроскопом (рис. 2). Стены клетки от гипокотиля и сапрофиты вряд ли были переваривается, и некоторые клетки остался вложенных друг к другу (Рисунок 2B, 2 C). В Семядоля (Рисунок 2D) и корня (рисунок 2A) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот Протокол изоляции протопласта сои и применения переходных выражение исследования был тщательно протестирован и работает очень хорошо в нашей лаборатории. Процедуры являются простыми и легко и требуют обычного оборудования и минимальными затратами. Наш протокол дает большие количества протопласта единообразных, высокое качество по сравнению с ранее сообщалось методы34,35,36,,37

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана программа исследований генома растений от национального научного фонда (ННФ-PGRP-IOS-1339388).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Целлюлаза CELFWorthington Biological CorporationLS002611
пектолиаза Y-23BioWorld9033-35-6
ЦЕЛЛЮЛАЗА "ONOZUKA" R-10yakult10г
MACEROZYME R-10yakult10г
MannitolICN Биомедицинские152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTT Sigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100G
PEG4000Fluka81240
нейлоновая сеткакаролина652222N
Планшеты для культуры тканейСША ScientificCC7682-7506
Лезвия бритвыFisher12-640
гемацитометрhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA Набор для мини-подготовки к плазмидамOmegaD6942-01
GeneJET Набор для мини-подготовки к плазмидеThermo ScientificK0502
Центрифуга 5810eppendorf5811000827
Центрифуга 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Контроллер пипетокJencons14526-202
Zeiss 710 Конфокальный микроскопZeissN/A
Antistick, Микрофуги без РНКазы, 1,5 млAmbionAM12450
15 мл ЦентрифугаDenvilleC1018-P
50 мл ЦентрифугаDenvilleC1060-P
Сыворотка для новорожденных телятThermo Scientific16010159
почвыIngram's Nursery
PerliteVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Broth, Lennox (порошок)FisherBP1427-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
  4. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  5. Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
  6. Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
  7. Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
  8. Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
  9. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  10. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16(2009).
  11. Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
  12. Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
  13. Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
  14. Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  15. Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
  16. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
  17. Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
  18. Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
  19. Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
  20. Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
  21. Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
  22. Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
  23. Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
  24. Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14(2012).
  25. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).
  26. Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
  27. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
  28. Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
  29. Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19(2014).
  30. Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
  31. Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
  32. Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
  33. Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
  34. Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
  35. Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
  36. Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).
  37. Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
  38. Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).
  39. Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
  40. Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soybean ProtoplastsProtoplast IsolationPEG TransformationTransient Gene ExpressionEnzyme DigestionW5 SolutionConfocal MicroscopyHemocytometer CountingUnifoliate LeavesSoybean Seedlings

Related Articles